Cytotoxic activity of R-amphinase, an anti-tumor endoribonuclease, on diffuse large B-cell lymphoma cells in conditions

(1)

Artykuł oryginalny/Original research article

Wpływ cytotoksyczny R-amﬁnazy, endorybonukleazy o dzia łaniu

przeciwnowotworowym, na komórki ch łoniaka rozlanego z du żych komórek B w warunkach in vitro

Cytotoxic activity of R-amphinase, an anti-tumor

endoribonuclease, on diffuse large B-cell lymphoma cells in in vitro conditions

Ma łgorzata Zwoli ńska, Barbara Cebula-Obrzut, Magdalena Witkowska, Agata Majchrzak, Aleksandra M ędra, Piotr Smolewski *

Zakład Hematologii Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Kierownik: prof.dr hab. n. med. Piotr Smolewski,Łódź,Polska

informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:30.09.2013 Zaakceptowano:29.10.2013 Dostępneonline:06.11.2013

Słowakluczowe:

R-amﬁnaza

doksorubicyna

cytotoksyczność

apoptoza

DLBCL

Keywords:

R-amphinase

Doxorubicin

Apoptosis

Cytotoxicity

Antitumoractivity

DLBCLlymphoma

abstract

Onconase(ONC)andR-Amphinase(R-AM)areenzymeswithanti-tumoractivity,belon- ging to pancreaticribonuclease A family, received fromeggs collected fromfrog Rana pipiens.Bothproteinscaninducedeathofsometypesofneoplasticcellsbyinhibitionof proteinsynthesis,cellgrowthandproliferation.Theaimofthisstudywastoassessthe cytotoxicity ofR-AM, used alone or in combinationwith one ofthe mostactive anti- leukemicdrug,doxorubicin(DOX),ondiffuselargeB-celllymphoma(DLBCL)-derivedcell line,Toledo. We found high cytotoxicactivity ofR-AM against DLBCL cellsaswell as inﬂuenceonexpressionofseveralapoptosis-regulatingproteins.Moreover,weobserved increasein proapoptotic activity aftercombination ofR-AM andDOX, combinationof R-AMandDOX,comparedwithbothdrugsusedalone.Theseresultsmayjustifyfurther studiesoninteractionsofR-AMwithotherdrugsactiveinDLBCL.

*Adresdokorespondencji:ZakładHematologiiDoświadczalnej,UniwersytetuMedycznegowŁodzi,ul.Ciołkowskiego2,93-510Łódź, Polska.Tel.:+48426895191;fax:+48426895192.

Adresemail:piotr_smolewski@wp.pl(P.Smolewski).

ContentslistsavailableatScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journal homepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2013.10.001

(2)

Wstęp

Onkonaza (ONC) jestbiałkiem należącym dorodziny rybonukleaz trzustkowych otrzymanym po raz pierwszy z jaj i zarodków żaby Rana pipiens [1, 2]. Jej działanie biologiczne,aszczególnieprzeciwnowotworowe, jestściślezwiązane zaktywnościąenzymatycznącząsteczki.Odgrywaonaistotną rolęjakomediatorreakcjiwewnątrzkomórkowych,możetwo- rzyć aktywne biologicznie dimery, zdolne do degradacji dsRNA. Uszkodzenie RNA zapoczątkowuje łańcuch zmian molekularnychprowadzącychdośmiercikomórki.Kulmina- cją tych reakcji jest aktywacja kaskady enzymów proteoli- tycznych–kaspaz,prowadzącadoapoptozykomórkinowot- worowej[3].

ONC wywierawpływ naprzekazywanie wewnątrzkomór- kowych sygnałów regulujących wzrost i śmierć komórek nowotworowych. ONC wykazuje działanie proapoptotyczne, hamuje cykl komórkowy w fazie G1 [4] i wzrost komórek w przypadkunowotworów wykazujących wielolekową opor- ność,niezależnieodekspresjiglikoproteinyP(P-gp)imutacji p53. W odróżnieniu od prawidłowych komórek, które w fazie spoczynkowej cyklu komórkowego mogą pozosta- wać przez dowolnie długi czas, komórki nowotworowe pozostające w tej fazie szybko tracą swoją żywotność iulegająapoptozie.Udowodnionoaktywnośćcytotoksyczną ONC w różnych typach nowotworów, w tym międzybło- niaku (mesothelioma) oraz w opornych na chemioterapię nowotworach wieku dziecięcego, takich jak neuroblastoma irhabdomyosarcoma[5,6].

W ostatnich latach stwierdzono, że oocyty Rana pipiens zawierająjeszczejednąrybonukleazę,amﬁnazę(AMF)omoż- liwymdziałaniuprzeciwnowotworowym.AMFjestcząsteczką o masie około 13 000, występującą w czterech wariantach różniącychsięodsiebiesekwencjąaminokwasóww87–99%, wtymR-AM.AktywnośćcytostatycznaicytotoksycznaR-AM jestpodobna,anawetwyższaodtejwykazywanejprzezONC, cowzbudza nadzieje najejpotencjalne zastosowaniew kli- nicznejpraktyceonkologicznej[7–9].

Chłoniakrozlany zdużych komórekB (diffuselargeB-cell lymphoma; DLBCL) jest najczęściej występującym typem pośród chłoniaków nieziarniczych [10]. Postęp w leczeniu DLBCLpoczyniony w ostatnichlatach wiążesięz wprowa- dzeniemtzw.immunochemioterapii.Dołączeniedostandar- dowejchemioterapii CHOP (schemat:cyklofosfamid,doksorubicyna [DOX], winkrystyna, prednizon) monoklonalnego przeciwciałaanty-CD20rytuksymabu(RIT;schematR-CHOP) znacząco zwiększyło odsetek całkowitych remisji (complete remission; CR), wydłużyło całkowity czas przeżycia i czas wolny od nawrotu choroby, przy niezwiększonej istotnie toksycznościleczenia[11, 12]. Standardoweleczenie pierw- szejliniipolega napodaniu 6–8cykli R-CHOPwodstępach 21-dniowych[13].Pozwalaonowtejchorobie nauzyskanie do60%wyleczeń.Wciążpozostajewięcdużymarginescho- rych,uktórychpoprawaefektywnościleczeniapozwoliłaby napoprawęwieloletniegoprzeżycia.

Jakdotądopublikowanotylkojednodoniesienienatemat aktywności przeciwnowotworowej R-AM, które dotyczyło działanianakomórkiliniibiałaczkowychHL-60,U-937iJurkat T [14]. Celem niniejszej pracy była pierwsza w dostępnym

piśmiennictwie przedkliniczna analiza cytotoksyczności R-AM zastosowanej w warunkach in vitro w skojarzeniu zDOXnakomórkiliniiwywodzącejsięzDLBCL.

Materiał i metody

Materiał

Materiałem dobadańin vitrobyłaliniakomórkowa Toledo, będąca linią pochodzącą z komórek chłoniaka DLBCL, Toledo. Komórki tej linii są limfocytami B morfologicznie wykazującymi cechy limfoblastów, prezentującymi anty- geny:CD10+,CD19+,CD20+,CD38+,CD23-,CD39-,wykazują- cymi złożone aberracje chromosomowe. Komórki linii były inkubowane w odpowiednio dobranym medium (według zaleceńproducenta)wcieplarce(378C,wpowietrzuatmosfe- rycznym z zawartością 5% CO2), pasażowane co 2-3 dni w okresie przed założeniem hodowli z badanymi lekami, wceluosiągnieciawzrostuekspotencjalnego.

Hodowlekomórkowe

Hodowlezakładanow warunkachjałowych,przenoszącza- wiesinę komórek na płytki hodowlane (Nunc, Roskilde, Dania)zawierające48dołków1mllub donaczyneko40ml pojemności(Nunc,Roskilde,Dania).Wyjściowozagęszczenie komórek w zakładanych hodowlach wynosiło 0,5 mln/ml.

Dohodowlikomórekdodawanoodpowiednioprzygotowane medium RPMI-1640zdodatkiem62ml10%surowicybydlę- cej,3mlL-glutaminy,5mlantybiotyku(penicylinyistrepto- mycyny)(Sigma,Taufkirchen,Niemcy).

W zakładanych hodowlach do komórek linii Toledo dodawanopojedynczoR-AM(otrzymanądziękiuprzejmości Alphacell Corporation, New Jersey, USA, obecnie – TAmiR Biotechnology,Inc,Somerset,NJ,USA)pojedynczolubwpołą- czeniu z lekiem o udowodnionym działaniu w DLBCL – doksorubicyną(DOX;DoxorubicinEbewe;EbeweArzneimittel Ges.m.b.H.,Unterach,Austria).

Początkowo prowadzono hodowle24-, 48- i72-godzinne, poseriiwstępnychdoświadczeńdodalszychbadańwybrano 72-godzinny punkt czasowy. Badano cytotoksyczność R-AM dla stężeń 1,5,10, 20, 30, 40,50, 60, 70, 80,90 i100mg/ml.

WdalszychbadaniachR-AMużywanowoptymalnymstęże- niu 20mg/ml (najmniejsze stężenie leku wywołujące zna- miennystatystyczniewzrostcytotoksycznościwodniesieniu do hodowli bez dodatku leków). Dawkę 20 ng/ml DOX ustalono podobnie,kierując sięwcześniejszymidoświadcze- niami.OcenianoefektcytotoksycznyR-AM,DOXorazskoja- rzenia R-AM+DOX. Kontrolę stanowiły równoległe hodowle prowadzone bez dodatku leków. Każde doświadczenie było powtarzaneprzynajmniejpięciokrotnie.

Ocenacytotoksycznościbadanychleków

Barwienie jodkiem propydyny (JP) (Sigma-Aldrich; Saint Louis, USA) zostało zastosowane jako metoda pozwalająca na pomiar żywotności komórek. Po zakończeniu hodowli przeprowadzano dwukrotne płukanie w 1% PBS i przez 5minutwirowanozczęstością1100obrotównaminutę.Po

(3)

odwirowaniudokomórekdodawano100mlPBSoraz10mlJP, pozostawiając próbki w ciemności w temperaturze pokojowej na 10 minut. Po upływie tego czasu dokonywano pomiarów cytometrem przepływowym, określając procent komórekmartwych(JP+).

Ocenadziałaniaproapoptotycznegoleków

Pomiaruilościkomórekulegającychzaprogramowanejśmier- ci (apoptozie) dokonywano za pomocą testu z Aneksyną V(Ann-V).Badanotakżeprocentkomórekwykazującychspa- dek potencjału mitochondrialnego (CDm) oraz aktywację kaspaz-3,-8i-9.

TestzAnn-ViJP(BDBiosciences;SanJose,USA)pozwala na wykrycie zjawiska eksternalizacji fosfatydyloseryny, wczesnego markera apoptozy. Po zakończeniu hodowli do 100mlzawiesinykomórekdodawanoAnn-Vwilości5mloraz 85ml buforu. Po inkubacji w ciemności, w temperaturze pokojowej przez okres 15 minut dodawano 10ml JP, a następnie ponownie inkubowanow tych samych warun- kachprzez5minut.Poupływieczasuinkubacjidokonywano pomiarów w cytometrze przepływowym. Komórki Ann-V+

określanojakoapoptotyczne.

MitoTracker jest związkiem selektywnie wiążącym się zmitochondrium,któryulegadyfuzjiprzezbłonękomórkową ikumulujesięwaktywnychmitochondriach.Pozwalaonna ocenę różnicy potencjałów błonowych. Wykrycie spadku CDmświadczyoapoptoziekomórki,indukowanejdrogąwe- wnętrzną(mitochondrialną)aktywacjikaspaz.Celemdokona- nia tych pomiarów do zawiesiny komórek otrzymanej po zakończeniu hodowli (odpowiednio z lekami i bez leków) dodawanopo2,5mlodczynnikaM-Rosiinkubowanoprzez30 minut w cieplarce (378C). Po upływie tego czasudodawano MitoTracker Red 580 (odczynniki ﬁrmy Molecular Probes;

Eugene, USA) i odczytywano wyniki za pomocą cytometru przepływowego.

Celem oceny aktywnej kaspazy 3 zawiesinę komórek (100ml)otrzymanąpozakończeniuhodowlipermabilizowano iutrwalanowroztworzeCytoﬁx/Cytoperm(przez20minutna lodzie), dwukrotnie przemywano i wirowano w roztworze Perm/Wash(wszystkieodczynniki ﬁrmyBD Biosciences;San Jose, USA). Następnie dodawano 10ml przeciwciała przeciw aktywnejkaspazie3iinkubowanootrzymanyroztwórwtem- peraturze pokojowej przez30 minut.Po upływietegoczasu komórkiponownieprzemywanozapomocą roztworuPerm/

Wash. Otrzymany roztwór pozwalał na pomiar aktywnej kaspazy3zapomocącytometruprzepływowego.

Wceluocenyaktywnościkaspaz8i9otrzymanazawie- sina komórek była utrwalana i permabilizowana przez 20 minut na lodzie, w roztworze Cytoﬁx/Cytoperm, następnie przemywanaiwirowanadwarazywroztworzePerm/Wash.

Po zakończeniu tych czynności dodawano odpowiednie przeciwciałaprzeciw aktywnym kaspazom 8i 9(R&D Sys- tems; Minneapolis, USA) i inkubowano przed odczytem przez30minut,wtemperaturzepokojowej.

Ocenamechanizmówregulującychapoptozę

W regulację procesu apoptozy są zaangażowane białka promującetenproces,jakijejinhibitory.Wkomórkach,po

zakończeniuhodowlizbadanymilekami,wykonanopomiar ekspresji białek indukujących zaprogramowaną śmierć komórki: Bax, Bak, Bad, Smac/Diablo. Równolegle oceniono ekspresjębiałekantyapoptotycznych:Bcl-2,Mcl-1,XIAP,sur- wiwiny,c-IAP1,c-IAP2.Pozakończeniuhodowli(zbadanymi lekami i kontroli bez dodatku leków), zawiesinę komórek wirowano przez 5 minut z częstością obrotów 1100 na minutę,następniepłukanow2mlPBSiponowniewirowano 5 minut, 1100 obrotów na minutę. Otrzymany materiał utrwalano najpierw w 4,5ml 80% alkoholu (30 minut w lodówce), następnie po ponownym przepłukaniu w PBS i dwukrotnym odwirowaniu (5 minut 1100 obrotów/min.) dodawano4,5ml1%formaldehyduwtemperaturze08Cna15 minut.Poupływietegoczasubadanymateriałbyłpowtórnie płukany w PBS oraz wirowany, a następnie dodawano na 1 minutę500mlsaponinyi porazkolejny wirowanow PBS 1100obrotównaminutęprzez5minut.Otrzymanazawiesina komórek była znakowana przeciwciałami monoklonalnymi przeciwbiałkom:przeciwciałemanty-Bax(DAKOCytomation;

Glostrup,Dania);przeciwciałemanty-Bak(Abcam;Cambridge, WielkaBrytania);przeciwciałemanty-Bad(Abcam;Cambridge, Wielka Brytania); przeciwciałem anty-Bcl-2 (DAKO Cytoma- tion; Glostrup, Dania); przeciwciałem anty- Mcl-1 (Abcam;

Cambridge, Wielka Brytania); przeciwciałemanty-XIAP (R&D Systems; Minneapolis, USA); przeciwciałem anty-cIAP1 (R&DSystems;Minneapolis,USA);przeciwciałemanty-cIAP2 (R&D Systems;Minneapolis,USA);przeciwciałemanty-Smac/

Diablo(R&DSystems;Minneapolis,USA);przeciwciałemanty- survivin (R&DSystems; Minneapolis,USA). Po30-minutowej (wciemności,wtemperaturzepokojowej)inkubacjizprzeciw- ciałamipierwszorzędowymidodawano domateriału komór- kowego przeciwciała drugorzędowe związane z ﬂuoresceiną.

Po zakończeniu inkubacji dokonywano pomiaru ekspresji białekzapomocącytometruprzepływowego.Ekspresjębiałka oceniano na podstawie średniej intensywnościﬂuorescencji (MFI;meanﬂuorescenceintensity).

Analizacytometryczna

Badaniawykonywanozwykorzystaniemcytometruprzepły- wowegoFACSCalibur(BectonDickinson,SanDiego,Califor- nia,USA).W każdej analizowanejpróbcemierzonoﬂuores- cencję 10 000 komórek. Indeks cytotoksyczności (IC) oceniano na podstawie odsetka komórek JP+ w badanych hodowlachz lekamiikontrolnych.Skompensowanyindeks cytotoksyczności (SIC), będący różnicą między odsetkiem komórek JP+ w poszczególnych hodowlach z badanymi lekamia odsetkiemkomórekJP+w kontrolach, posłużył do ocenystopniacytotoksycznościdodanychdohodowlileków.

Nasilenieapoptozyocenianonapodstawieodsetkakomórek wykazujących aktywację kaspazy 3 w poszczególnych hodowlach(indeksapoptotyczny,IA).Obliczanoskompenso- wanyIA(SIA),będącyróżnicąpomiędzyodsetkiemkomórek Ann-V+ w poszczególnych hodowlach z badanymi lekami aodsetkiemkomórekAnn-V+wpróbkachkontrolnych.

Analizastatystycznawyników

Analizując uzyskane wyniki, w celu porównania różnic pomiędzyposzczególnymibadanymiparametramistosowano

(4)

testt-Studenta.Określanośredniąarytmetycznąorazodchy- lenia standardowe. Za istotne statystycznie przyjmowano różnice,dlaktórychpoziomistotnościpbyłmniejszyniż0,05.

ProgramSTATISTICA7.0(Tulsa,USA)posłużyłdoprzeprowa- dzeniaanalizystatystycznejotrzymanychwyników.

Wyniki

OcenacytotoksycznościR-AM

Prowadzone doświadczenia rozpoczęto od ustalenia opty- malnejdawkiR-AM.HodowleinvitrozR-AMwdawkach1–

100mg/ml, trwające 24, 48 i 72 godziny, pozwoliły na wybranie dawki stosowanej w dalszej części badań. Naj- większyefektcytotoksyczny byłobserwowanypo72godzi- nachhodowli. Dlakomóreklinii Toledoprzystężeniu leku 20mg/ml po 72 godzinach hodowli obserwowany odsetek komórek z dodatnim efektem cytotoksycznym był statystycznie znamiennie wyższyw porównaniu z osiągniętym w komórkach prowadzonych równolegle hodowli kontrol- nych(p<0,05).DlategostężenieR-AM20mg/mlorazpowyż- szy punkt czasowy wybrano dla hodowli prowadzonych wdalszymetapiebadań.

OcenaaktywnościR-AMwskojarzeniuzDOX

Dalsze doświadczenia prowadzone w hodowlach komórek linii Toledo miały na celu ocenę cytotoksyczności R-AM skojarzonejzklasycznym cytostatykiem,stosowanymstan- dardowow badanejchorobie,DOX.PołączenieR-AM zDOX wykazywałoznaczącywzrostcytotoksyczności(medianaSIC 70,5%), w porównaniu z zastosowanymi pojedynczo R-AM czy DOX (mediana SIC odpowiednio 16,1% i 37,3%; odpowiednio p<0,001 ip=0,003).Wykazano znamienniewięk- sze działanie cytotoksyczne R-AM na komórki linii Toledo w porównaniu z kontrolą (Ryc. 1 A). Efekt cytotoksyczny R-AM (mediana SIA 68,5%), DOX (mediana SIA 36,2%)oraz jej skojarzenia z DOX ewidentnie zależał od działania proapoptotycznego(medianaSIA65,9%),(Ryc.1B).

MechanizmycytotoksycznegodziałaniaR-AM

Działanie proapoptotyczne R-AM oceniano na podstawie wywoływanychzmian wmitochondrialnym potencjalebło- nowym, zmian w strukturze błony komórkowej – test z Ann-V oraz wpływu na aktywność kaspaz (wykrywanie komórek z aktywną kaspazą 8, 9 czy 3). Linia komórkowa chłoniaka DLBCL, przymedianie odsetkakomórek Ann-V+

wynoszącej 17,0%, wykazywała istotny wzrost mechaniz- mów aktywujących apoptozę, mierzonych spadkiem CDm orazwzrostemaktywnościkaspaz8,9i3(Ryc.2).

WpływR-AMnaekspresjębiałekregulującychapoptozę

W dalszych doświadczeniach badano wpływR-AM na eks- presjębiałekuczestniczącychw regulacjiprocesuapoptozy.

R-AMwewszystkichhodowlachistotniezwiększałastężenie białka proapoptotycznego Bax (p=0,041) i Bad (p=0,013).

Obserwowano również istotne statystycznie zmniejszenie

ekspresji białek antyapoptotycznych Bcl-2 (p=0,009), Mcl-1 (p=0,002)iXIAP(p=0,019)(Ryc.3).

Omówienie

R-AMjestendorybonukleazą,któramożeokazaćsięskutecz- na w leczeniu chorób onkologicznych, w tym nowotworów układu krwiotwórczego. Przedstawione powyżej badania

Ryc.1–A.CytotoksycznośćR-amfinazy(R-AM) zastosowanejpojedynczoorazwskojarzeniu

zdoksorubicyną(DOX)wstosunkudokomórekchłoniaka rozlanegozdużychkomórekB,Toledo.Podanowartości średnieiodchyleniastandardoweskorygowanegoindeksu cytotoksycznego(SIC),mierzonegotestemzjodkiem propydyny(JP)

Ryc.1–B.DziałanieproapoptotyczneR-amfinazy(R-AM) zastosowanejpojedynczoorazwskojarzeniu

zdoksorubicynąwstosunkudokomórekliniichłoniaka rozlanegozdużychkomórekB,Toledo.Podanowartości średnieiodchyleniastandardoweskorygowanegoindeksu apoptotycznego(SIA),mierzonegotestemzAneksyną V(Ann-V)

Fig.1–A.CytotoxicactivityofR-amphinase(R-AM)usedalone orincombinationwithdoxorubicin(DOX)ondiffuselarge B-celllymphoma-derivedcellline,Toledo.Thefigureshows meanvalues(andstandarddeviations)ofcorrectedcytotoxic index(SIC),assessedbypropydiumiodidetest

Fig.1–B.ProapoptoticactivityofR-amphinase(R-AM) usedaloneorincombinationwithdoxorubicin(DOX)on diffuselargeB-celllymphoma-derivedcellline,Toledo.

Thefigureshowsmeanvalues(andstandarddeviations) ofcorrectedapoptoticindex(SIA),assessedbyAnnexin Vtest

(5)

własne przeprowadzone invitro nalinii komórkowejDLBCL wykazały wysoką aktywność cytotoksyczną R-AM, zarówno zastosowanej pojedynczo,jaki wpołączeniuz DOX, lekiem cytostatycznymoudowodnionymdziałaniuwtejchorobie.

Wynikiwskazujące na synergizm działaniaONC, wcześ- niejopisanejendorybonukleazypochodzącejzjajizarodków Rana pipiens, z innymi lekami o działaniu cytostatycznym znajdująpotwierdzenie w dostępnych publikacjach. Dotych- czasudowodnionokorzystnewspółdziałanieONCzwieloma lekami przeciwnowotworowymi. Między innymi, wykazano wzrostskutecznościdziałaniaONC skojarzonej zcisplatyną, DOX,winkrystyną,tamoksyfenemitriﬂuoperazyną,interfero- nem a/b, TNF-a czy przeciwciałem anty-CD95 (FasL)[6, 18– 23].Wykazanotakże, żeONCzwiększa wrażliwośćkomórek śródbłonkaCCL-209orazkomóreknowotworowychnanapro- mienianie [24–26]. Uważa się, że ONC może spełniać rolę adiuwantuwprzypadkuchemioterapiiorazradioterapii.

Badania Deptały i wsp. [18] miały na celu porównanie proliferacjiiżywotnościkomórekchłoniakaU937inkubowa- nych z ONC lub TNF-a.Połączenie ONCi TNF-a spowodo- wało całkowite zahamowanie wzrostu i śmierć ponad połowy komórek.Mechanizm,dzięki któremuONCwzmac- nia działanie TNF-a, jest być może zależny odaktywności czynnika NFkB i związanej z nią supresji ekspresji genów odpowiedzialnychzaprzeżyciekomórki.

Leeiwsp.[27]wbadaniachinvivoiinvitronahodowlach ludzkiegorakaniedrobnokomórkowegopłucA549sprawdzali efektywność terapeutyczną ONC podanej samodzielnie lub w skojarzeniu z cisplatyną lub karboplatyną. Stwierdzono synergizmdziałanialeków podanych równocześnie iwzrost

efektywnościcisplatynyorazkarboplatyny.Skojarzenieobyd- wulekówopóźniałowzrostguzao25dni.

Badania przeprowadzone przez Rybak i wsp. [22] na modelach in vitro i in vivo komórek raka okrężnicy HT-29 potwierdziły synergistyczny efekt działania przeciwnowo- tworowegoONCiwinkrystynynakomórkiwykazująceopor- nośćwielolekową.Wykazanozahamowaniewzrostukomórek oraz zwiększenie cytotoksyczności. Mechanizm, dzięki któ- remuONCpokonujeopornośćkomóreknaleczenieprzeciw- nowotworowe, nie został w pełni poznany. Leczenie to ponadtozwiększałoistotnieczasprzeżycia.

DoświadczeniaMikulskiegoiwsp.[19]zostałyprzeprowa- dzone na dwóch modelach badawczych in vivo raka piersi MDA-MB-231iwykazałysynergizmdziałaniaONCidoksoru- bicyny.Chemioterapiaskojarzonawobumodelachhamowa- ła wzrostnowotworuw znaczniewiększymstopniuniżleki podawaneosobno,aczasprzeżyciawydłużyłsięznacząco.

Wynikidotychczasowychbadańprzedklinicznychiklinicz- nych(zakończonobadanieIIIfazy uchorychnamiędzybło- niaka) wskazują na dużą aktywność cytotoksyczną ONC wniektórychnowotworachlitych.Jakwspomniano,AMFjest stosunkowoniedawnozsyntetyzowanąrybonukleazą,owła- ściwościach ﬁzykochemicznych podobnych do ONC. Jak dotąd, Ardelt i wsp. [14] opisali aktywność cytostatyczną i cytotoksyczną wszystkich czterechznanych izoform AMF, w tym R-AM, w stosunku do komórek ludzkiej białaczki promielocytowej(HL-60),jak teżkomórekbiałaczki monocy- tarnejU-937ikomórekJurkatT.AktywnośćR-AMbyłanieco bardziej zaznaczona niż w przypadku ONC. Dotyczyło to zarówno zatrzymania komórek nowotworowychw fazie G1

cyklu komórkowego, jak i indukcji apoptozy przejawiającej sięwe fragmentacji DNA(obecność frakcjisub-G1, dodatnia reakcjaTUNEL)orazaktywacjątransglutaminazy.

Ryc.3–Ekspresjabiałekregulującychapoptozę wodpowiedzinadziałanieR-amfinazy(R-AM)

wkomórkachliniichłoniakarozlanegozdużychkomórek BToledo,mierzonawartościamiśredniejintensywności fluorescencji(meanfluorescenceintensity;MFI).Podano wartościwzrostu/spadkuekspresjibiałekwhodowlach zlekiemwstosunkudohodowlikontrolnych

Fig.3–Expressionofapoptosis-regulatingproteinsinresponse toR-amphinase(R-AM)indiffuselargeB-celllymphoma- derivedcellline,Toledo,asmeasuredbymeanfluorescence intensity,MFI.N-foldincrease/decreaseinproteinexpression inrelationtothecontrolculturesareshown

Ryc.2–Mechanizmydziałaniaproapoptotycznego R-amfinazy(R-AM)nakomórkiliniichłoniakarozlanego zdużychkomórekB,Toledo.Podanowartościśrednie iodchyleniastandardoweodsetkakomórekdodatnich mierzonegotestemzAneksynąV,komórekzespadkiem potencjałumitochondrialnego(CDm)orazwykazujących aktywacjękaspaz3,8i9

Fig.2–MechanismsofproapoptoticactivityofR-amphinase (R-AM)ondiffuselargeB-celllymphoma-derivedcellline, Toledo.Thefigureshowsmeanvalues(andstandard deviations)oftheratesofAnnexinV-positivecells,cellswith dropofmitochondrialpoptentialaswellascellswithactivation ofcapses-3,-8or-9

(6)

Dotychczasnieprowadzonodoświadczeńz R-AMinvitro nakomórkachchłoniakaDLBCL.Ponadto,dokładnymecha- nizm działania przeciwnowotworowego tego białka nie zo- stał do tej pory w pełni ustalony. Obserwowane działanie biologiczne jest spowodowane aktywnością enzymatyczną jej cząsteczki. Znaczący wpływ na prezentowaną przeznie cytotoksyczność może mieć brak wrażliwości na działanie inhibitorarybonukleaz[8].

Udowodniono,żeONC wywołujeśmierćkomórki,rozkła- dając wewnątrzkomórkowe RNA, hamując syntezę białek ihamującwzrostorazproliferacjękomórki[9].Wcześniejsze doświadczeniawykazałyjejzdolnośćdowywoływaniaapop- tozyniektórychkomóreknowotworowychuczłowieka[4;14].

Podobnie R-AM wykazała aktywność przeciwnowotworową przeciwkomórkom ostrej białaczki szpikowej [28]. W ostatnich badaniach własnych udowodniono, że mechanizmy cytotoksycznegodziałaniaR-AMnakomórkiDLBCLpolegają głównie naindukowaniuzaprogramowanejśmiercikomórki poprzezwpływnaaktywnośćkaspaz,zeksternalizacjąfosfa- tydyloserynybłonykomórkowejwteściezAnn-Vorazspad- kiem potencjału mitochondrialnego w teście z MitoTracker Red. Po 72 godzinach hodowli z R-AM wykazano istotne zwiększenie aktywności kaspaz 3, 8 i 9, a więc indukcję obydwu drógich aktywacji zewnętrznej (receptorowej) oraz wewnętrznej(mitochondrialnej).Możetowpływaćkorzystnie napotencjalneinterakcjezinnymilekamiprzeciwnowotwo- rowymi, które mają podobne lub uzupełniające się mecha- nizmydziałaniacytotoksycznego.

Dalszewynikibieżącychbadańwłasnych,dotyczącedzia- łania proapoptotycznego, wykazały w badanych hodowlach istotnywzroststężeniaproapoptotycznegobiałkaBax iBad.

Stwierdzonorównież istotneobniżeniestężeniabiałekanty- apoptotycznychBcl-2,Mcl-1iXIAP.Obserwacjeteczęściowo potwierdzajądoniesienianatematONC,wktórychobserwo- wanowzrost stężeniabiałka Bax wkomórkach nowotworowych[15].PodajesiętakżespadekekspresjibiałkaBcl-2,Fra1 isurwiwiny[15,16]. Niemadotychczasbadańdonoszących ozmianachaktywnościbiałekregulującychapoptozęinduko- wanądziałaniemR-AM.

OcenaskojarzonegodziałaniaR-AMiDOX

Przedstawione badania kompleksowo oceniały aktywność przeciwnowotworową R-AM skojarzonej ze standardowym cytostatykiem o działaniu biologicznym charakteryzującym się potwierdzoną już aktywnością przeciwnowotworową – DOX. Różne mechanizmy działania tych leków, nakładając sięnasiebie,mogłybyspowodowaćzwiększenieichaktyw- ności cytotoksycznejw odniesieniu do badanych komórek.

Uszkodzenie DNA komórki nowotworowej jest głównym mechanizmem działania związków rutynowo stosowanych w onkohematologii.Niestety obserwowanacytotoksyczność tychlekówwpływatakżenaaktywnieproliferujące zdrowe komórki, co wywołuje szereg objawów niepożądanych.

Cytotoksyczność antybiotyków antracyklinowych, do któ- rychnależy DOX,związanajestzichhamującym wpływem na replikację, transkrypcję i naprawę DNA oraz indukcję apoptozy [17]. Przeprowadzone badania własne wykazały zwiększenie efektu cytotoksycznego i dużą skuteczność działania R-AM w skojarzeniu z DOX. W hodowlach linii

komórkowejToledozaobserwowanoistotnenasileniedziała- nia cytotoksycznego połączeniaR-AM z DOXw porównaniu z działaniemtychleków stosowanychw monoterapii.Bada- nia te są, jak dotąd, jedynymi dostępnymi publikacjami oceniającymiwspółdziałanieR-AMiDOX.

Coistotne,wnaszychbadaniachR-AMwykazywałacyto- toksyczność w stosunku do komórek nowotworowych, bez istotnego wpływu nazdrowe limfocyty oddawców honoro- wychwhodowlach72-godzinnych.Wykazanaspecyﬁkadzia- łanialekumożewynikaćmiędzyinnymiz faktu,żerybonu- kleazyobudowiezbliżonejdoONCwykazująwiększepowi- nowactwo do komórek nowotworowych niż do komórek prawidłowych.Możetowynikaćzróżnicwbudowiesialogli- kopeptydów błony komórkowej [29, 30–32] lub zwiększonej przepuszczalności błony komórkowej komórek nowotworo- wychdlamakrocząsteczek,takichjakrybonukleazy[33,34].

Podsumowując, w warunkach in vitro R-AM wykazuje wybiórcząaktywnośćcytotoksycznąwstosunkudokomórek liniichłoniakaDLBCL.SkojarzenieR-AMzDOXwwarunkach hodowli in vitro komórek linii chłoniaka DLBCL istotnie zwiększa efekt cytotoksyczny w porównaniu ze standardo- wymchemioterapeutykiem.Wdziałaniuprzeciwnowotworo- wymR-AMistotnymmechanizmemjestaktywacjakaspazo- zależnej apoptozy. Wpływ na ekspresję białek biorących udziałwregulacjiprocesuapoptozywidoczniejestpowiązany z pobudzeniem mitochondrialnegoszlaku aktywacji kaspaz.

Stanowitoprzesłankędokojarzeniaendorybonukleazodzia- łaniuprzeciwnowotworowym,wtymR-AM,zdziałającymiza pośrednictwemtegomechanizmustandardowymichemiote- rapeutykami.

Wkład autorów/Authors' contributions

PS – koncepcja pracy, analiza statystyczna, interpretacja danych, przygotowaniepracy, pozyskanieśrodków (ﬁnanso- wania).MZ–zebranie iinterpretacjadanych,analizastatys- tyczna, przygotowaniepracy, przygotowanieliteratury.BC-O – zebranie i interpretacja danych. AgM, AlM – zebranie danych,MW–przygotowaniepracy,przygotowanieliteratury.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

BadaniabyłysponsorowaneprzezgrantzMinisterstwaNauki iSzkolnictwaWyższegoNo507-18-010oraz,częściowo,przez grant Uniwersytetu Medycznego w Łodzi No 503/8-093-01/

503-01.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

(7)

pi smiennictwo/references

[1] ArdeltW,MikulskiSM,ShogenK.Aminoacidsequenceof ananti-tumorproteinfromRanapipiensoocytesandearly embryos.Homologytopancreaticribonucleases.JBiol Chem1991;266:245–251.

[2] MosimannSC,JohnsKL,ArdeltW,MikulskiSM,ShogenK, JamesMNG.Comparativemolecularmodelingand crystallizationofP-30protein:anovelanti-tumorproteinof Ranapipiensoocytesandearlyembryos.ProteinsStructure FunctionandGenetics1992;14:392–400.

[3] GrabarekJ,ArdeltB,DuL,DarzynkiewiczZ.Activationof caspaseandserineproteasesduringapoptosisinducedby onconase(ranpirnase).ExpCellRes2002;278:61–71.

[4] HalickaHD,JuanG,ArdeltB,MittelmanA,ArdeltW, MikulskiSM,etal.Inductionofdifferentiationand apoptosisofU937andHL-60cellsbyonconase:potentiation byinhibitorsofproteinkinases.ASCOProceedings (Abstract18)1996.

[5] MichaelisM,CinatlJ,AnandP,RothweilerF,KotchetkovR, vonDeimlingA,etal.Onconaseinducescaspase- independentcelldeathinchemoresistantneuroblastoma cells.CancerLett2007;250:107–116.

[6] ZhaoH,ArdeltB,ArdeltW,ShogenK,DarzynkiewiczZ.The cytotoxicribonucleaseonconasetargetsRNAinterference (siRNA).CellCycle2008;7:3258–3261.

[7] SinghUP,ArdeltW,SaxenaSK,HollowayDE,VidunasE,Lee HS,etal.Enzymaticandstructuralcharacterisationof amphinase,anovelcytotoxicribonucleasefromRana pipiensoocytes.JMolBiol2007;371:93–111.

[8] ArdeltW,ArdeltB,DarzynkiewiczZ.Ribonucleasesas potentialmodalitiesinanticancertherapy.EurJPharmacol 2009;625:181–189.

[9] ArdeltW,ShogenK,DarzynkiewiczZ.Onconaseand amphinase,theantitumorribonucleasesfromRanapipiens oocytes.CurrPharmBiotechnol2008;9:215–225.

[10] GrifﬁthsR,GleesonM,KnopfK,DaneseM.Racial

differencesintreatmentandsurvivalinolderpatientswith diffuselargeB-celllymphoma(DLBCL).BMCCancer 2010;10:625.

[11] CoifﬁerB,LepageE,BriereJ,HerbrechtR,TillyH, BouabdallahR,etal.CHOPchemotherapyplusrituximab comparedwithCHOPaloneinelderlypatientswithdiffuse large-B-celllymphoma.NEnglJMed2002;346:235–242.

[12] PfreundschuhM,TrümperL,OsterborgA,PettengellR, TrnenyM,ImrieK,etal.CHOP-likechemotherapyplus rituximabversusCHOP-likechemotherapyaloneinyoung patientswithgood-prognosisdiffuselargeB-cell

lymphoma:arandomisedcontrolledtrialbytheMabThera InternationalTrial(MInT)Group.LancetOncol2006;7:

379–391.

[13] SmolewskiP.Standardyleczeniachłoniaków nieziarniczychBkomórkowych.ActaHaematologica Polonica2010;41:325–334.

[14] ArdeltB,ArdeltW,PozarowskiP,KunickiJ,ShogenK, DarzynkiewiczZ.Cytostaticandcytotoxicpropertiesof amphinase:anovelcytotoxicribonucleasefromRana pipiensoocytes.CellCycle2007;6:3097–3102.

[15] ArdeltB,JuanG,BurfeindP,SalomonT,WuJM,HsiehTC, etal.Onconase,ananti-tumorribonucleasesuppresses intracellularoxidativestress.IntJOncol2007;31:663–669.

[16] Ramos-NinoME,LittenbergB.Anovelcombination:

ranpirnaseandrosiglitazoneinduceasynergisticapoptotic effectbydown-regulatingFra-1andSurvivinincancer cells.MolCancerTher2008;7:1871–1879.

[17] CzyżM,SzuławskaA.Molekularnemechanizmydziałania antracyklin.PostepyHigMedDosw(online)2006;60:78–100.

[18] DeptalaA,HalickaH,ArdeltB,ArdeltW,MikulskiS,Shogen K,etal.Potentiationoftumornecrosisfactorinduced apoptosisbyonconase.IntJOncol1998;13:11–16.

[19] MikulskiS,NewtonD,WiltroutR,RybakS.Onconaseand doxorubicinsynergyinprolongingsurvivalofMDA-MB-231 humanbreastcancerbearingnudemice.Presentedatthe AnnualAmericanAssociationforCancerResearch1999.

[20] MikulskiSM,VieraA,ArdeltW,MendukeH,ShogenK.

Tamoxifentriﬂuoroperazine(stelazine)potentiate cytostatic/cytotoxiceffectsofP-30protein,anovelprotein possessinganti-tumoractivity.CellTissueKinet

1990;23:237–246.

[21] MikulskiSM,VieraA,ShogenK.Invitrosynergismbetween anovelamphibianoocyticribonuclease(onconase)and tamoxifen,lovastatinandcisplatininhumanOVCAR-3 ovariancarcinomacellline.IntJOncol1992;1:779–785.

[22] RybakSM,PearsonJW,FoglerWE,VolkerK,SpenceSE, NewtonDL,etal.Enhancementofvincristinecytotoxicity indrugresistantcellsbysimultaneoustreatmentwith onconase,anantitumorribonuclease.JNCI1996;88:

747–753.

[23] VasandaniVM,CastelliJC,HottJS,SaxenaS,MikulskiSM, YouleRJ.Interferonenhancestheactivityoftheanticancer ribonuclease,onconase.JInterferonCytokineRes

1999;19:447–454.

[24] LeeI,KimDH,SunarU,MagnitskyS,ShogenK.The therapeuticmechanismsofranpirnase-induced

enhancementofradiationresponseonA549humanlung cancer.InVivo2007;21:721–728.

[25] LeeI,LeeYH,MikulskiSM,LeeJ,ShogenK.Enhanced cellularradiationsensitivityofandrogen-independent humanprostatetumorcellsbyonconase.AnticancerRes 2000;20:1037–1040.

[26] LeeI,ShuiC,ShogenK,MikulskiSM,NunnoM,WallnerPE.

Changesinradiationresponseandphysiological parametersinvarioustumorsbyonconase.TheAnnual MeetingofRadiationResearchSocietyProceedings(Poster NoP06-95)1996.

[27] LeeI,KimD,KimE,ShogenK,GlicksonJ.Physiological mechanismsoftheenhancedefﬁcacyofcisplatinand carboplatinbyonconase.PresentedattheAnnual AmericanAssociationforCancerResearch(Abstract4951) ProcAACR2005.

[28] SmolewskiP,CebulaB,ZwolinskaM,Linke-SzewczykA, WozniakD,ShogenK,etal.Exvivocytotoxicactivityof endoribonucleases,onconase(ranpirnase)andR- Amphinase,againstacutemyeloblasticleukemiacells.

Blood(ASHAnnualMeetingAbstracts)2008;112:4010.

[29] NittaK,OzakiK,IshikawaM,FurusawaS,HosonoM, KawauchiH,etal.InhibitionofcellproliferationbyRana catesbeianaandRanajaponicalectinsbelongingtothe ribonucleasesuperfamily.CancerRes1994;54:920–927.

[30] NittaK,OzakiK,TsukamotoY,FurusawaS,OhkuboY, TakimotoH,etal.CharacterizationofaRanacatesbeiana lectinmutant.CancerRes1994;54:928–934.

[31] ChaoTY,LavisLD,RainesRT.Cellularuptakeof ribonucleaseAreliesonanionicglycans.Biochemistry 2010;49:10666–10673.

[32] ZhaoHL,XueC,DuJL,RenM,XiaS,ChengYG,etal.

Sustainedandcancercelltargetedcytosolicdeliveryof Onconaseresultsinpotentantitumoreffects.JControl Release2012;159:346–352.

[33] EastyDM,LedouxL,AmbroseEJ.Theactionofribonuclease onneoplasticgrowth.IIIStudiesbyinterference

microscopyBiochimBiophysActa1956;20:528–537.

[34] SundlassNK,EllerCH,CuiQ,RainesRT.Contributionof electrostaticstothebindingofpancreatic-type

ribonucleasestomembranes.Biochemistry2013;52:

6304–6312.