Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich. Terapia genowa chorób nowotworowych na przykładzie czerniaka

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich

Studium Kształcenia Podyplomowego Wydziału Farmaceutycznego

Agata Joanna Turek

Terapia genowa chorób nowotworowych na przykładzie czerniaka

praca poglądowa w ramach specjalizacji z farmacji klinicznej

Kierownik Specjalizacji mgr farm. Anna Kilian-Weber

Warszawa, 2022

Wprowadzenie

Czerniak skóry (ang. Melanoma, Melanoma Malignum) to nowotwór złośliwy pochodzenia nabłonkowego, charakteryzujący się wysoką umieralnością. Częstość zachorowań w Polsce w 2018 r. wynosiła u mężczyzn 2,1%, natomiast u kobiet 2,3%. W tym samym roku odnotowano liczbę zgonów na poziomie 1,4% u mężczyzn, a u kobiet 1,44% [1].

Etiologia

Powstanie nowotworu skóry jest związane z wpływem różnych czynników na organizm człowieka. Wyróżniamy czynniki środowiskowe, które obejmują promieniowanie nadfioletowe światła słonecznego (głównie UVB, ale także UVA). Szczególnie niebezpieczne są krótkotrwałe, intensywne ekspozycje na promieniowanie słoneczne (także sztuczne), powtarzane wielokrotnie w młodym wieku, skutkujące poparzeniem [2]. Jego mechanizm działania polega na hamowaniu inicjacji odpowiedzi immunologicznej w naskórku poprzez supresję komórek Langerhansa oraz na zmianach w genomie, np. mutacji w genach: p53, protoonkogenu B-Raf (BRAF, ang. B-Raf proto-oncogene), neurofibrominy 1 (NF1, ang. neurofibromin 1) czy NRAS (ang. NRAS proto-oncogene, GTPase) [3,4].

Mutacje wynikają z pobudzania przez promieniowanie UVB tworzenia kowalencyjnych wiązań pomiędzy sąsiednimi pirymidynami w kwasach nukleinowych, co skutkuje powstawaniem mutagennych produktów [5].

Istotne są także czynniki endogenne takie, jak: rasa biała, I i II typ skóry wg Fitzpatricka, niebieskie oczy, jasne bądź rude włosy, posiadanie dużej ilości zmian skórnych oraz atypowych zmian barwnikowych. Kontakt ze związkami chemicznymi, np. arsenem, smołą pogazową, psolarenami zwiększa ryzyko wystąpienia choroby [6,7]. Do innych czynników można zaliczyć: wirusy np. HPV, rogowacenie słoneczne, zaburzenia genetyczne (skóra pergaminowa), nowotwór skóry w wywiadzie własnym bądź rodzinnym [7].

Obraz kliniczny

Czerniak to nowotwór wywodzący się z melanocytów – komórek obecnych w warstwie podstawnej naskórka. Umiejscowienie zmiany może obejmować nie tylko skórę, ale także błony śluzowe odbytnicy, jelit, narządów płciowych, jamy ustnej bądź obręb gałki ocznej –

3 spojówkę, powiekę a nawet wnętrze gałki. Dotyczy przeważnie kobiet, u których lokalizuje się często na kończynach (u mężczyzn – na tułowiu). Mediana wieku zachorowania wynosi 50 lat [7].

Zróżnicowanie struktury tego nowotworu pozwala na usystematyzowanie jego typów (uwzględniając obraz kliniczny oraz histologię i częstość występowania) w następujący sposób:

o czerniak szerzący się powierzchownie (SSM, ang. Superficial Spreading Melanoma) – występuje u 50-75% chorych. Początkowa zmiana jest płaska, posiada nieregularne granice. Zabarwienie czarne bądź brązowe (ew. odcienie różowego/niebieskiego). Przez dłuższy okres czasu rośnie w naskórku oraz warstwie brodawkowatej skóry właściwej. Przerzuty występują w sytuacji naciekania kolejnych warstw skóry.

o czerniak guzkowy (NM, ang. Nodular Melanoma) – 10-15%, często już w momencie rozpoznania obserwuje się przerzuty do głębszych warstw skóry.

o czerniak wychodzący z plamy soczewicowatej (LMM – ang. Lentigo Maligna Melanoma) – ok. 10% chorych. Cechuje się długim okresem rozwoju, wynoszącym 10-25 lat.

o czerniak dystalny (ALM, ang. Acral Lentiginous Melanoma) – 5-10%

przypadków; rozwija się na wewnętrznej stronie dłoni, podeszwach stóp oraz pod płytką paznokcia; daje szybko przerzuty, gdy rozwój nowotworu przechodzi w fazę wertykalną.

o czerniak bezbarwnikowy (ang. melanoma amelanoticum) – bezbarwny lub różowy guzek, występuje bardzo rzadko i jest trudny do zdiagnozowania.

o czerniak niesklasyfikowany – wykazuje cechy SSM oraz NM [2].

Rycina 1. Przykładowy obraz kliniczny melanoma [8].

Obraz kliniczny czerniaka wykazuje asymetrię i zróżnicowanie zabarwienia – może być bezbarwne bądź w odcieniach brązu, czerni. Jego powierzchnia może być niejednolita.

Miejscowo zaawansowany czerniak może posiadać dodatkowo owrzodzenie i krwawić.

Przerzuty są tworzone z wykorzystaniem naczyń krwionośnych oraz limfatycznych.

Komórki nowotworowe docierają nie tylko do sąsiednich węzłów chłonnych, ale także pozaregionalnych, a nawet do narządów odległych takich, jak: kości, płuca, mózg, wątroba [6,7]. Często dają wznowy miejscowe, które mogą pojawić się w każdym stadium choroby [9,10].

Diagnostyka

Wstępna diagnostyka obejmuje wywiad chorobowy oraz badanie skóry całego ciała.

W wywiadzie powinny się pojawić pytania dotyczące stanu skóry oraz ewentualnej ekspozycji na czynniki predysponujące oraz występowania przypadków zachorowań w rodzinie. Elementem diagnostyki jest również badanie z użyciem dermatoskopu, badanie histopatologiczne, biopsja wycinająca zmiany skórnej oraz badania dodatkowe (np.

oznaczanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej LDH, ultrasonografia regionalnych węzłów chłonnych, tomografia komputerowa) [9].

Do określenia stopnia zaawansowania klinicznego oraz patologicznego melanoma stosuje się system utworzony w 2010 r. przez Amerykański Wspólny Komitet ds. Raka (AJCC). Klasyfikacja według TNM (ang. Tumor, Nodus, Metastases), którą przedstawia Rycina 2, stosowana jest także w ewaluacji innych nowotworów skóry [9,11].

Oceny zaawansowania dokonuje się, analizując: głębokość nacieku, obecność owrzodzenia, status węzłów chłonnych i lokalizację przerzutów. System TNM pozwala na przyporządkowanie danego przypadku do odpowiedniego stopnia klinicznego, dodatkowo umożliwia określenie czynników rokowniczych, a także dopasowanie terapii do pacjenta [9].

5

Rycina 2. Klasyfikacja oceny zaawansowania według TNM i stopniowanie kliniczne [9, zmienione].

Leczenie

U chorych leczeniem z wyboru jest leczenie chirurgiczne. Po rozpoznaniu, rozstrzyga się czy niezbędna jest całkowita ekstrakcja blizny po biopsji wycinającej. Odpowiednie marginesy kliniczne określono w zaleceniach m.in. Europejskiego Towarzystwa Onkologii Medycznej (ESMO, ang. European Society of Medical Oncology) [11].

Następnym krokiem jest ocena węzłów regionalnych i wykonanie limfadenektomii w przypadku wykrycia przerzutów. Inne metody leczenia, takie jak radioterapia czy zastosowanie interferonu α-2b (IFN α-2b), stanowią uzupełnienie terapii podstawowej i są stosowane tylko w określonych sytuacjach i dobierane indywidualnie do pacjenta [9].

Mimo wdrożonego leczenia, prawdopodobieństwo przeżycia pacjentów z przerzutami do narządów odległych jest obecnie dosyć niskie (5–letnie przeżycie dotyczy tylko 10% z nich). W IV stopniu klinicznym rokowanie zależy ściśle od lokalizacji przerzutów oraz aktywności LDH. Na podstawie badań obrazowych kwalifikuje się chorego do leczenia chirurgicznego (gdy nawrót choroby obejmuje skórę, tkanki miękkie czy węzły

chłonne), leczenia systemowego bądź paliatywnego. Obecnie w uogólnionym czerniaku stosuje się leczenie ukierunkowane molekularnie, immunoterapię, rzadko chemoterapii [9].

Chemioterapia z użyciem dakarbazyny znajduje zastosowanie tylko w przypadku nieudanego leczenia innymi terapiami systemowymi. Posiada określony schemat podawania (5 dni, 200 mg/m² dziennie). Terapia wykazuje ograniczoną efektywność, niewielki odsetek pacjentów odpowiada na leczenie, a sama odpowiedź nie jest trwała. Jest to jedyny lek cytotoksyczny stosowany w uogólnionej postaci melanoma [9].

Komórki nowotworowe posiadają zdolność do obrony przed układem immunologicznym człowieka poprzez naśladowanie fizjologicznych mechanizmów hamujących tę odpowiedź. Wykazano, iż w melanoma dochodzi do nadekspresji ligandów programowanej śmierci 1 i 2 (PD-L1, PD-L2; ang. Programmed Death-Ligand 1, 2), które w wyniku połączenia z receptorem programowanej śmierci 1 (PD-1, ang. Programmed Death Receptor) redukują aktywność limfocytów T, tym samym nadmiernie blokując ich odpowiedź obronną, także przeciwnowotworową. Do terapii zaawansowanego czerniaka wprowadzono zatem przeciwciała anty-PD-1 i anty-PD-L1, a także przeciwciała anty- CTLA-4 (ang. Anti-Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4 Antibodies) [12,13].

Jedyne zarejestrowane przeciwciało monoklonalne anty-CTLA-4 to ipilimumab, który stosuje się w uogólnionych przypadkach melanoma. Efekt działania obserwuje się dopiero po kilku miesiącach leczenia, dlatego przeznaczony jest dla pacjentów sprawnych, wykazujących nieznaczne objawy. Ipilimumab podawany jest drogą dożylną. Działania niepożądane wynikają z reakcji autoimmunologicznych. Odpowiedź na leczenie wykazuje niewielka część chorych, jednak zaobserwowano u nich wydłużenie czasu przeżycia [9].

Aktualnie główną grupą leków są przeciwciała anty-PD-1/PD-L1 i według zaleceń stanowią podstawową immunoterapię u pacjentów z uogólnionym melanoma. U chorych stosuje się monoterapię pembrolizumabem lub niwolumabem. Preparaty te są bardziej skuteczne niż ipilimumab, istotnie wydłużają parametr PFS, czyli czas przeżycia wolny od progresji, odsetek osób reagujących na terapię jest większy (~50%) [14].

Mutacje w genach kodujących kinazy aktywowane mitogenami (MAPK, ang. Mitogen- Activated Protein Kinases) wykrywa się u około 75% przypadków melanoma. Skutkują one nadaktywnością szlaku RAS/RAF/MAPK, co wynika głównie z mutacji genu BRAF, której częstość występowania waha się między 37 a 50%. Mutacje mogą wystąpić także w innych onkogenach takich, jak: NRAS, NF1 czy KIT [15]. Kinazy MAP odgrywają istotną rolę w

7 komórce, mają wpływ na ekspresję genów, podziały i migrację komórek, a także ich różnicowanie oraz apoptozę. Ich nadmierna aktywacja jest krytycznym elementem patogenezy wielu nowotworów złośliwych [16].

Obecnie w Polsce stosowane są dwa inhibitory BRAF – wemurafenib oraz dabrafenib. Stosuje się je tylko u chorych o uogólnionym stopniu zaawansowania choroby z potwierdzoną w badaniach genetycznych mutacją genu BRAF. Oba leki istotnie wpływają na odsetek przeżyć całkowitych, przewyższając te obserwowane w innych grupach leków.

Niestety pacjenci często się na nie uodparniają, ponadto są toksyczne dla skóry – wywołują reakcje nadwrażliwości na światło słoneczne [9].

Innym lekiem ukierunkowanym molekularnie jest trametynib – inhibitor MEK, którego efektywność zaobserwowano zarówno u chorych z mutacją BRAF, jak i NRAS [17]. Korzystne okazuje się także jego połączenie z inhibitorem BRAF, które wydłuża okres przeżycia aż do 20–25 miesięcy (sam dabrafenib przedłuża do 18,2 miesiąca) [18].

Inhibitory BRAF powodują szybką reakcję organizmu na terapię, stąd są wskazane u osób z objawami klinicznymi choroby oraz znaczną masą guza, a także u pacjentów z podwyższonym poziomem LDH, który koreluje ze wzrostem złośliwości nowotworu [9].

W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań nad potencjalnym zastosowaniem terapii genowej w czerniaku. Dotyczyły one możliwości wprowadzenia genu terapeutycznego lub genu samobójczego do komórek z użyciem nośników, hamowania ekspresji onkogenów z wykorzystaniem sekwencji antysensownych, zastosowania szczepionek przeciwnowotworowych, zwiększania aktywności przeciwnowotworowej limfocytów cytotoksycznych poprzez wprowadzenie genów cytokin lub wykorzystania wirusów onkolitycznych [19].

Terapia genowa i wybrane strategie

Terapia genowa to metoda leczenia, której celem jest korekcja bądź kompensacja defektów genetycznych będących przyczyną danego schorzenia lub hamowanie ekspresji nieprawidłowego genu. Obejmuje wprowadzenie z wykorzystaniem odpowiednich nośników genu terapeutycznego do organizmu, gdzie gen ten ulega ekspresji i w konsekwencji uzyskuje się zamierzony efekt fenotypowy. Transfer genu może odbywać się według strategii in vivo lub ex vivo (Rycina 2). Terapia in vivo opiera się na bezpośrednim dostarczeniu genu do organizmu pacjenta np. doguzowo czy systemowo, natomiast ex vivo wiąże się z pobraniem komórek od pacjenta, ich hodowlą, modyfikacją genetyczną i ponownym wprowadzeniu do organizmu, z którego zostały odseparowane.

Transferu genu można dokonać dzięki zastosowaniu zrekombinowanych wektorów wirusowych bądź niewirusowych. Jako wektory wirusowe stosuje się pochodne adenowirusów, retrowirusów, herpeswirusów, lentiwirusów oraz wirusy towarzyszące adenowirusom. Innym sposobem wprowadzania transgenu jest transfekcja komórek przy użyciu nagiego bądź plazmidowego DNA (ang. deoxyribonucleic acid) lub zastosowanie metod fizycznych, np. elektroporacji, ultrasonografii czy pistoletu genowego. Plazmidowe DNA może występować w postaci kompleksu z tzw. syntetycznymi nośnikami DNA [20,21].

Rycina 3. Strategie w terapii genowej [20, zmienione].

9 Głównym przedmiotem zainteresowania w terapii genowej są choroby nowotworowe, choroby monogenowe (np. hemofilia typu A) oraz układu krążenia. Przeprowadzane na świecie próby kliniczne dotyczą także innych jednostek chorobowych – chorób neurodegeneracyjnych czy infekcyjnych [22].

Nowotwory Padaczka

Wrodzone niedobory odporności

(np. ciężki złożony niedobór odporności związany z brakiem dezaminazy adenozyny)

Choroby naczyń (np. choroba wieńcowa)

Hemofilia Dystrofia mięśniowa Duchenne’a

Mukowiscydoza Choroba Parkinsona

AIDS Choroba Alzheimera

Reumatoidalne zapalenie stawów Degeneracja siatkówki Hemoglobinopatie

Tabela 1. Przykłady prób klinicznych terapii genowej w wybranych schorzeniach [23, zmienione]

Zainteresowanie terapią genową jest ogromne i wynika z jej prostych, lecz obiecujących założeń. Leczenie z wykorzystaniem tej terapii może polegać na: eliminacji komórek (np.

za pomocą genów samobójczych), kompensacji defektu genetycznego, hamowaniu ekspresji nieprawidłowego genu (np. poprzez wykorzystanie antysensownych oligonukleotydów czy niskocząsteczkowego interferującego RNA (siRNA, ang. small interfering ribonucleic acid), korekty mutacji (np. za pomocą jednoniciowych fragmentów DNA) czy modulacji genetycznej komórek, skutkującej uzyskaniem nowych cech fenotypowych (np. po wprowadzeniu genów immunomodulacyjnych, antyangiogennych lub po zastosowaniu szczepionek DNA i RNA) [19,20].

W Polsce istotnym punktem dla inżynierii genowej było zawarcie przekazu genowego w Farmakopei VIII. Można w niej znaleźć informacje na temat metodologii transferu genów, wektorologii i preparatów genowych. Pojawiają się one w rozdziale „Produkty lecznicze przenoszenia genu do stosowania u ludzi”. Obowiązująca obecnie Farmakopea XI także posiada ten zapis, poszerzony o metody badania preparatów, oznaczanie zawartości i wymagania ogólne dotyczące produktów biologicznych. Obecność takich informacji świadczy o użyteczności terapii, standaryzuje wymagania jakościowe dotyczące formulacji genowych.

Aktualnie preparaty genowe są głównie podawane w formie iniekcji. Drogi podania obejmują: podanie domięśniowe, dożylne, dojamowe, doguzowe a także śródskórne.

Badania eksperymentalne zwracają także uwagę na możliwość zastosowania innych postaci leku – donosowych, inhalacyjnych, a nawet półstałych [24].

Zastosowanie terapii genowej wydaje się być obiecującą metodą leczenia, jednak wymaga ona udoskonalania, ponieważ wiąże się z pewnymi ograniczeniami. Podstawowymi problemami terapii genowej są: immunogenność wektora, jego niestabilność w organizmie, mutacje insercyjne czy ograniczony czas ekspresji transgenu [20,21].

Wektory wirusowe

Wektory wirusowe są najczęściej stosowanymi nośnikami, wykazującymi dużą zdolność transdukcyjną. Do badań dotyczących chorób skórnych są one przeważnie opracowywane z użyciem adenowirusów, retrowirusów oraz wirusów związanych z adenowirusami. W Tabeli 2 przedstawiono porównanie najczęściej stosowanych wirusów w próbach klinicznych.

Genom zrekombinowanego wektora częściowo lub w całości zastępuje się genem terapeutycznym. Nie posiada on genów odpowiedzialnych za replikację oraz/lub genów kodujących białka otoczki. Zmodyfikowanego wirusa otrzymuje się z wykorzystaniem komórek pakujących oraz plazmidowego wektora. Komórki pakujące są to komórki, do których zostały wprowadzone geny nieobecne w wektorze, kodujące białka wirusowe. W nich umieszcza się wektor, z którego po uzyskaniu otoczki powstają wiriony niezdolne do replikacji poza komórkami pakującymi, lecz efektywnie infekujące tkanki docelowe [20].

Proces konstruowania wektora wirusowego omówię na przykładzie wirusów towarzyszących adenowirusom.

11

Wektor Zalety Wady i ograniczenia

Wektory niewirusowe:

Plazmidowe DNA Kompleksy DNA z lipidami,

polimerami, białkami itp.

 Możliwość transferu dużych fragmentów DNA

 Niska immunogenność

 Łatwość produkcji

 Wysoki poziom bezpieczeństwa

 Niska efektywność transferu

 Krótkotrwała ekspresja

Adenowirusy

 Możliwość transdukcji komórek niedzielących się

 Wysoka efektywność transferu i łatwość produkcji w wysokich mianach

 Możliwość transferu dużych fragmentów DNA

 Krótkotrwała ekspresji

 Wysoka immunogenność

Retrowirusy

 Długotrwała ekspresja

 Niska immunogenność

 Możliwość transdukcji tylko komórek dzielących się

 Niska efektywność transferu

 Możliwość transformacji nowotworowej

 Trudna produkcja w wysokich mianach

Lentiwirusy

 Możliwość transdukcji komórek niedzielących się

 Długotrwała ekspresja

 Niska immunogenność

 Obawy związane z bezpieczeństwem

Wirusy związane z adenowirusami (AAV)

 Możliwość transdukcji komórek nie dzielących się

 Długotrwała ekspresja

 Brak patogenności

 Niska immunogenność

 Ograniczona przestrzeń akomodacji transgenu (4.7 kb)

 Możliwość transformacji nowotworowej

 Trudna produkcja w wysokich mianach

Tabela 2. Porównanie najczęściej stosowanych wirusów w próbach klinicznych melanoma [19].

Adenowirusy (Ad – ang. Adenoviruses)

Adenowirusy posiadają białkowy kapsyd, w którym zamknięta jest liniowa cząsteczka dwuniciowego DNA – dsDNA (ang. double-stranded DNA). Często wykorzystuje się je w próbach klinicznych, w szczególności wektory będące pochodnymi wirusów ludzkich o serotypie Ad2 oraz Ad5. Podziału na serotypy dokonuje się na podstawie cech antygenowych danego podtypu wirusa. Infekują komórki zarówno dzielące się, jak i nie dzielące się. Nie integrują się z genomem gospodarza, w związku z czym nie istnieje ryzyko powstawania mutacji inercyjnych. Inną ich zaletą jest możliwość otrzymywania preparatów o wysokim mianie, a także wysoka skuteczność transdukcji in vivo oraz ex vivo. Produkcja wektorów Ad jest relatywnie prosta, a pojemność insercyjna sięga 30 kpz [20].

Mimo wielu zalet, wektory te charakteryzują się wysoką immunogennością i cytotoksycznością – układ immunologiczny odpowiada na białka wirusa oraz komórki zainfekowane, zatem preparaty zawierające adenowirusy nie mogą być podawane wielokrotnie. W konsekwencji ekspresja transgenu jest ograniczona [19,20]. Wykazano, iż w skórze efekt transdukcji utrzymuje się dość krótko (~2 tygodnie).

W 2008 r. opublikowano wyniki fazy I oraz II badań klinicznych nad wektorem adenowirusowym, niosącym gen kodujący interleukinę 2 (IL-2). Preparat podawano w postaci iniekcji bezpośrednio do zmiany patologicznej. IL-2 pobudza proliferację limfocytów T i wywołuje regresję przerzutów. Taka terapia miałaby potencjalne zastosowanie w czerniaku z przerzutami oraz w innych, zaawansowanych guzach litych. U niektórych pacjentów zaobserwowano pełną odpowiedź na leczenie [25].

Adenowirusy wykorzystano również w badaniu Tonga i wsp., za pomocą którego doguzowo wprowadzano pacjentom w zaawansowanym stadium choroby gen mda-7 (ang.

melanoma differentiation associated gene – 7), który jest genem supresorowym, stymulującym apoptozę komórek oraz odpowiedź immunologiczną. U wszystkich pacjentów wykazano skuteczny transfer genu po podaniu preparatu oraz zwiększony poziom czynników aktywujących układ immunologiczny [26].

Cytotoksyczność i immunogenność wektorów adenowirusowych jest testowana w wielu badaniach klinicznych [27]. Replikacja adenowirusa w komórkach zależy od aktywności dwóch białek regulatorowych – E1a i E1b, kodowanych przez geny E1. Tę zależność wykorzystano w badaniu preparatu Onyx-015, w którym wektor zawierał dziki gen p53 oraz zmodyfikowany gen E1b, pozwalający na replikację wirusa w komórkach pozbawionych

13 prawidłowo funkcjonującego białka p53, czyli w komórkach nowotworowych, co skutkowało indukcją apoptozy. Tak skonstruowane wirusy nazywamy warunkowo replikującymi adenowirusami. Inne strategie obejmują zastosowanie wektora uzbrojonego w ligand czynnika martwicy nowotworów indukującego apoptozę (TRAIL, ang. Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) lub geny kodujące interferon β [19].

Retrowirusy/ lentiwirusy

Materiałem genetycznym retrowirusów jest jednoniciowe RNA – ssRNA (ang. single- stranded RNA), otoczone lipidową otoczką. W terapii genowej znajduje zastosowanie rodzina retrowirusów obejmująca lentiwirusy oraz onkoretrowirusy, czyli pochodne retrowirusów typu C ptaków i ssaków. Przykładem lentiwirusa jest ludzki wirus niedoboru odporności (HIV-1 – ang. Human Immunodeficiency Virus 1). Cykl życiowy retrowirusów różni się od innych grup, ponieważ wbudowanie materiału genetycznego wirusa do genomu gospodarza musi poprzedzać przepisanie RNA na DNA. Jest to możliwe dzięki obecności charakterystycznego enzymu – odwrotnej transkryptazy [20].

Wektory będące pochodnymi retrowirusów posiadają pojemność sięgającą 9 kpz.

Zapewniają długotrwałą ekspresję genu, ponieważ integrują się z genomem komórek docelowych (przypadkowo), co w konsekwencji może także prowadzić do powstania mutacji insercyjnych. Fakt ten może wpływać ograniczająco na zastosowanie wektora w terapii genowej. Inne obostrzenia wynikają z infekowania tylko komórek dzielących się i zastosowania do transdukcji ex vivo [20,28].

W przeciwieństwie do wektorów retrowirusowych, wektory lentiwirusowe są zdolne do transdukcji komórek nie dzielących się. Konstruowane są w większości na bazie wirusa HIV-1, który wykazuje tropizm do limfocytów. Modyfikacje wektorów umożliwiają rozszerzenie zakresu typów infekowanych komórek – lentiwirusy z dużą wydajnością wprowadzają transgeny do komórek macierzystych. Posiadają podobną pojemność insercyjną co retrowirusy i zapewniają długotrwałą ekspresję genów. Ograniczenie zastosowania może wynikać z trudności w projektowaniu takiego wektora i wysokich jego kosztów [20,21].

Istotnym badaniem, wykorzystującym wektor retrowirusowy i geny samobójcze, było jednoczesne podanie pacjentom z melanoma gancyklowiru oraz komórek zainfekowanych gammawirusem, zawierającym gen kodujący kinazę tymidynową. Kinaza tymidynowa to enzym, aktywujący fosforylację proleku – gancyklowiru – w aktywną postać, indukującą

śmierć komórek zainfekowanych wirusem (w tym komórek nowotworowych). Terapia była dobrze tolerowana, jednak po odstawieniu wirostatyku zaobserwowano ponowny wzrost guza [19,29].

Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV – ang. Adeno-Associated Viruses) AAV należą do rodziny ludzkich parwowirusów, a ich genom stanowi jednoniciowe DNA – ssDNA (ang. single-stranded DNA) obejmujące około 4700 pz. Genom wirusa składa się z następujących fragmentów: gen rep oraz cap, promotorów (p5, p19, p40) oraz krótkich sekwencji o długości 145 nukleotydów znajdujących się na obu końcach ssDNA – tak zwanych odwróconych powtórzeń końcowych, inaczej itr (ang. inverted terminal repeats). Gen rep jest odpowiedzialny za kodowanie białek regulatorowych Rep40, Rep52, Rep68, Rep78, natomiast gen cap – białek otoczki VP1, VP2, VP3. Sekwencje itr pełnią istotną rolę w replikacji, integracji oraz pakowaniu genomu wirusa. Promotory p5, p19 odpowiadają za ekspresję białek regulatorowych, natomiast promotor p40 za powstawanie białek kapsydu [30,31].

AAV nie są wirusami chorobotwórczymi [20]. Do replikacji wymagają obecności wirusa pomocniczego, którym najczęściej jest adenowirus. Jego obecność w cyklu życiowym AAV umożliwia skuteczne namnażanie się w komórkach gospodarza. Cechą wyróżniającą AAV jest tropizm tkankowy (Tabela 2), a także zdolność integracji własnego genomu do chromosomu 19. człowieka (19q13.4), którą tym samym można nazwać miejscowo-specyficzną [31,32].

Nerki AAV2, AAV10, AAV11

Płuca AAV2, AAV5*, AAV6, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12**

(* - górne drogi oddechowe, ** - jama nosowa)

Trzustka AAV8, AAV9

Tkanka limfatyczna AAV10, AAV11

Żołądek AAV11

Gruczoły ślinowe AAV12

Macica AAV10

Ucho AAV3

Oko (fotoreceptory)

AAV5

15 Tabela 2. Przykłady tropizmu tkankowego AAV [31, zmienione].

Obecnie poznano dwanaście serotypów AAV, w tym najlepiej serotyp 2 (AAV2 - ang.

Adeno-Associated Virus type 2). Znajomość właściwości danych serotypów umożliwia projektowanie rekombinowanych wektorów, specyficznych dla prowadzonego badania klinicznego [33].

Uzyskanie rAAV, czyli rekombinowanego wektora, wiąże się z wprowadzeniem do komórek pakujących genów wirusa w formie plazmidów. Otrzymuje się je poprzez klonowanie molekularne. Plazmidy AAV (pAAV) zawierają geny rep, cap oraz transgen oflankowany sekwencjami itr. Wprowadza się je do komórek z lini komórkowych HEK293, HeLa czy A549, które ponadto infekuje się wirusem pomocniczym np. adenowirusem Ad5 [32]. Wyizolowanie powstałych wirionów jest możliwe np. dzięki wirowaniu w gradiencie gęstości CsCl [20,32]. Schematyczny przebieg konstruowania rAAV przedstawiono na Rycinie 3.

Atrakcyjność wektorów AAV wynika nie tylko z ich zdolności do integracji z genomem komórek, lecz także z transdukowaniem zarówno komórek dzielących się, jak i nie dzielących. Wykazano, iż istnieje powinowactwo serotypu 2 do mysich oraz pierwotnie ludzkich keratynocytów w trójwymiarowych hodowlach skóry, co może mieć potencjalne zastosowanie kliniczne [34]. Nie indukują odpowiedzi immunologicznej, a ekspresja genu terapeutycznego jest długotrwała. Problemy związane z wykorzystaniem tych wektorów mogą wynikać z ryzyka wystąpienia mutacji insercyjnych lub zanieczyszczenia preparatu wirusem pomocniczym, a także trudnej konstrukcji, kontroli jakości i małej pojemności kodującej (<5 kpz) [20,24].

Rycina 4. Schemat konstrukcji wektorów AAV [32, zmienione].

17 W 2018 roku Lee i wsp. wykorzystali do swoich badań AAV2 zawierający gen kodujący białko proapoptotyczne BCL2L11 (ang. B-cell lymphoma 2 like protein 11), które wykorzystuje HSPG (ang. Heparan Sulfate Proteoglycans) jako główne receptory do wykrywania komórek charakteryzujących się jego nadekspresją. HSPG są istotnym elementem cyklu życiowego AAV – umożliwiają wnikanie wirusa do komórek. Oprócz wektora preparat zawierał 6-gingerol – związek pochodzenia roślinnego. Wyniki tego badania okazały się obiecujące - w warunkach in vitro wywołano apoptozę w ludzkich komórkach czerniaka [35].

Wektory niewirusowe

Wektory niewirusowe posiadają kilka zalet, m.in. względnie niski koszt produkcji, małą toksyczność i immunogenność, dużą pojemność kodująca oraz stabilność. Ponadto charakteryzuje je mała wydajność transfekcji in vivo, brak integracji z genomem gospodarza oraz przejściowa ekspresja transgenu, która może być pożądana w leczeniu ran bądź regeneracji kości. W przypadku mutacji skutkujących utratą funkcji białek, można zastosować w terapii genowej plazmidowe DNA (pDNA) bądź RNA kodujące nieprawidłowy gen, natomiast mutacje związane z nadaktywnością białek lub uzyskaniem przez nie nowej funkcji wymagają zastosowania siRNA czy mikro-RNA [23].

Plazmidowe DNA

Najprostszą formą nośnika transgenu a zarazem najlepiej udokumentowaną jest pDNA.

Otrzymuje się go z bakterii, co skutkuje obecnością genu oporności na antybiotyki w jego strukturze (np. na ampicylinę lub kanamycynę). Elementami pDNA zapewniającymi odpowiednią ekspresję transgenu w komórkach są tkankowo-specyficzny promotor oraz wzmacniacz. Pozostałe podstawowe fragmenty wektora to: transgen w postaci cDNA (komplementarny DNA, razem z promotorem tworzy tzw. kasetę ekspresyjną), sekwencję gwarantująca autonomiczną replikację, sygnał poliadenylacji, introny oraz sekwencję określającą lokalizację jądrową. Obecność sekwencji izolujących po obu stronach kasety zapewnia ograniczony wpływ na inne geny [20].

Według danych bazy Clinical Trials w ostatnich latach wzrosło zainteresowanie zastosowaniem pDNA jako szczepionki w chorobach infekcyjnych np. wywołanych przez cytomegalowirus, wirus HIV-1 oraz w chorobach nowotworowych. Trwają badania nad użyciem szczepionki DNA w terapii melanoma [36].

Sposoby wprowadzania genów do komórek na przykładzie pDNA

Najbardziej pożądaną metodą dostarczenia genu terapeutycznego do skóry jest aplikacja miejscowa preparatu genowego. Niestety warstwa rogowa naskórka jest trudną do przeniknięcia barierą, która zapobiega przemieszczaniu się DNA przez warstwę fosfolipidową [21]. DNA to wielkocząsteczkowy związek o charakterze hydrofilnym, obdarzony (podobnie jak błona komórkowa) ładunkiem ujemnym. Trudności w transporcie przez błony wynikają zatem nie tylko z rozmiaru, ale również ładunku tej struktury [20].

Miejscowe zastosowanie wodnego roztworu nagiego plazmidowego DNA może przeniknąć w głąb skóry tylko poprzez mieszki włosowe, choć wydajność takiego procesu jest niska [21].

Aby wyeliminować trudności związane z pokonywaniem bariery naskórkowej, konieczne jest przeprowadzenie fizycznych lub biocząsteczkowych zmian strukturalnych w warstwie rogowej naskórka. Można tego dokonać za pomocą metod fizycznych, zastosowania związków chemicznych (np. kwas olejowy czy DMSO) lub odpowiednich syntetycznych nośników DNA [20].

W badaniu z 1995 r. zastosowano iniekcyjne podanie pDNA zawierającego gen kodujący interleukinę 8. Zaobserwowano wychwyt DNA przez keratynocyty a także pewien efekt terapeutyczny [21,37]. Niestety podanie śródskórne często powoduje ból oraz stan zapalny w miejscu aplikacji. Rozpoczęto poszukiwania innych metod wprowadzania transgenu, nie wymagających zastosowania igieł. Jedną z takich metod jest użycie strzykawek bezigłowych, które z dużą prędkością wyrzucają strumień leku, torując drogę w głąb skóry. Innym przykładem bezigłowego wprowadzania transgenu jest epidermal powder immunization – technika, w której cząstki szczepionki w postaci proszku wprowadza się do skóry z prędkością naddźwiękową [21,38]

Wyżej wymienione metody zalicza się do tzw. metod fizycznych wprowadzania genów.

Inne sposoby to: sonoporacja, elektroporacja, permeabilizacja magnetyczna komórek oraz mikroiniekcja. Sonoporacja polega na indukowaniu ultradźwiękami przejściowej

19 porowatości błony i pobraniu DNA do wnętrza komórek [39]. Ten sam efekt można uzyskać stosując pole elektryczne (elektroporacja) lub pole magnetyczne (permeabilizacja magnetyczna,) zapewniające lepszą penetrację tkanki [40].

Mikroigły to także urządzenia, które można zastosować w przezskórnym wprowadzaniu genów. Wymiary igieł mieszczą się w zakresie mikronów a podanie ogranicza się do najbardziej zewnętrznych warstw skóry – naskórka i warstwy brodawkowatej skóry właściwej. Są szeroko stosowane w szczepieniach [41,42].

Mimo zalet, większość metod fizycznych posiada ograniczenia - wykorzystanie ultradźwięków wymaga skomplikowanej aparatury, mikroiniekcja pozwala na transfekowanie tylko pojedynczych komórek a wprowadzenie leku pod dużym ciśnieniem ogranicza się do niektórych tkanek (np. mięśni). Uniemożliwia to ich uniwersalne zastosowanie w warunkach in vivo [42].

W celu zwiększenia efektywności miejscowego, skórnego oraz przezskórnego wprowadzania genów rozpoczęto badania nad kondensacją cząsteczek DNA w wyniku ich kompleksowania z cząsteczkami nośnika. Nośnikiem nazywamy różne struktury chemiczne, obdarzone dodatnim ładunkiem. Związki chemiczne pełnią rolę promotorów wchłaniania - odwracalnie zmieniają właściwości bariery, zakłócając jej strukturę lub maksymalizując rozpuszczalność leków w skórze [43].

W grupie syntetycznych nośników DNA wyróżniamy: liposomy i lipidy kationowe, dendrymery, polipeptydy kationowe i białka (np. protamina) oraz polimery i kopolimery kationowe [20]. W ostatnich latach badania nad tkanką skórną skupiają uwagę na polimerach kationowych oraz biodegradowalnych nanocząstkach. Można je skutecznie łączyć z polimerami kationowymi, białkami lub glikolem propylenowym, zapewniając tym samym zdolność do ucieczki endosomom, dotarcie do jądra komórkowego i uniknięcie układu immunologicznego. W 2012 r. Zheng i wsp. zbadali w warunkach in vitro koniugaty nanocząstek z kwasem nukleinowym (siRNA), rdzeniem była cząsteczka złota. Wyniki okazały się obiecujące – koniugaty wniknęły do ~100% keratynocytów mysich oraz ludzkich w ciągu godziny od podania [44].

Uwagę naukowców przyciągnęły również wybrane grupy peptydów, ze względu na ich zdolność penetracji do skóry i ułatwianie transportu małych oraz dużych cząsteczek [45]. W 2017 r. roku Niu i wsp. opublikowali wyniki badań nad transfekowaniem komórek czerniaka plazmidowym DNA w postaci kompleksu z AuPT, czyli nanocząsteczką złota

sprzężoną z peptydem TAT oraz polietylenoiminą. W eksperymencie zastosowano aplikację miejscową pDNA z genem hamującym ekspresję miRNA-221 w warunkach in vivo oraz in vitro. Udowodniono, iż właśnie w komórkach czerniaka występuje nadmierna ekspresja miRNA-221, która towarzyszy mutacji w genie KIT (ang. tyrosine-protein kinase). Efekty terapii okazały się obiecujące – wykazano istotną rolę peptydu TAT jako promotora wchłaniania oraz silną inhibicję miRNA-221 [46].

Rycina 4. Schemat przedstawiający przezskórne wprowadzenie plazmidowego DNA, kodującego inhibitor miRNA-221, w postaci kompleksu z AuPT [46, zmienione].

Szczepionki przeciwnowotworowe

Wykazano iź, melanoma jest nowotworem immunogennym. Tę cechę badacze starają się wykorzystać do stworzenia szczepionki, która indukowałaby odpowiedź immunologiczną wobec komórek nowotworowych. W 2003 r. Soiffer i wsp. podjęli próbę zastosowania szczepionki, zawierającej autologiczne komórki czerniaka, do których wprowadzono gen GM-CSF z użyciem adenowirusa. Zaobserwowano odpowiedź immunologiczną, skutkującą śmiercią komórek w przerzutach oraz niewielkie efekty uboczne, ograniczające się do reakcji skórnych [47].

21 Innym podejściem jest zmodyfikowanie ex vivo komórek dendrytycznych (ang.

dendritic cell, DC) z użyciem antygenów, wektora bądź mRNA kodującego antygeny nowotworowe. Do antygenów nowotworowych związanych z komórkami melanoma można zaliczyć np. NY-ESO, antygeny z grupy MAGE i antygeny różnicowania, np. melan-A, gp100, tyrozynaza.

Aby antygeny związane z nowotworem mogły uaktywnić odpowiedź immunologiczną, komórki powinny posiadać cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej (MHC) oraz cząsteczki kostymulujące. Limfocyty T pomocnicze (Th) ulegają pobudzeniu i inicjują odpowiedź komórkową (powstanie limfocytów T cytotoksycznych) czy odpowiedź humoralną (produkcję przeciwciał przeciwnowotworowych) tylko wtedy, gdy antygeny nowotworowe są im prezentowane wraz z MHC, a na komórkach prezentujących występują cząsteczki kostymulujące, np. CD80. Większość komórek nowotworowych ma zniesioną lub obniżoną ekspresję MHC, nie występują również cząsteczki kostymulujące. Aby temu zaradzić, do tworzenia szczepionek przeciwnowotworowych wykorzystuje się komórki dendrytyczne [48]

Komórki dendrytyczne to komórki prezentujące antygen, zawierające kostymulatory i cząsteczki MHC, pobudzające limfocyty Th i wytworzenie odpowiedzi odpornościowej organizmu. Praca Steele i wsp. opisuje transfekcję plazmidu kodującego melan-A i g100 do komórek DC pozyskanych od pacjentów w IV stadium melanoma. Podaż szczepionki była wielokrotna. Zaobserwowano łagodne efekty uboczne – objawy grypopodobne oraz częściową odpowiedź kliniczną [49].

Adoptywny transfer komórek (ang. Adoptive Cell Transfer, ACT)

ACT to kolejna próba wykorzystania immunogenności czerniaka. U części pacjentów obserwuje się naturalnie występującą odpowiedź limfocytów T specyficzną dla nowotworu, co sugeruje, że można sprawić, by limfocyty T je rozpoznawały. W 2009 r.

Fontana i wsp. przeprowadzili eksperyment, w którym pacjentom podano iniekcyjnie zmodyfikowane genetycznie, autologiczne limfocyty T, charakteryzujące się ekspresją genu kodującego białko MAGE-A3 (ang. Melanoma-Associated Antigen 3). Białko MAGE- A3 to antygen nowotworowy, którego obecność na komórkach wiąże się z gorszym rokowaniem. U chorych zaobserwowano zwiększony poziom przeciwciał anty-MAGE-A3, wskazujący na możliwe korzyści kliniczne. U pacjentów nie wystąpiły żadne objawy

uboczne. Zastosowanie białka MAGE-A3 w immunoterapii nowotworów jest objęte ochroną patentową, do której prawa posiada firma GlaxoSmithKline [50,51].

Wirusy onkolityczne

Wirusy onkolityczne to wirusy, które charakteryzują się zdolnością infekowania i replikowania w komórkach nowotworowych, co skutkuje ich rozpadem na skutek uszkodzenia błony bądź upośledzenia metabolizmu.. Wyróżniamy dwie grupy wirusów onkolitycznych: wirusy naturalnie zakażające tylko komórki nowotworowe np. wirus myksomatozy (MYXV, ang. Myxoma Virus), reowirusy lub wirusy modyfikowane genetycznie, niezdolne do replikacji w zdrowych komórkach np. wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1, ang. Herpes Simplex Virus 1). Powyższe cechy wykorzystuje się przy projektowaniu wirusów, zdolnych do wybiórczego niszczenia komórek nowotworowych, często wyposażonych w dodatkowy czynnik, wspomagający ich rozpad.

W 2017 r. opublikowano dane uzyskane w badaniu na modelu mysim nad wektorem OncoVEX^mGM-CSF, zaprojektowanym w oparciu o HSV-1. Zaobserwowano znaczący wzrost liczby limfocytów T CD8+, granulocytów obojętnochłonnych i monocytów po podaniu doguzowm oraz lizę ostrzykniętych komórek w wyniku uzyskanej odpowiedzi immunologicznej [52].

Geny samobójcze

Pojęcie “geny samobójcze” dotyczy genów kodujących enzymy przekształcające nietoksyczną substancję leczniczą (tzw. prolek) w substancję szkodliwą, które po wprowadzeniu do komórek nowotworowych, wywołują ich rozpad. Jako geny samobójcze najczęściej stosuje się gen kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (HSV-TK, patrz

“Retrowirusy”) oraz gen deaminazy cytozynowej Escherischia coli (ang. cytosine deaminase, CD). CD przekształca 5-fluorocytozynę w aktywny przeciwnowotworowo 5- fluorouracyl, który blokuje replikację DNA w komórkach. Mechanizm działania jest zatem swoisty dla komórek dzielących się, co nie jest do końca pożądane. Zaletą stosowania genów samobójczych jest ich kontrolowane, ograniczone działanie wymagające występowania obu komponentów - enzymu i proleku.

W badaniu na modelu mysim z 2010 r. Li i wsp. zastosowali adenowirusa do wprowadzenia genu CD. Wektor wprowadzono drogą dożylną i wyposażono dodatkowo w promotor receptora specyficznego dla komórek śródbłonka, aby ukierunkować ekspresję

23 CD. Autorzy zaobserwowali transdukcję komórek śródbłonka, pericytów oraz monocytów związanych z nowotworem, nie samych komórek nowotworowych. Podaż 5-fluorouracylu skutkowała znacznym zahamowaniem progresji zmian [53].

B7.1

Innym czynnikiem niezbędnym do aktywacji limfocytów T jest obecność B7.1 (CD80) i B7.2 (CD86). Są to białka występujące na powierzchni komórek prezentujących antygen (gł. limfocytach B, makrofagach, komórkach dendrytycznych), pełniące rolę cząsteczek kostymulujących dla limfocytów T. Biorą udział w tworzeniu swoistej odpowiedzi immunologicznej organizmu.

Komórki przerzutowe czerniaka dość często wykazują niedobór tych białek, czego konsekwencją jest anergia limfocytów T, ich inaktywacja po kontakcie z antygenem oraz autotolerancja dla komórek nowotworowych. Próby zrekompensowania tego braku również stały się przedmiotem badań nad terapią genową melanoma. W 1993 r. Nabel wykazał, że wektor plazmidowy kodujący HLA-B7 można bezpiecznie wprowadzić do guza za pomocą liposomu. U jednego z pięciu pacjentów zaobserwowano zmniejszoną masę guza.

W późniejszych badaniach powyższą koncepcję rozbudowano o przenoszenie genu HLA-B7 wraz z genem β2-mikroglobuliny w pojedynczym kompleksie wektor plazmidowy/liposom (obecnie znanym jako Allovectin-7). Zakończono kilka badań fazy II nad tym preparatem genowym. Gonzalez i wsp. opisali badanie ,w którym 77 pacjentów było leczonych Allovectin-7 według schematu: przez okres 9 tygodni wykonywano 6 wstrzyknięć doguzowych po 10 μg. U 9,1% pacjentów zaobserwowano pełną lub częściową odpowiedź w postaci regresji zmian, z medianą czasu trwania odpowiedzi 4,8 miesiąca.

Wykazano, że leczenie było korzystne nawet w przypadku zmian odległych od miejsca leczenia [19].

Interferon i interleukiny

Interferony to cytokiny, wytwarzane w odpowiedzi na zakażenie wirusowe lub zakażenie innymi patogenami wewnątrzkomórkowymi. Są wydzielane przez różne komórki np. interferon-alfa (IFN-α) głównie przez leukocyty a interferon-beta (INF-β) przez fibroblasty. Powodują aktywację ekspresji wielu genów - w kontekście leczenia choroby nowotworowej najistotniejsze wydają się te, które są związane z aktywacją komórek prezentujących antygeny nowotworowe oraz komórek efektorowych wykazujących

zdolność do niszczenia komórek nowotworu. Natomiast interleukina 2 (IL-2) jest czynnikiem wzrostowym dla limfocytów T, aktywującym zarówno cytotoksyczne limfocyty, jak i również komórki cytotoksyczne NK (ang. Natural Killer).

Zastosowanie biochemioterapii z użyciem rekombinowanych cytokin jest przedmiotem badań nad leczeniem m.in. czerniaka. Skuteczność terapii cytokinami jest obserwowana tylko przy zastosowaniu wysokich dawek. Wynika to z ograniczenia, jakim jest krótki okres półtrwania tych białek. Wiąże się to występowaniem wielu działań niepożądanych, wynikających z toksycznego działania leku. Terapia genowa może pomóc w uniknięciu toksyczności poprzez ograniczenie działania do komórek docelowych.

Jedną z prób klinicznych, w której zastosowano wektor adenowirusowy kodujący IL-2, była praca Dummera i wsp. Badanie obejmowało 25 pacjentów z przerzutowym czerniakiem i 10 pacjentów z innymi guzami litymi. Obiektywne odpowiedzi kliniczne (w tym 2 odpowiedzi całkowite) zaobserwowano u 5 pacjentów z czerniakiem, którzy otrzymali wyższą dawkę wektora. Poziomy IL-2 w surowicy wzrosły po terapii, były proporcjonalne do zastosowanej dawki. Skutki uboczne ograniczały się do objawów grypopodobnych [55].

Interleukina 24 (MDA-7, ang. Melanoma Differentiation Associated Gene-7) również stała się przedmiotem zainteresowania. Wykazano, że IL-24 hamuje wzrost guza, jego inwazyjność oraz angiogenezę. Uwrażliwia zmienioną chorobowo tkankę na działanie chemioterapii, indukuje apoptozę komórek nowotworowych poprzez mechanizm stresu retikulum endoplazmatycznego. Po podaniu doguzowym wektora adenowirusowego kodującego tę cytokinę, zaobserwowano ogólnoustrojową odpowiedź cytokinową limfocytów Th1. Aktywność kliniczną stwierdzono w 44% zmianach w schemacie powtórnych wstrzyknięć, w tym całkowite i częściowe odpowiedzi u dwóch pacjentów z czerniakiem. Zaobserwowano dobrą tolerowalność preparatu, indukcję apoptozy w dużym odsetku komórek nowotworowych. Obecność wektora potwierdzono w miejscu aplikacji oraz w obszarze 1 cm od iniekcji, ekspresja białka MDA-7 i jego aktywność była szerzej rozdystrybuowana [56].

25

Podsumowanie

W poniższej pracy przestawiono tylko kilka strategii terapii genowej, testowanych pod kątem leczenia pacjentów z melanoma. Prób klinicznych na świecie jest wiele, jednak badania te ciągle pozostają w sferze eksperymentalnej – wiemy wiele na temat genów, lecz droga do pełnej skuteczności terapii jest jeszcze daleka. Możliwe, że w przyszłości terapię genową będzie można łączyć z innymi lekami stosowanymi w leczeniu czerniaka – przeciwciałami monoklonalnymi, inhibitorami czy chemioterapią [19].

0,70% 1,30% 3,30%

6%

18,50%

22,50% 23,80%

BADANIA KLINICZNE - WEKTOR

1,90%

4,40%

13,90%

18,40%

27,20%

Interferon typ 1 HSV-TK GM-CSF Antygeny

nowotworowe Interleukiny

BADANIA KLINICZNE - GEN

Wykres 1. Porównanie częstotliwości wykorzystywania wybranych wektorów/genów w badaniach klinicznych [19, zmienione].

Bibliografia

1. Wojciechowska U., Didkowska J., Zatoński W., Nowotwory złośliwe w Polsce w 2018 roku, Narodowy Instytut Onkologii im. Marii Skłodowskiej-Curie, Warszawa, 2020, str.

33–73.

2. Błaszczyk-Kostanecka M., Wolska H., Dermatologia w praktyce, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2009, str. 258–275.

3. Cui R., Widlund H.R., Feige E. et al., Central role of p53 in the suntan response and pathologic hyperpigmentation, Cell, 2007, 128 (5): 853–864.

4. Frey L. M., Houben R., Bröcker E. B., Pigmentation, Melanocyte Colonization, and p53 Status in Basal Cell Carcinoma, Journal of Skin Cancer, 2011, 349726.

5. Cigna E., Tarallo M., Maruccia M., Sorvillo V., Pollastrini A., Scuderi N., Basal Cell Carcinoma: 10 Years of Experience, Journal of Skin Cancer, 2011, 476362.

6. Kułakowski A., Skowrońska-Gardas A. (Red.), Onkologia: podręcznik dla studentów medycyny, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2003, str. 227–240.

7. Kordek R. (Red.), Onkologia: podręcznik dla studentów i lekarzy, Wydawnictwo Via Medica, Gdańsk, 2006, str. 191-200.

8. EUROMELANOMA. Internet: http://www.euromelanoma.org/poland/co-powinno- si%C4%99-wiedzie%C4%87-o-nowotworch-sk%C3%B3ry/czerniak

9. Rutkowski P. et al., Czerniaki skóry – zasady postępowania diagnostyczno- terapeutycznego w 2016 roku, Journal of Oncology, 2015, 65, 6: 501–516.

10. Matheson J.A.H. et al., Prospective evaluation of prognostic indicators for early recurrence of cutaneous melanoma, Melanoma Research, 2017, 27 (1): 43–49.

11. Dummer R., Hauschild A., Lindenblatt N. i wsp., Cutaneous melanoma: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up, Ann. Oncol., 2015, 26 (Suppl 5): 126–132.

27 12. Luke J.J., Ott P.A., PD-1 pathway inhibitors: the next generation of immunotherapy for

advanced melanoma, Oncotarget, 2015, 6 (6): 3479–92.

13. Greenwald R.J., Oosterwegel M.A., van der Woude D., Kubal A. et al.,CTLA-4 regulates cell cycle progression during a primary immune response, Eur. J. Immunol., 2002, 32 (2): 366–73.

14. Robert C., Schachter J., Long G.V. i wsp., Pembrolizumab versus Ipilimumab in Advanced Melanoma, N. Engl. J. Med., 2015, 372: 2521–2532.

15. Lovly C., Pao W., Sosman J., Molecular Profiling of Melanoma. My Cancer Genome.

Internet: https://www.mycancergenome.org/content/disease/melanoma/

16. Sullivan R. J., Flaherty K. T., BRAF in Melanoma: Pathogenesis, Diagnosis, Inhibition, and Resistance, Journal of Skin Cancer, 2011, 423239.

17. Flaherty K.T., Robert C., Hersey P. i wsp., Improved survival with MEK inhibition in BRAF-mutated melanoma, N. Engl. J. Med., 2012, 367: 107–114.

18. Hauschild A., Grob J.J., Demidov L.V. i wsp., Dabrafenib in BRAF-mutated metastatic melanoma: a multicentre, open-label, phase 3 randomised controlled trial, Lancet, 2012, 380: 358–365.

19. Strauss B.E., Constanzi-Strauss E., Gene Therapy for Melanoma: Progress and Perspectives, Recent Advances in the Biology: Therapy and Management of Melanoma, 2013, DOI: 10.5772/54936.

20. Szala S. (Red.), Terapia genowa, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2003, str.

11–17, 37–64.

21. Gorell E., Nguyen N., Lane A., Siprashvili Z., Gene Therapy for Skin Diseases, Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2014, 4 (4): a015149.

22. Jakóbisiak M., Perspektywy terapii genowej, Pneumonol. Alergol. Pol. 2009, 77:289- 293.

23. Nowak J., Możliwości i perspektywy terapii genowej chorób nowotworowych, Kosmos, 1995, 44 (2): 465-478.

24. Bieńkowska A., Słyk Ż., Banaczkowska-Duda E., Małecki M., Formulacje leków genowych, recepty genowe, Farmacja Polska, 2018, 74(10): 611-615.

25. Dummer R., Rochlitz C., Velu T., Acres B., Limacher J.-M., Bleuzen P., Lacoste G., Slos P., Romero P., Urosevic M., Intralesional adenovirus-mediated interleukin-2 gene transfer for advanced solid cancers and melanoma, Mol. Ther., 2008, 16: 985–994.

26. Tong A.W. et al., Intratumoral Injection of INGN 241, a Nonreplicating Adenovector Expressing the Melanoma-Differentiation Associated Gene-7 (mda-7/IL24): Biologic Outcome in Advanced Cancer Patients, Mol. Ther., 2005, 11 (1): 160–172.

27. Bauerschmitz G.J., Barker S.D., Hemminki A., Adenoviral gene therapy for cancer:

From vectors to targeted and replication competent agents (review), International Journal of Oncology, 2002, 21: 1161–1174.

28. Cooray S., Howe S.J., Thrasher A.J., Retrovirus and lentivirus vector design and methods of cell conditioning, Methods Enzymol., 2012, 507: 29–57.

29. Klatzmann, D., et al., A phase I/II dose-escalation study of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase "suicide" gene therapy for metastatic melanoma. Study Group on Gene Therapy of Metastatic Melanoma, Human Gene Therapy, 1998, 9(17): 2585-94.

30. Małecki M., Hajdukiewicz K., Pachecka J., Rekombinowane wektory wirusowe rAAV w terapii genowej nowotworów, Farm. Przegl. Nauk., 2009, 2: 48–51.

31. Skubis-Zegadło J., Stachurska A., Małecki M., Vectorology of adeno-associated viruses (AAV), Developmental Period Medicine, 2013, 17 (3), 202–206.

32. Małecki M., Woźniak A., Janik P., Wirusy związane z adenowirusami, Postępy Biochemii, 2008, 54: 57–63.

33. Lipiec A., Małecki M., Hajdukiewicz K., Serotypy wirusów związanych z adenowirusami, Postępy Biochemii, 2009, 55 (1): 95–102.

34. Sallach J., Di Pasquale G., Larcher F., Niehoff N., Rübsam M., Huber A., Büning H., Tropism-modified AAV Vectors Overcome Barriers to Successful Cutaneous Therapy, Molecular Therapy, 2014, 22 (5): 929–939.

35. Lee J.H., Kim Y., Yoon Y.-E., Kim Y.-J., Oh S.-G., Jang J.-H., Kim E., Development of efficient adeno-associated virus (AAV)-mediated gene delivery system with a phytoactive material for targeting human melanoma cells, New Biotechnology, 2017, 37: 194–199.

29 36. Clinical Trials. Internet:

https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=pdna+vaccine&Search=Search

37. Hengge U.R., Chan E.F., Foster R.A.,Walker P.S., Vogel J.C., Cytokine gene expression in epidermis with biological effects following injection of naked DNA, Nat.

Genet., 1995, 10: 161–166.

38. Dean H.J., Chen D., Epidermal powder immunization against influenza, Vaccine, 2004, 23: 681–686.

39. Miller D.L., Pislaru S.V., Greenleaf J.E., Sonoporation: Mechanical DNA delivery by ultrasonic cavitation, Somat. Cell Mol. Genet., 2002, 27: 115–134.

40. Kardos T.J., Rabussay D.P., Contactless magneto-permeabilization for intracellular plasmid DNA delivery in vivo, Hum. Vaccin. Immunother., 2012, 8: 1707–1713.

41. Pearton M., Saller V., Coulman S.A., Gateley C., Anstey A.V., Zarnitsyn V., Birchall J.C., Microneedle delivery of plasmid DNA to living human skin: Formulation coating, skin insertion and gene expression, Journal of Controlled Release, 2012, 160: 561–569.

42. Cal K., Stefanowska J., Metody zwiększania przenikania substancji leczniczych przez skórę, Farmacja Polska, 66 (7): 514–520.

43. Purdon C.H. et al., Penetration Enhancement of Transdermal Delivery--Current Permutations and Limitations, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 2004, 21 (2): 97–

132.

44. Zheng D., Giljohann D.A., Chen D.L., Massich M.D., Wang X.Q., Iordanov H., Mirkin C.A., Paller A.S., Topical delivery of siRNA-based spherical nucleic acid nanoparticle conjugates for gene regulation, Proc. Natl. Acad. Sci., 2012, 109: 11975–11980.

45. Lopes L.B. et al., Potential of Peptide-Based Enhancers for Transdermal Delivery, Curr. Pharm. Des., 2015, 21 (20): 2814–2822.

46. Niu J. et al., Transdermal Gene Delivery by Functional Peptide-Conjugated Cationic Gold Nanoparticle Reverses the Progression and Metastasis of Cutaneous Melanoma, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017, 9 (11): 9388–9401.

47. Soiffer, R., et al., Vaccination with irradiated, autologous melanoma cells engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by adenoviral-mediated

gene transfer augments antitumor immunity in patients with metastatic melanoma, J Clin Oncol, 2003. 21(17): 3343-50.

48. Jakóbisiak M., Immunologia czerniaka, Współczesna Onkologia, 2003;7(8): 256.

49. Steele, J.C., et al., Phase I/II trial of a dendritic cell vaccine transfected with DNA encoding melan A and gp100 for patients with metastatic melanoma. Gene Therapy, 2011, 18(6): 584-93.

50. Fontana R., Bregni M., Cipponi A., Raccosta L., Rainelli C., Maggioni D., Lunghi F., Ciceri F., Mukenge S., Doglioni C. et al., Peripheral blood lymphocytes genetically modified to express the self/tumor antigen MAGE-A3 induce antitumor immune responses in cancer patients, Blood, 2009, 113: 1651–1660.

51. Zgłoszenie patentowe. Internet:

https://docs.google.com/viewer?url=patentimages.storage.googleapis.com/pdfs/US2010 0008980.pdf

52. Moesta A.K., Cooke K., Piasecki J., Mitchell P., Rottman J.B., Fitzgerald K., Zhan J., Yang B., Le T., Belmontes B., Ikotun O.F., Merriam K., Glaus C., Ganley K., Cordover D.H., Boden A.M., Ponce R., Beers C., Beltran P.J,. Local Delivery of OncoVEXmGM- CSF Generates Systemic Antitumor Immune Responses Enhanced by Cytotoxic T- Lymphocyte-Associated Protein Blockad,. Clinical Cancer Research, 2017, 23(20):

6190-6202.

53. Li, P., et al., Use of adenoviral vectors to target chemotherapy to tumor vascular endothelial cells suppresses growth of breast cancer and melanoma, Molecular Therapy, 2010, 18(5): 921-8.

54. Skin Cancer Foundation. Internet: http://www.skincancer.org/skin-cancer- information/skin-cancer-facts#melanoma

55. Dummer, R., et al., Intralesional adenovirus-mediated interleukin-2 gene transfer for advanced solid cancers and melanoma, Molecular Therapy, 2008, 16(5): 985-994.

56. C. Casey Cunningham, Sunil Chada, James A. Merritt, Alex Tong, Neil Senzer, Yuan Zhang, Abner Mhashilkar, Karen Parker, Sasha Vukelja, Don Richards, Jill Hood, Keith Coffee, John Nemunaitis, Clinical and local biological effects of an intratumoral injection of mda-7 (IL24; INGN 241) in patients with advanced carcinoma: a phase I study, Molecular Therapy, 2005, 11(1): 149-159.

31

Wykaz rycin, tabel i wykresów

Rycina 1. str. 3

Przykładowy obraz kliniczny melanoma.

Rycina 2. str. 5

Klasyfikacja oceny zaawansowania według TNM i stopniowanie kliniczne.

Rycina 3. str. 8

Strategie w terapii genowej.

Rycina 4. str. 16

Schemat konstrukcji wektorów AAV.

Rycina 5. str. 20

Schemat przedstawiający przezskórne wprowadzenie plazmidowego DNA, kodującego inhibitor miRNA-221, w postaci kompleksu z AuPT.

Tabela 1. str.9

Przykłady prób klinicznych terapii genowej w wybranych schorzeniach.

Tabela 2. str. 11

Porównanie najczęściej stosowanych wirusów w próbach klinicznych melanoma.

Tabela 3. str. 14

Przykłady tropizmu tkankowego AAV.

Wykres 1. str. 25

Porównanie częstotliwości wykorzystywania wybranych wektorów/genów w badaniach klinicznych.