Proapoptotic genes in cancer gene therapy

(1)

WPROWADZENIE

Celem niniejszej pracy jest przedyskutowa- nie mo¿liwoœci zastosowania genów proapoptotycznych w terapii genowej nowotworów.

U organizmów wielokomórkowych apoptoza jest podstawowym procesem, w którym eliminowane s¹ uszkodzone komórki, niezdolne do naprawienia ró¿nego rodzaju de- fektów (mutacji DNA, wadliwej proliferacji, itp.) [1, 2]. W chorobach nowotworowych mechanizm ten jest zaburzony. W komórkach nowotworowych powstaje tzw. fenotyp opor- ny na apoptozê. Innymi s³owy, staj¹ siê one oporne na wiêkszoœæ sygna³ów indukuj¹cych apoptozê [3, 4]. Pojawia siê w nich coraz wiêcej nieskorygowanych b³êdów zwi¹zanych z replikacj¹, cyklem komórkowym, adhezj¹ itd. Komórki nowotworowe staj¹ siê niewra¿- liwe na wiêkszoœæ leków przeciwnowotworowych. Zmniejszeniu zdolnoœci do indukcji apoptozy towarzyszy coraz wiêksza autono- mizacja komórek nowotworowych [5].

W leczeniu nowotworów do zniszczenia nieprawid³owych komórek, które uniknê³y œmierci apoptotycznej, stosuje siê ró¿norod- ne podejœcia terapeutyczne. Podstawowy problem stanowi zniszczenie wszystkich ko- mórek nowotworowych w organizmie chore- go, zarówno komórek guzów pierwotnych, jak i kr¹¿¹cych w krwiobiegu komórek prze- rzutuj¹cych. Chirurgia i radioterapia wyko- rzystywane s¹ do eliminowania komórek gu- zów rosn¹cych miejscowo. Przerzuty maj¹ byæ niszczone za pomoc¹ chemioterapii.

Chemioterapeutyki niszcz¹ jednak nie tylko komórki nowotworowe, ale tak¿e komórki prawid³owych tkanek. Celowe jest wiêc opracowanie nowej strategii terapeutycznej, umo¿liwiaj¹cej zniszczenie wszystkich ko- mórek nowotworowych w sposób selektyw- ny, bez uszkadzania prawid³owych tkanek.

Mechanizm dzia³ania wiêkszoœci leków przeciwnowotworowych i promieni jonizuj¹- cych polega przede wszystkim na indukowaniu w komórkach nowotworowych apoptozy.

Jedn¹ z takich strategii kierowania komórek na drogê apoptozy jest terapia genowa, wykorzystuj¹ca tzw. geny proapoptotyczne. Jest

to przyk³ad bezpoœredniego niszczenia ko- mórek nowotworowych w terapii genowej.

MECHANIZM APOPTOZY

Apoptoza – programowana œmieræ komór- ki – jest procesem, w którym eliminowane s¹ zarówno komórki uszkodzone, niezdolne do naprawienia ró¿nego rodzaju defektów, jak i powstaj¹ce podczas rozwoju lub mor- fogenezy zbêdne komórki prawid³owe.

Apoptoza mo¿e byæ wyindukowana w ko- mórkach za poœrednictwem wielu ró¿nych sygna³ów, w tym m.in. za pomoc¹ tzw. sygna-

³ów œmierci pochodz¹cych z innych komó- rek, w wyniku zahamowania dop³ywu czynników wzrostu (tzw. sygna³ów prze¿ycia), b¹dŸ poprzez ró¿nego rodzaju stres œrodo- wiskowy, np. promieniowanie jonizuj¹ce, stres termiczny, stres oksydacyjny wywo³ywany przez reaktywne formy tlenu itp. [1, 2, 5, 6].

Apoptoza przebiega najczêœciej w tzw.

szlaku p53 lub szlaku receptorów sygna³ów œmierci (ryc. 1.). W apoptozie przebiegaj¹cej w szlaku p53 kluczow¹ rolê odgrywaj¹ mitochondria [7]. Na terenie mitochondriów m.in.

dochodzi do uwalniania aktywatorów kaspaz (np. cytochromu c), zachodz¹ zmiany w trans- porcie elektronów, dochodzi do spadku poten- cja³u transb³onowego [8]. W przypadku apoptozy indukowanej aktywacj¹ receptorów sygna-

³ów œmierci mitochondria mog¹ wzmacniaæ (amplifikowaæ) zbyt s³aby sygna³, choæ ich udzia³ w tym procesie nie jest konieczny [9].

Szlak zale¿ny od P53 przebiega z udzia-

³em bia³ka P53 i wielu bia³ek moduluj¹cych jego aktywnoœæ. Bia³ko P53 ulega fosforylacji i acetylacji, co powoduje jego zmiany kon- formacyjne. Bia³ko zmienia wtedy swoje po- winowactwo do ró¿nych promotorów i aktywuje ekspresjê ró¿nych genów koduj¹cych bia³ka, bior¹ce udzia³ w odpowiedzi komórek na stres. Jednym z bia³ek bior¹cych udzia³ w apoptozie zale¿nej od P53 jest proapoptotyczne bia³ko Bax, które ma zdolnoœæ otwierania kana³ów w b³onie mitochondriów i uwalniania w ten sposób cytochromu c.

Uwolniony cytochrom c wraz z bia³kiem Apaf- 1, ATP i inicjatorow¹ prokaspaz¹ 9 tworzy tzw. apoptosom, w którym prokaspaza 9 ule- W artykule przedstawiono mo¿liwoœci

wykorzystania w terapii genowej nowo- tworów strategii tzw. genów proapoptotycznych. Mechanizm dzia³ania bia-

³ek proapoptotycznych (kodowanych przez proapoptotyczne transgeny) polega na niszczeniu komórek nowotworowych poprzez indukowanie w nich œmierci maj¹cej wszelkie morfologiczne cechy apoptozy. Szereg danych wskazuje, ¿e niektóre bia³ka proapoptotyczne pochodzenia wirusowego (np.

Apoptyna i E4orf4) indukuj¹ œmieræ tylko w komórkach nowotworowych. Po- nadto indukowana przez te wirusowe bia³ka œmieræ komórek jest niezale¿na od kaspaz, statusu genu p53 oraz hamuj¹cego wp³ywu bia³ek z rodziny Bcl- 2. Zastosowanie w terapii genowej ge- nów koduj¹cych wirusowe bia³ka proapoptotyczne przypuszczalnie pozwoli omin¹æ problem uszkadzania prawi- d³owych tkanek. W przypadku genów proapoptotycznych koduj¹cych endogenne bia³ka eukariotyczne (np. bia³- ko Bax), swoistoœæ ekspresji genów mo¿e zostaæ zapewniona przez zastosowanie promotorów swoistych dla no- wotworów (np. promotora indukowa- nego hipoksj¹ lub promotora dla genu telomerazy). Strategia genów proapoptotycznych umo¿liwia nie tylko selek- tywne i bezpoœrednie niszczenie ko- mórek nowotworowych w wyniku programowania ich œmierci, ale te¿

w przypadku stosowania terapii skojarzonej z radioterapi¹ lub chemioterapi¹, mo¿e polepszyæ efekty terapeutyczne tych metod.

S³owa kluczowe: terapia genowa no- wotworów, geny proapoptotyczne, apoptoza, nekroza.

W

Wssppóó³³cczzeessnnaa OOnnkkoollooggiiaa ((22000011)) vvooll.. 55;; 66 ((224422––224499))

Geny proapoptotyczne

w terapii genowej nowotworów

Proapoptotic genes in cancer gene therapy

Iwona Mitrus, Ewa Missol-Kolka, Stanis³aw Szala

Zak³ad Biologii Molekularnej Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Sk³odowskiej-Curie, Oddzia³ w Gliwicach

(2)

ga autokatalitycznej aktywacji. Zaktywowana kaspaza 9 inicjuje aktywacjê kaspaz efekto- rowych, co powoduje proteolizê szeregu bia-

³ek j¹drowych i cytoplazmatycznych. Efektem s¹ zmiany strukturalne i funkcjonalne komór- ki, i w rezultacie œmieræ komórki [1, 2, 5].

Szlak receptorów sygna³ów œmierci jest uruchamiany po przy³¹czaniu siê swoistych ligandów do receptorów b³onowych z rodziny tzw. receptorów œmierci (np. receptora Fas). Ligandy te s¹ bia³kowymi sygna³ami œmierci wysy³anymi przez inne komórki orga- nizmu. Receptor zwi¹zany z ligandem wi¹¿e tzw. bia³ka adaptorowe, np. dla receptora Fas jest to bia³ko FADD, maj¹ce zdolnoœæ wi¹zania siê z nieaktywn¹ prokaspaz¹ 8, po czym nastêpuje jej autokatalityczna aktywacja. Aktywna kaspaza 8 inicjuje kaskadê kaspaz przez proteolityczn¹ aktywacjê efekto- rowej kaspazy 3, a nastêpnie uaktywniane s¹ dalsze kaspazy efektorowe [1, 2, 5].

Oprócz typowej apoptozy zale¿nej od kaspaz znane s¹ tak¿e inne typy œmierci komó- rek, wykazuj¹ce cechy morfologiczne i bio- chemiczne podobne do cech œmierci apoptotycznej, np. apoptozê niezale¿n¹ od kaspaz i P53. Okreœleniem apoptoza kaspazonieza- le¿na pos³uguj¹ siê ró¿ni autorzy do opisu œmierci komórek, w której nie odgrywaj¹ roli kaspazy, natomiast œmieræ komórek inicjowa- na jest poprzez destrukcjê mitochondriów [8, 10, 11]. Destrukcja mitochondriów poci¹ga za sob¹ m.in. zaburzenia transportu elektronów, oksydacyjnej fosforylacji, syntezy ATP i zmian w potencjale oksydoredukcyjnym komórki.

Œmieræ taka ma zupe³nie inny przebieg ni¿

œmieræ apoptotyczna z udzia³em kaspaz.

Choæ wykazuje pewne podobieñstwa do typowej apoptozy, trwa jednak o wiele d³u¿ej (czas nietypowej apoptozy liczy siê w dniach, podczas gdy czas apoptozy zale¿nej od kaspaz i p53 w minutach lub godzinach). Nie- którzy twierdz¹, ¿e œmieræ taka jest raczej pewn¹ postaci¹ nekrozy [10, 11, 12]. Innym przyk³adem mo¿e byæ tzw. paraptoza (ang.

paraptosis). Jest to proces w wiêkszym stopniu zbli¿ony do nekrozy, lecz jednoczeœnie zale¿ny od kaspazy 9 [13].

Decyzja czy komórki ulegn¹ œmierci apoptotycznej, czy nekrotycznej, zale¿y m.in. od poziomu wewn¹trzkomórkowego ATP w mo- mencie, gdy dochodzi do tzw. za³amania po- tencja³u transb³onowego mitochondrium (∆Ψm) [9, 14, 15, 16, 17]. Towarzysz¹ce otwarciu megakana³ów zahamowanie oksydacyjnej fosforylacji i aktywacja mitochondrial- nej ATPazy przyspieszaj¹ zmniejszanie puli ATP w komórce. Gwa³towny ubytek ATP pro- wadzi do zahamowania funkcji ¿yciowych ko- mórki i niekontrolowanej lizy komórek – innymi s³owy – nekrozy. Przy dostatecznym natomiast poziomie ATP aktywne s¹ kaspazy i nastêpuje indukcja typowej apoptozy [17].

Manipulowanie metabolizmem energetycznym komórki, np. hamowanie reakcji w ³añcuchu oddechowym lub zablokowanie dostarczania substratów dla glikolizy, ukierunkowuje œmieræ komórek na nekrozê [18].

GENY PROAPOPTOTYCZNE W TERAPII GENOWEJ NOWOTWORÓW

Jak ju¿ wczeœniej wspomniano, komórki nowotworowe nie wchodz¹ w stan apoptozy pomimo uszkodzeñ DNA i sygna³ów otrzymy- wanych od innych komórek. Stan taki okreœla siê niekiedy jako ucieczkê od apoptozy. Przy- czyn¹ mog¹ byæ mutacje i delecje genów su- presorowych koduj¹cych bia³ka bior¹ce udzia³ w regulacji apoptozy (np. genów: p53, mda- 7, BRCA1, Rb, PTEN, itp.), genów koduj¹cych kaspazy, genów koduj¹cych proapoptotyczne bia³ka nale¿¹ce do rodziny Bcl-2 (np. Bax, Bak) [5] oraz genu koduj¹cego bia³ko Apaf- 1 [19]. Szereg danych wskazuje, ¿e w ko- mórkach nowotworowych wystêpuje zachwia- nie równowagi miêdzy czynnikami pro- i antyapoptotycznymi [3, 4, 5]. Zmniejszeniu aktywnoœci genów proapoptotycznych towarzyszy najczêœciej nadekspresja genów koduj¹cych inhibitory apoptozy, np. bia³ka Bcl- 2 lub endogenne bia³kowe inhibitory apoptozy (IAP), np. tzw. surwiwiny [5].

Wprowadzanie do komórek nowotworowych genów proapoptotycznych ma na celu wymuszenie w komórkach œmierci apoptotycznej. Przyk³adami takich genów s¹ geny z rodziny bcl-2 (bax, bim, bak), geny kaspaz oraz gen koduj¹cy receptor b³onowy Fas wi¹-

¿¹cy ligand FasL. Osobn¹ grupê stanowi¹ wirusowe geny proapoptotyczne: apoptyny wirusa anemii u kurcz¹t, Vpr wirusa HIV i E4orf4 adenowirusów. Przyk³ady genów proapoptotycznych, zarówno wirusowych i pochodz¹cych z genomu ssaków, które stoso- wano w terapii genowej w badaniach in vitro i in vivo zosta³y przedstawione w tab.

Wiêkszoœæ bia³ek kodowanych przez geny proapoptotyczne wywo³uje apoptozê w mechanizmie zale¿nym od p53 oraz kaspaz w tzw. szlaku p53 lub szlaku receptorów sygna³ów œmierci. Niektóre, jak np. apoptyna czy E4orf4, wywo³uj¹ nietypow¹ apoptozê w mechanizmie niezale¿nym od genu p53 oraz kaspaz, w którym œmieræ komórek inicjo- wana jest poprzez destrukcjê mitochondriów.

Zalet¹ bia³ek kodowanych przez wirusowe geny jest to, ¿e niektóre z nich indukuj¹ apop- tozê swoiœcie w komórkach nowotworowych i stransformowanych, nie indukuj¹ natomiast œmierci komórek prawid³owych [20, 21, 22, 23, 24]. Bia³ka te jednak stanowi¹ wyj¹tek, poniewa¿ wiêkszoœæ znanych bia³ek proapoptotycznych indukuje apoptozê we wszystkich komór- kach, do których zostan¹ wprowadzone. Aby wiêc unikn¹æ niszczenia komórek zdrowych tkanek, niezbêdne jest zapewnienie swoisto- œci transdukcyjnej i transkrypcyjnej.

GENY PROAPOPTOTYCZNE

POCHODZ¥CE Z GENOMU SSAKÓW Geny proapoptotyczne pochodz¹ce z genomu ssaków to m.in. geny z rodziny wielogenowej bcl-2. Rodzina ta obejmuje geny koduj¹ce bia³ka proapoptotyczne indukuj¹ce apoptozê (Bax, Bcl-x_s, Bak, Bad, Bim i in.) The article describes prospects of

using the so-called pro-apoptotic genes in gene therapy of neoplastic diseases.

Apoptosis is a process that eliminates damaged cells unable to repair their incurred defects (for example muta- tions in their DNA, faulty proliferation patterns, etc.). In neoplastic diseases apoptosis becomes corrupted. Neo- plastic cells become insensitive to the majority of signals that normally trigger apoptosis. In sum, their phenotype becomes apoptosis-resistant.

One possible therapeutic strategy in cancer treatment is to destroy defec- tive cells by endowing them with genes that encode the pro-apoptotic proteins. Their task is to restore apoptosis responsiveness of these cells.

During gene therapy trials, both in vitro and in vivo, various pro-apoptotic genes have been tried (for example bax, bak, bim). Usually, growth inhibi- tion has been obtained in primary tumors induced in experimental animals that have been administered such pro-apoptotic genes. However, this strategy has a serious drawback, na- mely its low specificity. These genes induce apoptosis in both normal and neoplastic cells, thus leading to damage of normal tissues also.

Nonetheless, there are pro-apoptotic proteins that act specifically on abnor- mal cells and cause their death witho- ut affecting normal cells. Examples of such proteins involve viral Apoptin and E4orf4. Death induced by these proteins is caspase-independent. It neither depends on functional status of p53 gene nor on inhibitory effects of Bcl-2 family proteins. Although it shows mor- phological features of apoptosis, its ti- me-course is considerably longer than that of typical apoptosis (it lasts up to several days). Therapeutic application of genes encoding these proteins is li- kely to circumvent problems associa- ted with damage to normal tissues.

In case of pro-apoptotic genes encoding endogenous eukaryotic proteins (for example Bax protein) specificity of expression may be assured by putting them under the control of promoters that are tumor-specific. Examples include hypoxia-induced promoter and telomerase gene promoter.

Pro-apoptotic genes may be transfer- red into neoplastic cells in various man- ners, including electroporation and use of cationic liposomes or cationic poly- mers. However, viral carriers prove to be so far the most efficient type of vectors for such purposes, albeit they are nor devoid of inherent problems. In the W

(3)

oraz antyapoptotyczne bia³ka hamuj¹ce apop- tozê (np. Bcl-2, Bcl-w, Bcl-xL). Wzajemne re- lacje pomiêdzy bia³kami proapoptotycznymi i antyapoptotycznymi decyduj¹ o tym, czy ko- mórka ulegnie apoptozie. Najlepiej poznanym proapoptotycznym bia³kiem z tej rodziny jest Bax. Bia³ko to ma zdolnoœæ otwierania kana-

³ów znajduj¹cych siê w b³onach mitochondrial- nych, a byæ mo¿e tak¿e perforacji b³on mitochondrium i uwalniania cytochromu c. Jego dzia³anie zbadano na ró¿nych nowotworowych liniach komórkowych, np. komórkach raka jajnika (PA-1, OV-4, OVCAR3) [25], raka p³uc (A549, H1299) [26]. We wszystkich komórkach wprowadzany gen bax skutecznie indukowa³ apoptozê. Stwierdzono tak¿e, i¿ bax zwiêksza wra¿liwoœæ niektórych opornych na chemiote- rapiê linii komórek nowotworowych. Zaobser- wowano np. zwiêkszon¹ liczbê komórek w stanie apoptozy po traktowaniu taksolem ludzkich linii raka jajnika (SW626, SKOV3.ip1) z transgenem bax w stosunku do tych sa- mych komórek nietraktowanych taksolem [25].

Podjêto tak¿e próby terapii wielogenowej genem bax i innymi genami, np. kaspazy 8. Za- obserwowano synergistyczny efekt dzia³ania kodowanych przez te geny bia³ek, znaczny wzrost liczby komórek w apoptozie w porów- naniu z poziomem apoptozy w komórkach, wywo³ywanym tylko przez pojedyncze geny.

Kolejne bia³ko z rodziny Bcl-2, bia³ko Bcl-xs

hamuje dzia³anie bia³ka antyapoptycznego bia³ka Bcl-2, które wykazuje nadekspresjê w ponad 70 proc. przypadków raka piersi.

Indukowanie apoptozy przez bia³ko Bcl-x_s sprawdzano na komórkach raka piersi, za- równo in vitro, jak i in vivo. Podawanie genu Bcl-x_s za pomoc¹ noœników adenowirusowych in vivo spowodowa³o zahamowanie wzrostu guzów w porównaniu do guzów u zwierz¹t nieleczonych [27].

Innym przyk³adem genów proapoptotycznych s¹ geny koduj¹ce bia³ka Fas i FADD.

Receptor Fas (APO-1; CD95) nale¿y do rodziny receptorów TNF (TNF – czynnik nekrozy nowotworów). Receptor Fas ³¹czy siê z ligandem FasL. Cytoplazmatyczne fragmenty receptorów z rodziny TNF nie maj¹ domen katalitycznych. Dlatego zaktywowany receptor (receptor ze zwi¹zanym ligandem) wi¹¿e tzw. bia³ka poœrednicz¹ce, bia³ka adaptorowe, do których z kolei przy³¹cza siê prokaspaza inicjatorowa. Do lepiej poznanych bia-

³ek adaptorowych nale¿y m.in. bia³ko FADD.

Interakcja bia³ek adaptorowych z cytoplazma- tycznym fragmentem receptorów z rodziny TNF zachodzi z udzia³em tzw. domen œmier- ci (DD, ang. death domain), swoistych ami- nokwasowych sekwencji znajduj¹cych siê za- równo w bia³kach adaptorowych, jak i recep- torach. Bia³ko FADD oprócz domeny DD posiada równie¿ tzw. domenê efektorow¹ (DED, ang. death effector domain), do której przy³¹cza siê swoj¹ domen¹ DED prokaspaza 8. W tak uformowanym kompleksie prokaspaza 8 ulega autokatalitycznej aktywacji.

Fas jest glikozylowanym bia³kiem b³ono- wym o masie 48 kDa. Ulega ekspresji w ró¿nych typach prawid³owych i nowotworowych ludzkich linii komórkowych [28].

FasL znaleziono g³ównie na aktywowanych limfocytach T i NK. Oddzia³ywania miêdzy receptorem i ligandem (Fas-FasL) odgrywaj¹ rolê w indukowaniu apoptozy linii lim- foidalnej i w wywo³ywaniu systemowej odpowiedzi immunologicznej [29].

Dzia³anie genu FasL badano zarówno na komórkach posiadaj¹cych receptor Fas (Fas⁺, mysi rak nerki Renca) oraz na komórkach nie posiadaj¹cych tego receptora (FasL^–, komór- ki ludzkiego raka okrê¿nicy CT26). Do obu linii komórkowych wprowadzano plazmid z genem FasL. Zaobserwowano ró¿nice w indukcji apoptozy wywo³ywanej przez ten gen w komórkach obu linii: w linii komórkowej Fas⁺poziom apoptozy by³ bardzo wysoki (na- wet ponad 90 proc.), zaœ komórki Fas^– by³y niewra¿liwe na dzia³anie bia³ka FasL. Gen FasL stosowany by³ tak¿e w badaniach in vivo, na kilku ró¿nych modelach zwierzêcych, m.in. na mysim raku nerki Renca. Guzy, do komórek których wprowadzano gen FasL w wektorach adenowirusowych, ju¿ po pierw- szym podaniu ulega³y zmniejszeniu. Po dru- gim podaniu myszom genu (2 dni po pierw- szej iniekcji) guzy zanika³y ca³kowicie [28].

W badaniach in vitro i in vivo wprowadzano tak¿e gen koduj¹cy bia³ko FADD za pomoc¹ noœników wirusowych do komórek my- sich glejaków GL26 oraz GL261. Bia³ko wywo³ywa³o wysoki poziom apoptozy in vitro (ok.

70 proc. komórek) oraz powodowa³o zahamowanie wzrostu guzów pochodz¹cych z tych linii. Efekt terapeutyczny utrzymywa³ siê na- wet do 4 tyg. po zaprzestaniu podawania genu terapeutycznego [30].

Genami proapoptotycznymi s¹ tak¿e geny koduj¹ce tzw. kaspazy. Kaspazy s¹ enzy- mami proteolitycznymi z grupy proteaz cy- steinowych, rozszczepiaj¹cymi bia³ka po resz- cie kwasu asparaginowego [31]. W terapii genowej nowotworów próbowano stosowaæ kilka ró¿nych kaspaz, m.in. kaspazê 3 i 8.

Dzia³anie kaspazy 8 badano na przyk³adzie glejaków. W komórkach glejaków (U251) wprowadzenie in vitro lub in vivo genu kodu- j¹cego kaspazê 8 wywo³ywa³o w nich apop- tozê [32]. Innym genem, który próbowano stosowaæ w terapii genowej nowotworów by³ gen kaspazy 3. Wywo³ywany przez ni¹ poziom apoptozy by³ stosunkowo niski, lecz wprowadzenie do komórek genu koduj¹cego tê kaspazê uczula³o je na chemioterapeutyki. Na przyk³ad zastosowanie etopozydu wywo³ywa³o apoptozê nie tylko in vitro, ale te¿

powodowa³o zmniejszenie wielkoœci guzów u szczurów zaszczepionych komórkami raka w¹troby (AH130) [33].

Kolejnym przyk³adem genu proapoptotycznego stosowanego w terapii genowej jest E2F-1. E2F-1 jest czynnikiem transkrypcyjnym, case of pro-apoptotic genes, it is the

production of adenoviral vectors that poses a problem as they contain a gene which is toxic to packaging cells.

Possible solutions include use of binary systems comprising two adenoviral vectors. The first of them contains a pro-apoptotic gene remaining under the control of a promoter binding a specific, second vector-encoded protein, whose gene was placed under the control of a telomerase promoter. Expression of the pro-apoptotic gene takes place only upon co-transfec- tion of target cells with both carriers.

The strategy of using pro-apoptotic genes in the treatment of neoplastic diseases, apart from enabling selective and direct destruction of cancer cells via restoring their programmed death, may also ameliorate the therapeutic effect obtained if it is combined with ra- diotherapy and/or chemotherapy.

Key words: cancer gene therapy, pro- apoptotic genes, apoptosis, necrosis.

W

(4)

Wspó³czesna Onkologia

246

pe³ni¹cym wa¿n¹ rolê w podzia³ach komórko- wych, w czasie przechodzenia z fazy G1 do fazy S. Nadekspresja E2F-1 wywo³uje apopto- zê, przypuszczalnie z powodu niezgodnoœci sygna³ów proliferacji z sygna³ami zatrzymania cyklu komórkowego [34]. Dzia³anie E2F-1 badano in vitro, m.in. na dwóch liniach komórko- wych: czerniaka SK-MEL-28 oraz SK-MEL-2.

W obu przypadkach uzyskano zbli¿ony poziom apoptozy, pomimo ¿e pierwsza z tych linii posiada prawid³owy, a druga zmutowany gen p53. Sugeruje to, ¿e E2F-1 indukuje apoptozê niezale¿n¹ od statusu tego genu [34]. E2F-1 by³ u¿ywany równie¿ w badaniach in vivo. Myszom zaszczepionym komórkami raka p³askonab³onkowego g³owy i szyi Tu-138 lub Tu-167 podawano gen koduj¹cy E2F-1 w noœnikach wirusowych. Zaobserwowano zahamowanie wzrostu guzów u leczonych w ten sposób myszy [35].

WIRUSOWE

GENY PROAPOPTOTYCZNE

Wirusowe geny proapoptotyczne to np. geny apoptyny, e4orf4 oraz vpr. Apoptyna jest bia³kiem kodowanym przez gen VP3 wirusa

anemii u kurcz¹t (CAV – chicken anemia virus).

Jest to bia³ko o masie 14 kDa, sk³adaj¹ce siê ze 121 aminokwasów [21]. Apoptyna wywo³u- je apoptozê w transformowanych i nowotworowych liniach komórkowych, nie wywo³uje natomiast apoptozy w komórkach prawid³owych.

Apoptoza indukowana jest przez apoptynê niezale¿nie od statusu genu p53, od obecnoœci kaspaz i od hamuj¹cego wp³ywu antyapoptotycznych bia³ek z rodziny Bcl-2 [36]. W prawid³owych komórkach apoptyna lokalizuje siê g³ównie w cytoplazmie komórek, w komórkach transformowanych i nowotworowych g³ównie w j¹drze komórkowym. Sugeruje to, i¿ funkcja i aktywnoœæ apoptyny zale¿¹ od jej lokalizacji. J¹drowa lokalizacja bia³ka jest niezbêdna do wywo³ania apoptozy. Apoptyna, jako bia³- ko bogate w prolinê, mo¿e ze wzglêdu na za- sadowy charakter oddzia³ywaæ z DNA powo- duj¹c kondensacjê i fragmentacjê chromaty- ny. Apoptyna mo¿e te¿ dzia³aæ jako regulator transkrypcji genów wywo³uj¹cych apoptozê.

Byæ mo¿e w normalnych komórkach apoptyna jest modyfikowana przez bia³ka odpowie- dzialne za cytoplazmatyczn¹ lokalizacjê apoptyny. Utrata takich funkcjonalnych czynników w transformowanych i nowotworowych komór-

kach mo¿e u³atwiaæ transport apoptyny do j¹- dra. Niewykluczone, ¿e w komórkach nowotworowych nastêpuje tak¿e modyfikacja struk- tury apoptyny (np. fosforylacja, acetylacja), któ- ra w³aœnie umo¿liwia transport bia³ka do j¹dra [37]. Apoptyna zawiera sygna³ lokalizacji j¹- drowej i przypuszczalnie sygna³ eksportu j¹- drowego. Prawdopodobnie komórki prawid³o- we rozpoznaj¹ sekwencjê eksportu i apoptyna jest usuwana z j¹dra komórkowego. Dziêki temu w komórkach tych nie dochodzi do indukcji apoptozy [20]. W badaniach in vitro wy- kazano i¿ apoptyna indukuje apoptozê jedynie w komórkach stransformowanych i nowotworowych. Po wprowadzeniu genu apoptyny apoptoza indukowana by³a w ludzkich komór- kach miêsaka koœciopochodnego (U2OS – z prawid³owym genem p53, Saos-2/ala143 – ze zmutowanym p53, Saos-2 – bez genu p53) oraz innych liniach nowotworowych, np. w¹- trobiakach, bia³aczkach, czerniakach, nowo- tworach sutka i okrê¿nicy [36]. Apoptyna nie wywo³ywa³a natomiast apoptozy komórek prawid³owych: ludzkich fibroblastów (VH10), ke- ratynocytów (FSK-1), ludzkich komórek œród- b³onkowych HUVEC, ludzkich komórek miêœni g³adkich (HSMC) [20, 21, 38]. Apoptyna jest,

Ryc. 1. Uproszczony schemat przebiegu apoptozy. Schemat przedstawia przebieg typowej apoptozy zale¿nej od obecnoœci kaspaz, przebiegaj¹cej zarówno w mechanizmie zale¿nym od obecnoœci bia³ka P53 jak i w mechanizmie aktywuj¹cym tzw. receptory sygna³ów œmierci. Czynniki uszkadzaj¹ce DNA (np. promieniowanie jonizuj¹ce) poprzez P53 aktywuj¹ g³ów- nie transkrypcjê genu bax, koduj¹cego bia³ko uwalniaj¹ce z mitochondrium cytochrom c. Cytochrom c wraz z bia³kiem Apaf 1 bierze udzia³ w aktywacji kaspazy 9 aktywuj¹cej nastêp- nie kaspazy efektorowe. W szlaku receptorów sygna³ów œmierci po zwi¹zaniu liganda (bia³kowego czynnika œmierci) z receptorem z rodziny TNF pobudzony receptor aktywuje inicjatorow¹ prokaspazê 8. Kaspaza 8 uaktywnia kolejno kaspazy efektorowe. Oba szlaki ³¹cz¹ siê poprzez bia³ko Bid.

Początek szlaku receptorów śmierci

Początek szlaku p53

APOPTOZA

LIGAND Fas-L RECEPTOR RODZINY TNF

MITOCHONDRIUM

FADD Prokaspaza 8

Prokaspaza 9

APOPTOSOM

JĄDRO KOMÓRKOWE

Kaspaza 8

Kaspaza 9

Kaspaza 3 Prokaspaza 3 Apaf-1

Cytochrom c

Uszkodzone DNA

P15Bid

P53

Bax

P22Bid

(5)

Geny proapoptotyczne w terapii genowej nowotworów

247

jak dot¹d, jedynym proapoptotycznym bia³kiem pochodzenia wirusowego badanym in vivo w komórkach nowotworowych. Myszy zaszcze- piono komórkami raka w¹troby HepG2. Na- stêpnie za pomoc¹ adenowirusów do¿ylnie lub doguzowo wprowadzano gen koduj¹cy apop- tynê. W grupie myszy leczonych zaobserwowano wyraŸne zahamowanie wzrostu guzów w porównaniu z myszami grup kontrolnych (myszom podawano sól fizjologiczn¹ lub do-

¿ylnie wprowadzano wektor adenowirusowy z genem apoptyny w odwróconej orientacji).

Badania na zwierzêtach wykaza³y nisk¹ tok- sycznoœæ apoptyny po podskórnym, dootrzew- nowym i do¿ylnym podaniu adenowirusów zawieraj¹cych gen apoptyny [21].

Innym przyk³adem genu proapoptotycznego jest gen e4orf4 z ludzkiego adenowirusa typu 5 (Ad5). Bia³ko E4orf4 kodowane przez gen e4orf4, ma masê 14 kDa i sk³ada siê ze 113 aminokwasów [22, 23, 39]. E4orf4 regu- luje ekspresjê genów na poziomie transkrypcji i translacji. Jego dzia³anie ma wiele cech podobnych do dzia³ania apoptyny. Indukuje apoptozê w komórkach nowotworowych i transformowanych niezale¿nie od statusu genu p53, jak i niezale¿nie od obecnoœci kaspaz [40]. Bia³ko E4orf4 nie indukuje apoptozy w komórkach prawid³owych [22, 23, 39].

Bia³ko E4orf4 wi¹¿e siê z fosfataz¹ PP2A [41].

Kompleks E4orf4-PP2A odgrywa rolê w regulacji procesów komórkowych: w podzia³ach komórkowych, sygna³ach transdukcyjnych, ekspresji genów, i kontroli apoptozy [39, 41].

Mechanizm indukcji apoptozy przez bia³ko E4orf4 wy³¹cznie w komórkach nowotworowych nie zosta³ do tej pory wyjaœniony [39].

W przeciwieñstwie do apoptyny nie obserwu- je siê j¹drowej lokalizacji E4orf4 w transformowanych i nowotworowych liniach. Nie mo¿-

na wiêc powi¹zaæ funkcji bia³ka E4orf4 z jego lokalizacj¹. Swoistoœæ indukowania apoptozy wy³¹cznie w komórkach nowotworowych próbowano wiêc t³umaczyæ w inny sposób.

Przypuszczalnie E4orf4 indukuje apoptozê tylko w obecnoœci onkogenów. Niewykluczone,

¿e w komórkach nowotworowych E4orf4 ulega modyfikacjom innym ni¿ w komórkach prawid³owych [23].

METODY WPROWADZANIA GENÓW PROAPOPTOTYCZNYCH DO KOMÓREK

O powodzeniu terapii genowej nowotwo- rów w du¿ym stopniu decyduje wprowadzenie genów terapeutycznych do jak najwiêkszej iloœci komórek. Geny wprowadzane s¹ in vivo ró¿nymi metodami [42]. DNA mo¿na wprowa- dzaæ do komórek np. za pomoc¹ lipidów kationowych i kationowych polimerów. Noœniki te nie indukuj¹ odpowiedzi immunologicznej. S¹ jednak ma³o wydajne, a nisk¹ wydajnoœæ transfekcji jedynie w niewielkim stopniu mo¿- na zwiêkszaæ wielokrotnymi podaniami. Sku- teczniejsz¹ metod¹ wprowadzania genów do komórek in vivo wydaje siê elektroporacja ko- mórek – metoda polegaj¹ca na przejœciowym uszkodzeniu b³ony komórkowej pod wp³ywem przy³o¿onego napiêcia i wytworzeniu w ten sposób porów, przez które DNA ³atwo wnika do komórek. Metoda ta ma jednak ograniczo- ne zastosowanie in vivo, poniewa¿ nadaje siê jedynie do podskórnego lub domiêœniowego wprowadzania genów. W ostatnich latach do transfekcji in vivo najczêœciej stosowane s¹ modyfikowane wektory adenowirusowe. O po- wszechnoœci ich stosowania decyduje wyso- ka wydajnoœæ wprowadzania genów do komó- rek. Jednak i te wektory nie s¹ pozbawione wad. Najwiêksz¹ z nich jest immunogennoœæ, ograniczaj¹ca iloœæ podañ in vivo. Ponadto no- œniki te maj¹ ograniczon¹ pojemnoœæ dla te-

rapeutycznego DNA. W przypadku omawia- nych przez nas genów proapoptotycznych do- datkowym problemem staje siê konstruowanie wektorów ekspresyjnych z transgenem, które- go bia³kowy produkt jest toksyczny dla komó- rek pakuj¹cych. Aby omin¹æ problem indukowania apoptozy w komórkach pakuj¹cych stosuje siê tzw. binarne systemy adenowirusowe (ang. binary adenoviral vector system). Przyk³a- dem takiego uk³adu mo¿e byæ system z pro- motorem indukowanym przez bia³ko GAL4 (ryc. 2.) [43]. System taki sk³ada siê z dwóch typów noœników adenowirusowych. Jeden z nich zawiera gen terapeutyczny pod kontro- l¹ promotora wi¹¿¹cego bia³ko GAL4. Warun- kuje on minimaln¹ transkrypcjê danego genu, dziêki czemu nie dochodzi do indukcji apoptozy w komórkach pakuj¹cych. Drugi noœnik adenowirusowy zawiera gen koduj¹cy bia³ko GAL4. Ekspresja genu terapeutycznego zachodzi dopiero po kotransfekcji komórek tymi dwoma noœnikami wirusowymi.

Jak ju¿ wspomniano, w terapii genowej z zastosowaniem genów proapoptotycznych wa¿ne jest zapewnienie swoistoœci niszczenia komórek nieprawid³owych. Aby nie dosz³o do uszkodzenia prawid³owych tkanek, geny terapeutyczne musz¹ ulegaæ ekspresji wy³¹cznie w komórkach nowotworowych. Jedn¹ z metod zapewnienia selektywnego niszczenia ko- mórek nowotworowych jest umieszczenie ge- nów proapoptotycznych pod kontrol¹ promo- torów swoistych nowotworowo. Przyk³adami takich promotorów obok niektórych promoto- rów tkankowo swoistych (np. tyrozynazy, CEA), mo¿e byæ promotor regulowany hipoksj¹ i promotor dla genu telomerazy.

Stan hipoksji (niedotlenowania) pewnych regionów komórek jest unikaln¹ cech¹ guzów

Tab. Przyk³ady genów proapoptotycznych, stosowanych w terapii genowej nowotworów w badaniach in vitro i in vivo

G

Geenn DDzziiaa³³aanniiee bbiiaa³³kkaa kkooddoowwaanneeggoo pprrzzeezz ggeenn pprrooaappooppttoottyycczznnyy AAuuttoorrzzyy

Bax uwalnia z mitochondrium cytochrom c; terapeutyczne dzia³anie tego genu wzrasta Xiang i wsp. [25]

w przypadku stosowania terapii skojarzonej z chemio- i radioterapi¹

Bcl-x_s hamuje dzia³anie antyapoptotycznych bia³ek Bc_l-2 i Bc_l-xL Ealovega i wsp. [53]

Bak hamuje dzia³anie antyapoptotycznych bia³ek Bc_l-2 i Bc_l-xL Pataer i wsp. [54]

Bim hamuje dzia³anie antyapoptotycznych bia³ek Bc_l-2 i Bcl-w O'Connor i wsp. [55]

Fass receptor wi¹¿¹cy bia³ka poœrednicz¹ce, uruchamia prokaspazy inicjatorowe Arai i wsp. [28]

FADD bia³ko wi¹¿¹ce siê z receptorem Fas, w przypadku nadekspresji Kondo i wsp. [30]

mo¿e indukowaæ apoptozê niezale¿nie od tego receptora

E2F-1 czynnik transkrypcyjny kompleksuj¹cy z bia³kiem Rb; Liu i wsp. [35]

dzia³a w cyklu komórkowym w fazie G1/S

Apoptyna*⁾ indukuje apoptozê specyficznie w komórkach nowotworowych i stransformowanych Noteborn [36], Zhuang i wsp. [38], Noteborn i wsp. [56]

E4orf4*⁾ indukuje apoptozê specyficznie w komórkach nowotworowych i stransformowanych Shtrichman i Kleinberger [22], Shtrichman i wsp. [23]

Vpr*⁾ indukuje apoptozê specyficznie w komórkach nowotworowych i stransformowanych; Stewart i wsp. [24]

wprowadzano nie gen, a bia³ko licz¹ce 96 aminokwasów w pustym, nie zawieraj¹cym materia³u genetycznego, wirionie HIV-1

**⁾⁾GGeenn ppoocchhooddzzeenniiaa wwiirruussoowweeggoo

(6)

248

Wspó³czesna Onkologia

nowotworowych [44–47]. Wiêkszoœæ guzów o wymiarach powy¿ej 1 mm³ zawiera regio- ny, do których dociera zbyt ma³a iloœæ tlenu w stosunku do potrzeb komórek [48]. W re- gionach takich dochodzi do aktywacji wielu ró¿nych genów, w tym tak¿e genu koduj¹cego naczyniowo-œródb³onkowy czynnik wzrostu (VEGF) odpowiedzialnego m.in. za po- wstawanie sieci naczyñ krwionoœnych w ob- rêbie guzów [46]. Gen koduj¹cy VEGF znajduje siê pod kontrol¹ promotora induko- wanego hipoksj¹, zawieraj¹cego w swojej strukturze m.in. element odpowiedzi na hi- poksjê (HRE, ang. hypoxia response element).

Promotor ten zostaje zaktywowany po przy-

³¹czeniu siê do elementu HRE czynnika HIF- 1 (ang. hypoxia-inducible factor-1). Regulo- wany hipoksj¹ promotor VEGF by³ wykorzystany do uzyskania swoistej ekspresji tzw.

genów samobójczych w obrêbie niedotleno- wanych komórek nowotworowych [49].

Innym przyk³adem promotora swoistego dla nowotworów jest promotor dla genu telomerazy [50]. Telomery s¹ koñcowymi odcinkami ludzkich chromosomów, z³o¿onymi z powtarza- j¹cych siê sekwencji: TTAGGG. Ich funkcj¹ jest ochrona chromosomów przed degradacj¹, fu- zj¹ koñców, rearan¿acjami i utrat¹ chromoso- mów. Ludzkie telomery s¹ skracane w kolej-

nych podzia³ach komórek somatycznych. Syn- teza telomerów zachodzi przy udziale komplek- sów rybonukleoproteinowych zwanych telome- raz¹. Enzym ten odgrywa rolê w unieœmiertel- nianiu komórek. Jego aktywnoœæ stwierdza siê w wiêkszoœci komórek nowotworowych (w ok.

70 proc. typów nowotworów), nieaktywny jest natomiast w komórkach prawid³owych. Promo- tor genu telomerazy by³ ju¿ wykorzystany m.in.

w terapii genowej nowotworów z u¿yciem proapoptotycznego genu bax [51].

Podstawowym problemem ograniczaj¹cym skutecznoœæ metody jest niska wydajnoœæ wprowadzania genów. Poniewa¿ apoptozê wywo³uj¹ nie same geny, a kodowane przez nie bia³ka wydaje siê, i¿ alternatywn¹ meto- d¹ by³aby terapia wykorzystuj¹ca bia³ka proapoptotyczne. Bia³ka te nie posiadaj¹ jednak receptorów umo¿liwiaj¹cych ich transport przez b³onê do komórek. Próbowano wiêc ró¿nych metod wprowadzania bia³ek proapoptotycznych do komórek. Bia³ko wirusa HIV-1 (Vpr) wprowadzano np. w pustym wirionie nie zawieraj¹cym materia³u genetycznego wirusa [24]. Stwierdzono, i¿ bia³ko Vpr indukuje apoptozê w ró¿nych nowotworowych liniach komórkowych (np. HeLa), pre- ferencyjnie jednak w komórkach intensywnie dziel¹cych siê [24].

Nowatorskim podejœciem terapeutycznym mog¹ byæ próby zastosowania do wprowadzania do komórek bia³ek proapoptotycznych po³¹czonych z bia³kiem VP22. Bia³ko to ma zdolnoœæ przemieszczania siê miêdzy komór- kami, a ponadto nie traci tej w³aœciwoœci po fuzji z innym bia³kiem. Bia³ko VP22 pochodzi z wirusa opryszczki [52]. Mechanizm jego transportu do komórek nie jest jeszcze po- znany. Wiadomo jednak, ¿e VP22 jest usu- wane z komórek niezale¿nie od aparatu Gol- giego i wchodzi do j¹dra s¹siaduj¹cych ko- mórek. VP22 nie wnika do komórek na drodze endocytozy, ale wykorzystuje transport z udzia³em aktynowego szkieletu. Jest w stanie wnikaæ zarówno do komórek w pe³- ni zró¿nicowanych, jak i dziel¹cych siê, co mo¿e mieæ du¿e znaczenie w przypadku szybko dziel¹cych siê komórek nowotworowych. Jego unikalne w³aœciwoœci byæ mo¿e pozwol¹ na wykorzystanie bia³ek proapoptotycznych bezpoœrednio w terapii nowotworów.

ZAKOÑCZENIE

W artykule przedstawiono mo¿liwoœci wykorzystania w terapii genowej nowotworów ge- nów proapoptotycznych. Mechanizm dzia³ania genów proapoptotycznych (tak jak wiêkszoœci leków przeciwnowotworowych i promieni joni-

Ryc. 2. Binarny system adenowirusowy. Schemat przedstawia przyk³ad tzw. binarnego systemu adenowirusowego (ang. binary adenoviral vector system), który pozwala omin¹æ problem indukcji apoptozy w komórkach pakuj¹cych. System sk³ada siê z dwóch noœników adenowirusowych. Jeden z nich zawiera gen proapoptotyczny pod kontrol¹ promotora wi¹¿¹- cego bia³ko GAL4. Drugi noœnik adenowirusowy zawiera gen koduj¹cy bia³ko GAL4, pod kontrol¹ promotora dla genu telomerazy. Promotor ten warunkuje ekspresjê GAL4 wy³¹cznie w komórkach nowotworowych. Ekspresja proapoptotycznego genu terapeutycznego zachodzi dopiero po kotransfekcji komórek docelowych tymi dwoma noœnikami wirusowymi.

APOPTOZA

PROMOTOR DLA GENU TELOMERAZY GEN KODUJĄCY SEKWENCJĘ GAL4

PROMOTOR UAKTYWNIANY PRZEZ GAL4 GEN PROAPOPTOTYCZNY

I WEKTOR ADENOWIRUSOWY

II WEKTOR ADENOWIRUSOWY

KOMÓRKA PRAWIDŁOWA – BRAK EKSPRESJI TRANSGENU

KOMÓRKA NOWOTWOROWA – EKSPRESJA TRANSGENU Promotor dla

genu telomerazy

Promotor uaktywniany przez GAL4

Gen proapoptotyczny

Gen GAL4

Promotor dla genu telomerazy

Promotor uaktywniany przez GAL4 Genom wirusa

Genom wirusa

Gen proapoptotyczny Białko

proapoptotyczne Gen GAL4

GAL4 KOTRANSDUKCJA

(7)

Geny proapoptotyczne w terapii genowej nowotworów

249

zuj¹cych) polega na kierowaniu komórek nowotworowych na drogê apoptozy. Zastosowa- nie genów proapoptotycznych, szczególnie pochodzenia wirusowego, przypuszczalnie pozwoli omin¹æ problem uszkadzania prawid³owych tkanek. Wirusowe bia³ka proapoptotyczne indukuj¹ bowiem apoptozê se- lektywnie w komórkach nowotworowych.

Strategia genów i bia³ek proapoptotycznych umo¿liwia nie tylko bezpoœrednie niszczenie komórek nowotworowych w wyniku programowania ich œmierci, ale te¿ w przypadku stosowania terapii skojarzonej z radio- lub chemioterapi¹, mo¿e polepszyæ efekty terapeutyczne tych tradycyjnych metod. Gene- ralnie, strategia genów proapoptotycznych jest uwa¿ana za obiecuj¹ce podejœcie w leczeniu chorób nowotworowych. Badania dotycz¹ce genów proapoptotycznych – zw³aszcza pochodzenia wirusowego – s¹ dopiero we wstêpnej fazie, i trudno zatem przes¹dzaæ, czy spe³ni¹ pok³adane w nich nadzieje.

PIŒMIENNICTWO

1. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis.

Nature 2000; 407: 770-6.

2. Rich T, Allen RL, Wyllie AH. Defying death after DNA damage. Nature 2000; 407: 777-83.

3. Kaufmann SH, Gores GJ. Apoptosis in cancer:

cause and cure. BioEssays 2000; 22: 1007-17.

4. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100: 57-70.

5. Szala S. Swoista indukcja apoptozy w komórkach nowotworowych. Nowotwory 2000; 50: 111-21.

6. Krammer PH. CD95's deadly mission in the im- mune system. Nature 2000; 407: 789-95.

7. Gottlieb RA. Mitochondria: execution central.

FEBS Lett 2000; 482: 6-12.

8. Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science 1998; 281: 1309-12.

9. Gr¹dzka I. Apoptoza: decyzja nale¿y do mitochondrium. Postêpy Biochem 2000; 46: 2-16.

10. Hirsch T, Marchetti P, Susin SA, Dallaporta B, Zamzami N, Marzo I, Geuskens M, Kroemer G.

The apoptosis-necrosis paradox. Apoptogenic proteases activated after mitochondrial perme- ability transition determine the mode of cell death. Oncogene 1997; 15: 1573-81.

11. Kolenko V, Uzzo RG, Bukowski R, Bander NH, Novick AC, Hsi ED, Finke JH. Dead or dying:

necrosis versus apoptosis in caspase-deficient human renal cell carcinoma. Cancer Res 1999;

59: 2838-42.

12. Fiers W, Beyaert R, Declercq W, Vandenabeele P. More then one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene 1999;

18: 7719-30.

13. Sperandio S, De Belle I, Bredesen DE. An alter- native, nonapoptotic form of programmed cell death. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 14376-81.

14. Cai J, Jones DP. Mitochondrial redox signaling during apoptosis. J Bioener Biomem 1999; 31: 327-34.

15. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, Petronilli V, Di Lisa F. Mitochondria and cell death. Mechani- stic aspects and methodological issues. Eur J Biochem 1999; 264: 687-701.

16. Pedersen PL. Mitochondrial events in the life and death of animal cells: a brief overview. J Bioener Biomem 1999; 31: 291-304.

17. Lemasters JJ, Qian T, Bradham CA, et al. Mito- chondrial dysfunction in the pathogenesis of ne- crotic and apoptotic cell death. J Bioener Bio- mem 1999; 31: 305-19.

18. Martin DS, Bertino JR, Koutcher JA. ATP depletion + pyrimidine depletion can markedly enhan-

ce cancer therapy: fresh insight for a new appro- ach. Cancer Res 2000; 60: 6776-83.

19. Soengas MS, Capodieci P, Polsky D, et al. In- activation of the apoptosis effector Apaf-1 in malignant melanoma. Nature 2001; 409: 207-11.

20. Danen-Van Oorschot AAM, Fischer DF, Grimber- gen JM, et al. Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 5843-7.

21. Pietersen AM, Van der Eb MM, Rademaker HJ, et al. Specific tumor-cell killing with adenovirus vectors containing the apoptin gene. Gene Ther 1999; 6: 882-92.

22. Shtrichman R, Kleinberger T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J Virol 1998; 72: 2975-82.

23. Shtrichman R, Sharf R, Barr H, Dobner T, Klein- berger T. Induction of apoptosis by adenovirus E4orf4 protein is specific to transformed cells and requires an interaction with protein phosphatase 2A. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 10080-5.

24. Stewart SA, Poon B, Jowett JBM, Xie Y, Chen ISY. Lentiviral delivery of HIV-1 Vpr protein induces apoptosis in transformed cells. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 12039-43.

25. Xiang J, Gómez-Navarro J, Arafat W, Liu B, Barker SD, Alvarez RD, Siegal GP, Curiel DT.

Pro-apoptotic treatment with an adenovirus encoding Bax enhances the effect of chemotherapy in ovarian cancer. J Gene Med 2000; 2: 97-106.

26. Kagawa S, Gu J, Swisher SG, Ji L, Roth JA, Lai D, Stephens LC, Fang B. Antitumor effect of adenovirus-mediated bax gene transfer on p53- sensitive and p53-resistant cancer lines. Cancer Res 2000; 60: 1157-61.

27. Dole MG, Clarke MF, Holman P i wsp. Bcl-xs enhances adenoviral vector-induced apoptosis in neu- roblastoma cells. Cancer Res 1996; 56: 5734-40.

28. Arai H, Gordon D, Nabel EG, Nabel GJ. Gene transfer of Fas ligand induces tumor regression in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 13862-7.

29. Watzlik A, Dufter Ch, Jung M, Opelz G, Ter- ness P. Fas ligand gene-carrying adeno-5 AdE- asy viruses can be efficiently propagated in apoptosis-sensitive human embryonic retinoblast 911 cells. Gene Ther 2000; 7: 70-4.

30. Kondo S, Ishizaka Y, Okada T, et al. FADD gene therapy for malignant gliomas in vitro and in vivo. Hum Gene Ther 1998; 9: 1599-1608.

31. Thornberry NA, Lazebnik Y. Caspases: enemies within. Science 1998; 281: 1312-6.

32. Shinoura N, Koike H, Furitu T, Hashimoto M, Asai A, Kirino T, Hamada H. Adenovirus-mediated transfer of caspase-8 augments cell death in gliomas: implication for gene therapy. Hum Gene Ther 2000; 11: 1123-37.

33. Yamabe K, Shimitzu S, Ito T, Yoshioka Y, No- mura M, Narita M, Saito I, Kanegae Y, Matsuda H. Cancer gene therapy using a pro-apoptotic gene, caspase-3. Gene Ther 1999; 6: 1952-9.

34. Dong Y-B, Yang H-L, Elliott MJ, Liu T-J, Stilwell A, Atienza C Jr, McMasters KM. Adenovirus-mediated E2F-1 gene transfer efficiently induces apoptosis in melanoma cells. Cancer 1999; 86: 2021-33.

35. Liu T-J, Wang M, Breau RL, Henderson Y, El- -Naggar AK, Steck KD, Sicard MW, Clayman GL.

Apoptosis induction by E2F-1 via adenoviral-mediated gene transfer results in growth suppression of head and neck squamous cell carcinoma cell lines. Cancer Gene Ther 1999; 6: 163-71.

36. Noteborn MHM. Apoptin – induced apoptosis:

a review. Apoptosis 1999; 4: 317-9.

37. Murphy AL. Apoptin: nuclear switch triggers cancer cell death. Gene Ther 1999; 6: 713-4.

38. Zhuang SM, Shvarts A, Van Ormondt H, Jochem- sen AG, Van der Eb AJ, Noteborn MHM. Apop- tin, a protein derived from chicken anemia virus, induces p53-independent apoptosis in human oste- osarcoma cells. Cancer Res 1995; 55: 486-9.

39. Kleinberger T. Induction of apoptosis by adenovirus E4orf4 protein. Apoptosis, 2000; 5: 211-5.

40. Lavoie JN, Nguyen M, Marcellus RC, Branton PE, Shore GC. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J Cell Biol 1998; 140: 637-45.

41. Kleinberger T, Shenk T. Adenovirus E4orf4 protein binds to protein phosphatase 2A, and the complex down regulates E1A-enhaced junB transcription. J Virol 1993; 67: 7556-60.

42. Mountain A. Gene therapy: the first decade.

Trends Biotechnol 2000; 18: 119-28.

43. Kagawa S, Pearson SA, Ji L, Xu K, McDonnell TJ, Swischer SG, Roth JA, Fang B. A binary adenoviral vector system for expressing high le- vels of the proapoptotic gene bax. Gene Ther 2000; 7: 75-9.

44. Sutherland RM. Tumor hypoxia and gene expression. Implication for malignant progression and therapy. Acta Oncol 1998; 37: 567-74.

45. Brown JM. The hypoxic cell: a target for selective cancer therapy – eighteenth Bruce F. Cain memorial award lecture. Cancer Res 1999; 59: 5863-70.

46. Dachs GU, Tozer GM. Hypoxia modulated gene expression: angiogenesis, metastasis and therapeutic exploitation. Eur J Cancer 2000; 36: 1649-60.

47. Höckel M, Vaupel P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 266-76.

48. Brown JM, Giaccia AJ. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer Res 1998; 58: 1408-16.

49. Koshikawa N, Takenaga K, Tagawa M, Sakiy- ama S. Therapeutic efficaty of the suicide gene driven by the promotor of vascular endothelial grown factor gene against hypoxic tumor cells.

Cancer Res 2000; 60: 2936-41.

50. Takakura M, Kyo S, Kanaya T, Hirano H, Take- da J, Yutsudo M, Inoue M. Cloning of human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for transcriptional activation in immortalized and cancer cells. Cancer Res 1999; 59: 551-7.

51. Gu J, Kagawa S, Takakura M, Kyo S, Inoue M, Roth JA, Fang B. Tumor-specific transgene expression from the human telomerase reverse transcriptase promoter enables targeting of the therapeutic effects of the bax gene to cancers.

Cancer Res 2000; 60: 5359-64.

52. Brewis N, Phelan A, Webb J, Drew J, Elliott G, O'Hare P. Evaluation of VP22 spread in tissue culture. J Virol 2000; 74: 1051-6.

53. Ealovega MW, McGinnis PK, Sumantran VN, Clarke MF, Wicha MS. bcl-xs gene therapy induces apoptosis of human mammary tumors in nu- de mice. Cancer Res 1996; 56: 1965-9.

54. Pataer A, Fang B, Yu R, Kagawa S, Hunt KK, McDonnell TJ, Roth JA, Swisher SG. Adenoviral bak overexpression mediates caspase-dependent tumor killing. Cancer Res 2000; 60: 788-92.

55. O'Connor L, Strasser A, O'Reilly LA, Hausmann G, Adams JM, Cory S, Huang DCS. Bim: a novel member of the Bcl-2 family that promotes apoptosis. EMBO J 1998; 17: 384-95.

56. Noteborn MHM, De Boer GF, Van Roozelaar DJ i wsp. Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectio- us replication cycle. J Virol 1991; 65: 3131-9.

Praca zosta³a sfinansowana z grantu KBN nr 4P05A 046 15.

ADRES DO KORESPONDENCJI mgr in¿. IIwwoonnaa MMiittrruuss

Zak³ad Biologii Molekularnej Centrum Onkologii – Instytut im. M. Sk³odowskiej-Curie ul. Wybrze¿e Armii Krajowej 15 44-101 Gliwice

e-mail: mitrus@io.gliwice.pl