Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

Politechnika Śląska Wydział Chemiczny

Katedra Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii

Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

Opracował: mgr inż. Tadeusz Gorewoda

Gliwice 2007-09

1. Wstęp;

Już od prawie wieku drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae) są obecne w syntezie organicznej. Przez ten czas stały się one jednymi z najbardziej popularnych biokatalizatorów komórkowych, stosowanych w różnych typach reakcji. Jednym z szerszych zastosowań tych organizmów są reakcje redukcji. pośród tych reakcji można wymienić:

redukcje -ketoestrów, diketonów i ketokwasów; redukcje -hydroksyaldehydów i -hydroksyketonów do -dioli; redukcję związków zawierających wiązanie C=C;

redukcję aromatycznych i nienasyconych ketonów; redukcję związków nitrowych.¹ Wyżej

wymienione reakcje mogą zachodzić dzięki obecności w komórkach drożdży enzymów z grupy reduktaz.

Podczas ćwiczenia zostaną przeprowadzone reakcje:

a) Redukcji -ketoestru do -hydroksyestru;

b) Redukcji wiązania podwójnego węgiel – węgiel;

1.1 Redukcja -ketoestru do -hydroksyestru

Spośród reakcji redukcji przebiegających z udziałem drożdży piekarskich najszerzej

opisywaną grupą są redukcje -ketoestrów do -hydroksyestrów. Badania genomu S. cerevisiae wykazały 49 sekwencji kodujących białka zdolne do aktywności redukcyjnej.

Wykazano różnice pomiędzy działaniem poszczególnych enzymów, ich aktywnością stereoselektywnością. Używając do reakcji wydzielone enzymy uzyskiwano doskonałe selektywności (>90% ee, >90% de). Użycie całych komórek drożdżowych dało w niektórych

1 Servi S.; Synthesis 1990, 1-25

przypadkach nieco gorsze rezultaty.² Wiąże się to z faktem działania całej gamy enzymów.

Dodatkowo taka metoda charakteryzuje się większą objętością mieszaniny reakcyjnej i większym balastem, niż użycie pojedyńczych enzymów. Jednakże za użyciem całych

komórek drożdżowych przemawia istotny fakt, iż opisywane reakcje zachodzą z udziałem koezymu jakim jest NADPH (zredukowany fosforan dinukleotydu nikotyno- amidoadeninowego). Aby koenzym ten mógł się regenerować, wymagane jest dostarczenie drożdżom węglowodanów (np. glukozy).

R R₁

O R R₁

OH

R₂ R₃

O R₂ R₃

H OH

węglowodan

reduktaza

NADPH NADP⁺

Największą zaletą redukcji ketoestrów z użyciem drożdży jest selektywność reakcji.

W przypadku -niepodstawionych ketoestrów stwierdzono, iż wielkość podstawnika przy węglu C3 oraz podstawnika przy grupie estrowej wywiera istotny wpływ na enancjo- selektywność reakcji. Wybierając odpowiednie podstawniki można więc uzyskać produkt o pożądanej konfiguracji z wysokim nadmiarem enancjomerycznym. Poniżej przedstawiono kilka przykładów:

R₁ OR₂

O O

R₁ OR₂

OH O

R1 R2 produkt wydajność (%) ee(%)

CH₂Cl n-C₈H₁₇ (3R) 67 100

CH2Cl CH2CH3 (3S) - do 90

OBu-t CH₂CH₃ (3R) 75 97

Ph CH2CH3 (3S) - 100

Redukcja -podstawionych ketoestrów wiąże się dodatkowo z diastereoselekty- wnością (powstają dwa centra chiralne). Także w tym wypadku udało się uzyskać wysokie nadmiary enancjomeryczne i diastereomeryczne dzięki użyciu różnych podstawników w pozycjach 2, 3 oraz przy grupie estrowej.

2 Kaluzna I., Matsuda T., Sewell A. K., Stewart J. D.; J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 12827-12832.

R₁ OR₃

O O

R₂

R₁ OR₃ OH O

R₂

R₁ R₂ R₃ wydajność (%) ee(%) de(%)/konformer

CH3 CH3 CH2CH3 75 100 66 syn

CH₃ CH₂CH=CH₂ CH₂CH₃ 84 100 90 anti

CH3 CH3 n-C8H17 82 98 90 syn

CH2CH3 OH CH₂CH₃ 72 >90 80 anti

Redukcja ketonów do alkoholi w klasycznej preparatyce organicznej może odbywać się na kilka sposobów. Główne z nich to:

a) Reakcje z wodorkami metali. Najczęściej używanymi związkami są LiAlH4

(glinowodorek litu) oraz NaBH₄ (borowodorek sodu). Reakcja z użyciem LiAlH₄ jest dość ogólna - poza grupą karbonylową redukowane są także inne grupy obecne w substracie np. NO2, CN, COOR itd. Borowodorek sodu jest bardziej selektywny i nie redukuje grup takich jak NO₂ czy halogenowych. Dodatkową jego zaletą jest możliwość stosowania go w roztworach wodnych. Wodorki metali nie uwadarniają podwójnych ani potrójnych wiązań węgiel – węgiel (za wyjątkiem wiązań C=C sprzężonych z grupą COOR).

b) Redukcja z zastosowaniem wodoru gazowego i katalizatora (platyna, ruten, pallad, nikiel itp.). To rozwiązanie obciążone jest najmniejszą selektywnością – w tych warunkach zredukowane zostają także wiązania wielokrotne.

c) Reakcja z etanolanem sodu w alkoholu etylowym. Stosowana zanim odkryto LiAlH4, częściej stosowana do redukcji estrów niż ketonów.

d) Reakcja z diborowodorem B2H6.

Opisane układy przez lata zyskały wiele modyfikacji. Ich najczęstszym celem było uzyskanie chemoslektywności reakcji. Uzyskuje się ją dzieki stosowaniu różnych

warunków reakcji: kombinacji metal- jon wodorkowy, różnym katalizatorom i rozpuszczalnikom³. Jednakże stosowane wodorki metali, jak i katalizatory metaliczne są

drogim i nie raz niewygodnym w pracy surowcem. Także praca z wodorem niesie za sobą nibezpieczeństwo. Z tego względu drożdże piekarnicze w ostatnich latach nabierają znaczenia na tym polu syntezy. Ich atrybutami są niska cena, niskie temperatury reakcji (30-40^oC), zastosowanie wody jako rozpuszczalnika, aspekt ekologiczny.

Daje to podstawy do zastosowania S. cerevisiae na poziomie przemysłowym. Jednym z zastosowań drożdży jest chemo, regio i wysoce stereospecyficzna redukcja triketonu do

trimegestonu – leku podawanego w terapii chorób pomenopauzalnych.⁴

3 March J.; Chemia Organiczna 1975 WNT Warszawa

4 Crocq V., Masson Ch., Winter J.,Richard Ch., Lemaitre G., Lenay J., Vivat M., Buendia J., Prat D.;Organic Process Research & Development 1997, 1, 2-13

O

. O O

.

.

.

O

. OH O

.

.

. (S) S.cerevisiae

sacharoza, EtOH, H₂O

trime geston

Ćwiczenie:

Eksperyment obejmuje redukcję 2-metyloacetylooctanu etylu prowadzącą do mieszaniny (2R,2S) i (2S,3S)-2-metylo-3-hydroksymaślanu etylu w stosunku izomerów 3:1⁵.

.

O O

OEt CH₃

.

OH O

OEt CH₃

.

OH O

OEt CH₃

+

S.cerevisiae

30 st.C, 48 h, 65%, > 95% ee

3 : 1

Oczynniki:

 2-metyloacetooctanu etylu 0,5 g (3,85 mmol)

 drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae 30 g*

 sacharoza 7,5 g

 woda destylowana 100 ml

 Celite®

 Etanol

 Octan etylu

 MgSO4

Opis ćwiczenia:

 Umieścić drożdże, sacharozę oraz wodę w kolbie stożkowej (500ml), a następnie zatkać wylot kolby watą i umieścić w cieplarce (30-37 ^oC) na około 20 minut w celu zapoczątkowania fermentacji. Co 3 minuty energicznie wymieszać zawartość kolby.

 2-Metyloacetooctan etylu rozpuścić w 1ml etanolu i dodać jednorazowo do kolby z fermentującymi drożdżami. Pozostawić w cieplarce w temp. 30⁰C przez 48h **.

 Zakładając odpowiedni stopień przereagowania, reakcję należy przerywać wyciągając kolbę z cieplarki i dodając 2 łyżki celitu (dokładnie wymieszać). Tak przygotowaną mieszaninę pozostawić na ok. 15 min od czasu do czasu mieszając.

 Nastepnie odsącza się zawiesinę drożdży na lejku Büchnera poprzez 3 mm złoże celitu (jeżeli w przesączu są wyraźnie widoczne pozostałości drożdży operację należy powtórzyć). Doprowadzić odczyn przesączu do pH = 7 przy użyciu 2 molowego roztworu NaOH. Tak powstały żółty filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x60 ml). W przypadku trudności z rozdzielaniem warstw, należy mieszaninę wysolić NaCl lub/oraz odwirować. Zlane ekstrakty organiczne suszy się bezwodnym siarczanem magnezu, przesącza na lejku z sączkiem karbowanym,

5 Fràter G., Müller U., Günter W, Roberts S.M.(ed.); Preparative Biotransformations. Whole Cells and Isolated enzymes in Organic Synthesis, 1992, 2:1.1, Wiley, London.

a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej pozostałości produktu (produkt należy zważyć).

 Przebieg reakcji sprawdza się metodą TLC. W tym celu należy pobrać próbkę mieszaniny reakcyjnej i rozcieńczć ją w octanie etylu (C~ 25 mg/ml).

Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę eter naftowy - -eter dietylowy 3:1.

Jako wzorzec nałożyć roztwór substratu. Płytki obserwuje się pod lampą UV.

 Jeżeli Mieszanina nie zawiera wzorca, tylko produkt obliczyć wydajność teoretyczną i praktyczną reakcji. Literaturowa wydajność wynosi 70% mieszaniny (2R,3S)- i (2S,3S)-2-metylo-3-hydroksymaślanu etylu.

 Surowy produkt można oczyszczać metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny należy stosowac żel silikonowy, a jako eluent układ eter naftowy-eter dietylowy (3:1).

1.2 Redukcja podwójnego wiązania węgiel- węgiel

Redukcja wiązań typu C=C z użyciem drożdży jest istotną metodą syntezy chiralnych wielofunkcyjnych syntonów. Po raz pierwszy drożdże do tego celu uzyto już w latach 30 zeszłego stulecia. Istotny wpływ w takim uwodornieniu ma otoczenie wiązania C=C – istotny wpływ ma sąsiedztwo grupy karbonylowej lub wiązania podwójnego z deficytem elektronów bez których to reakcja nie zachodzi. Badania przeprowadzone w latach 70 dowiodły stereoselektywności redukcji z użyciem S. cerevisiae, w których ogólną zasadą była trans- stereospecyficzna addycja wodoru oraz wprowadzenie wodoru pro-(R) w centrum karbonylowym. Chemoselektywność enzymów drożdżowych została niejednokrotnie potwierdzona. Poniżej przytoczono kilka przykładów⁶⁷:

.

.

O

S.cerevisiae

eter naftowy

.

.

O (R)

76%

Me(CH₂)₄

O

(CH₂)₇CO₂Me

S.cerevisiae

Me(CH₂)₄

O

(CH₂)₇CO₂Me

74%

C H₃

H

NO₂ R

S.cerevisiae

H

NO₂ R

CH₃

50% 89-98% ee R=H, Cl, Br, NO₂

6Fuganti C., Griselli S.,Servi S., Hőgberg, Roberts S.M. (ed.); Preparative Biotransformations. Whole Cells and Isolated enzymes in Organic Synthesis, 1992, 2:7.1, Wiley, London.

7 Dumanski P.G., Florey P., Knetting M., Smallridge A.J.; J.Molec.Catal. B: Enzymatic 2001, 11, 905-908.

Redukcję wiązań C=C można rónież osiągnąć poprzez redukcję katalizowaną np. metalami grup przejściowych lub ich tlenkami (Ni Raneya, Pt2O, Pd, itd.) z użyciem gazowego wodoru. Istnieją także metody stosujące np. układy cynk i kwas, sód w etanolu, hydrazynę lub lit i aminę alifatyczną. Zwykle można przeprowadzić tymi metodami selektywną redukcję wiązań C=C (bez naruszenia innych obecnych w substratach grup (np. COOH, CHO, CN, itp.) jednakże wymaga to zastosowania warunków i substratów redukujących charakterystycznych dla danego związku³.

Ćwiczenie:

Celem ćwiczenia jest redukcja -metylo- -(2-furylo)akroleiny . Jako produkt otrzymuje się nasycony alkohol. Mechanizm tej reakcji jest trójetapowy : redukcja – utlenianie – redukcja.

Wyjściowy aldehyd pozostaje w równowadze z pochodną alkoholu allilowego, przy czym równowaga jest przesunięta w stronę alkoholu. Jednakże już małe (równowagowe) ilości

-metylo- -(2-furylo)akroleiny ulegają powolnej trans-addycji wodoru w poprzek wiązania podwójnego, do nasyconego aldehydu. Nasycony aldehyd jest wówczas szybko redukowany do nasyconego alkoholu.

.

O CHO

[H⁺]

[Ox]

.

OH szybko O

powoli

.

O CHO

szybko

.

OH O

72%, > 98% ee poprzez utlenianie

in situ do nienasyconego aldehydu.

Odczynniki:

 -metylo- -(2-furylo)akroleina 0,45 g, (0.003 mola)

 drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae 12 g*

 glukoza 4.0 g

 woda destylowana 80 ml

 Celite®

 Etanol

 Octan etylu

 MgSO_{4 bezw.}

 nasycony r-r węglanu sodu

 2M kwas solny Opis ćwiczenia:

 Umieścić drożdże, glukozę oraz wodę w kolbie stożkowej (500ml), a następnie zatkać wylot kolby watą i umieścić w cieplarce (30-37 ^oC) na około 45 minut w celu zapoczątkowania fermentacji. Co 5 minut energicznie wymieszać zawartość kolby.

 pH fermentującej mieszaniny powinno być następnie podniesione z 4 do ok. 5.5 poprzez dodanie nasyconego r-ru węglanu sodu (ok.3-4 ml).

 Do tak przygotowanej mieszaniny należy dodać roztwór wyjściowego aldehydu w etanolu (2ml) i delikatnie mieszać w temperaturze pokojowej. Operację należy wykonywać pod wyciągiem.

 Co 12 – 15 godzin należy sprawdzać pH mieszaniny. Ewentualnie w celu obniżenia pH do wartości ok. 5 posłużyć się roztworem kwasu solnego.

 Po ok. 48 h, zakładając wysoki stopień przereagowania, należy przerwać reakcję dodając dwie łyżki celitu **. Mieszaninę pozostawić na ok. 30 min od czasu do czasu mieszając. Następnie odsączyć zawiesinę na lejku ze Büchnera poprzez 3 mm złoże celitu (jeżeli w przesączu są wyraźnie widoczne pozostałości drożdży operację należy powtórzyć). Klarowny, brązowawy filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4 x 70 ml). Zlane ekstrakty octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu a następnie przesącza na lejku z sączkiem karbowanym.

Przesącz odparowuje się na wyparce rotacyjnej (T = 30 ^oC), do uzyskania żółtego oleistego produktu. Skład mieszaniny należy skontrolować metodą TLC. Próbkę przygotować wg procedury z poprzedniej syntezy. Jako układ rozwijający stosuje się chlorek metylenu. Płytki obserwu się pod lampą UV przy długości fali 254 nm.

Ponieważ aldehyd szybko przechodzi w nienasycony alkohol, na płytce przy Rf~0.38 mogą być widoczne 2 plamy w kształcie ósemki (nasycony i nienasycony alkohol). Świadczy to o niecałkowitym przereagowaniu substratu. Jeżeli obecna jest tylko 1 plamka przy Rf=0.34 – pochodząca od produktu, można uznać całkowite przereagowanie. Wówczas należy obliczyć wydajność teoretyczną oraz praktyczną. (S)-3-(2-Furylo)-2-etylo-1-propanol uzyskuje się z literaturową wydajnością 49%.

 Produkt można oczyszczać metodą chromatografii kolumnowej, używając jako eluenta chlorku metylenu.

*Jeżeli używane są drożdże piekarnicze z pożywką doliczyć ok. 50% masy

**Na tym etapie mieszaninę reakcyjną można zamrozić i przerabiać po kilku dniach.