o -^ »-ut o «o o o o o» IS) W o
m
z^\
.^1
r
BIOCHEMISCHE ONDERZOEKINGEN OVER HET
GESLACHT ACETOBACTER
ZOEKINGEN OVER HET
GESLACHT ACETOBACTER
PROEFSCHRIFT. TER VERKRIJGING
VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR IN
DE TECHNISCHE WETENSCHAP AAN
DE TECHNISCHE HOOGESCHOOL TE
DELFT. OP GEZAG VAN DEN
REC-TOR-MAGNIFICUS DR. IR. G . VAN
ITERSON JR.. HOOGLEERAAR IN DE
AFDEELING DER SCHEIKUNDIGE
TECHNOLOGIE. VOOR EEN
COMMIS-SIE UIT DEN SENAAT TE
VERDEDI-GEN OP DINSDAG 3 NOVEMBER 1925.
DES NAMIDDAGS TE 3 UUR. DOOR
FRANCISCUS VISSER T HOOFT.
SCHEIKUNDIG INGENIEUR.
GEBOREN TE HAARLEM.
m
GiBiJOTHFLK
leeraren in de Afdeeling der Scheikundige Technologie aan de Technische Hoogeschool, van wie ik onderricht mocht ontvangen.
In het bijzonder geldt deze dank U, Hooggeleerde KLUYVER. Gij, Hooggeschatte Promotor, hebt door Uwen bezielenden werkkracht en door Uw opwekkend voorbeeld in Uw labora-torium een geest van samenwerking geschapen, die niet genoeg te waardeeren is. Gij hebt mij in de jaren, waarin ik onder Uwe leiding mocht werken, met Uwe veelzijdige kennis voort-durend bijgestaan, waarbij Gij Uwe persoonlijke belangen steeds aan die der wetenschap ondergeschikt maaktet. De uren in Uw laboratorium en in Uwe gastvrije woning doorgebracht, zullen bij mij een dankbare en aangename herinnering achterlaten.
Hooggeleerde BOESEKEN, ook tot U wil ik een bijzonder woord van dank richten. Gij waart het, die mij opmerkzaam hebt gemaakt op het merkwaardig biochemisch gedrag van de sorbose-bacterie en op het belang, dat een nadere studie van deze bacterie zou kunnen hebben. Toen deze studie zich geleidelijk in meer microbiologische richting ontwikkelde, hebt Gij toch nog vele malen mij met Uw scherp inzicht bijgestaan. Ik ben U daarvoor ten zeerste erkentelijk.
De Vereeniging „Studiefonds Pasteur", die mij een plaats aanbood in het Institut Pasteur te Parijs en mij in staat stelde aldaar een jaar werkzaam te zijn, betuig ik hierbij eveneens mijn weigemeenden dank.
C'est pour moi un devoir particulièrement agréable a remplir, que d'adresser le témoignage de ma vive reconnaissance et mes meilleurs remerciements è M. A. CALMETTE, Directeur de l'Institut Pasteur et a M. G. BERT RAND, Directeur du Laboratoire de Chimie biologique, pour l'excellent accueil qu'ils m'ont réserve.
Tot allen, die mij bij mijne proefnemingen behulpzaam zijn geweest, richt ik voorts nog een woord van erkentelijkheid, speciaal tot Ir. VAN NIEL en Ir, LEEFLANG.
I N H O U D .
Bladz.
INLEIDING 1
DEEL I.
DE OXYDEERBAARHEID VAN ORGANISCHE VERBINDINGENDOOR DE SORBOSE-BACTERIE EN DOOR DAARAAN IN BIOCHEMISCH
OP-ZICHT ENG VERWANTE BACTERIËN.
HOOFDSTUK I. Beschouwing der
litera-tuur en daarop gebaseerde conclusiën.
§ 1. Inleiding 7 § 2. Het onderzoek van BERTRAND 7
§ 3. Overige literatuur 13
§ 4. Critiek 15
HOOFDSTUK II. Eigen proefnemingen.
§ 1. Gebruikt bacteriënmateriaal 20 § 2. Gang van het onderzoek 22 § 3. Proeven met door BERTRAND onderzochte
suiker-alcoholen en suikers 24 § 4. Proeven met adoniet 25 § 5. Proeven met 2-3 butyleenglycol 27
§ 6. Proeven met a-propyleenglycol 31 § 7. Proeven met aethyleenglycol 32 § 8. Proeven met melkzuur en calciumlactaat . . . 34
§ 9. Proeven met isopropylalcohol 36 § 10. Proeven met tertiairen butylalcohol 37 § 1 1 . Proeven met eenwaardige primaire alcoholen . . 37
§ 12. Overzicht der resultaten . 43
HET WEZEN VAN DE DOOR DE SORBOSE-BACTERIE EN DAARAAN VERWANTE
BACTE-RIËN BEWERKTE OXYDATIES.
HOOFDSTUK IV. Beschouwing der
lite-ratuur.
§ 1. Inleiding 53 § 2. Vroegere onderzoekingen over de oxydeerbaarheid
van organische verbindingen door uiteenloopende
azijnbacteriën 54
HOOFDSTUK V. Vergelijkende
proefne-mingen over de oxydeerbaarheid van
organische verbindingen door Acetobacter
suboxydans en Acetobacter rancens
§ 1. Proeven met behulp van vaste voedingsmedia . . 57 § 2. Proeven met behulp van vloeibare voedingsmedia 63
HOOFDSTUK VI. Verklaring van het
bij-zonder biochemisch gedrag van A.
subo-xydans 69
HOOFDSTUK VII. Verklaring van het
bijzonder biochemisch gedrag der
sor-bose-bacterie .
§ 1. Inleiding 74 § 2, Proefnemingen over de afhankelijkheid van de
snelheid van het dissimilatieproces van de
zuur-stofconcentratie 77 § 3. Het gedrag van A. xylinum onder gunstige
aëra-tievoorwaarden 79 § 4. Conclusie 80
Bladz.
DEEL III.
HET OXYDATIEF VERMOGEN VAN DE VER-SCHILLENDE SOORTEN VAN AZIJNBACTERIËN.
HOOFDSTUK VIII. Vergelijkende
on-derzoekingen over de door verschillende
azijnbacteriën bewerkte oxydaties.
§ 1. Inleidende beschouwingen . . . 83 § 2. Gebruikt bacteriënmateriaal . . . 87 § 3. Het oxydatief vermogen der azijnbacteriën op
grond van de door deze bewerkte oxydaties van
verschillende organische verbindingen . . . . 91 § 4. De katalasereactie bij azijnbacteriën. Acetobacter
peroxydans n. sp 98
§ 5. De oxydatie van gasvormige waterstof . . . . 102
§ 6. Samenvatting 104
HOOFDSTUK IX. De beteekenis der
ver-kregen resultaten voor de systematiek der
azijnbacteriën.
§ 1. De bestaande indeelingen der azijnbacteriën . . 107 § 2. Algemeene beginselen, welke bij de
bacteriënsy-stematiek zijn in acht te nemen. 113 § 3. Toepassing der uiteengezette beginselen op de
systematiek der azijnbacteriën . . . 120
AANHANGSEL 125
SAMENVATTING 127
Het feit, dat uiterst talrijke micro-organismen in staat zijn verschillende organische stoffen te oxydeeren, is van algemeene bekendheid. In de leerboeken der organische chemie pleegt hieraan intusschen terecht weinig aandacht te worden geschonken. Op dezen regel is evenwel één uitzondering aan te wijzen: bij de behandeling der poly-alcoholen wordt er nagenoeg steeds melding van gemaakt, dat een aantal van deze verbindingen door de door BERTRAND bestudeerde sorbose-bacterie tot de overeenkomstige ketosen wordt geoxydeerd.
De microbiologisch minder geschoolde lezer komt door deze aan de genoemde bacterie verleende uitzonderings-positie allicht in den waan, dat men hier te doen heeft met een bacterie, die door het bezit van een zeer speciale eigenschap is gekenmerkt, een eigenschap, die bijv. op één lijn te stellen is met het voor andere bacteriën kenmerkende kleurstof-vormend vermogen. Deze meening wordt dan nog versterkt door de omstandigheid, dat er de nadruk op wordt gelegd, dat de sorbose-bacterie blijkens de fraaie onderzoekingen van BERTRAND in dit opzicht zeer specifiek is en den éénen mecr-waardigen alcohol wel, den anderen niet aangrijpt.
In dit proefschrift is er nu in de eerste plaats naar gestreefd „het geval van de sorbose-bacterie" tot zijne juiste proporties terug te brengen, m.a.w. door een nadere studie van deze bacterie te bereiken, dat de bovengenoemde — ongetwijfeld merkwaardige — eigenschap dezer bacterie in een juister licht wordt bezien. Daartoe heb ik mij allereerst tot taak gesteld, door herhaling en uitbreiding der onderzoekingen van BERTRAND een antwoord te krijgen op de vraag, welke ver-bindingen wel en welke verver-bindingen niet voor oxydatie door de bacterie vatbaar zijn. Daarbij moet worden opgemerkt, dat door BERTRAND er reeds op was gewezen, dat niet alleen
2
bepaalde poly-alcoholen, maar tevens zeer uiteenloopende suikers door de bacterie werden geoxydeerd. Voorts waren in de microbiologische literatuur hier en daar wel enkele gegevens omtrent het gedrag der sorbose-bacterie ten op-zichte van andere groepen van verbindingen te vinden, doch een eenigszins diepergaand onderzoek in deze richting was tot dusver nog niet verricht.
Nadat dit eerste deel van het onderzoek, dat men als het vergelijkend-chemisch onderzoek zou kunnen aanduiden, was verricht, heb ik mij tot doel gesteld het oxydeerend vermogen der sorbose-bacterie te beschouwen in het licht van onze kennis aangaande het oxydeerend vermogen van de andere obligaat aerobe, dat wil dus zeggen: oxydeerende bacteriën. Voor een onderzoek in deze richting kwamen vóór alles de overige soorten van de natuurlijke groep der azijn-bacteriën, waartoe de sorbose-bacterie ongetwijfeld behoort, in aanmerking. Uit dit deel van het onderzoek, dat men het ver-gelijkend-physiologische zou kunnen noemen, bleek duidelijk, dat men het oxydeerend vermogen der sorbose-bacterie t.o. van de poly-alcoholen niet als een zelfstandige eigenschap, doch als een uiting van het allen aeroben bacteriën eigen oxydatieve dissimilatieproces moest zien, dat bij de sorbose-bacterie in een specialen baan wordt geleid.
Nadat ik met mijne onderzoekingen reeds een aanvang had gemaakt, isoleerde DE LEEUW in het Laboratorium voor Microbiologie een tot dusver onbekende bacterie, voor welke later KLUYVER en DE LEEUW konden vaststellen, dat zij in biochemisch gedrag groote overeenkomst met de sorbose-bacterie vertoonde. Deze sorbose-bacterie, die ik reeds spoedig in mijn onderzoek betrok, bleek de voor de sorbose-bacterie karak-teristieke biochemische eigenschappen zelfs in nog zuiverder vorm te bezitten. Het lijdt geen twijfel, dat deze gelukkige omstandigheid er veel toe heeft bijgedragen de opheldering van het biochemisch gedrag der sorbose-bacterie mogelijk te maken, te meer daar in de publicatie, die KLUYVER en de
beschouwingen voorkwamen, die er zich toe leenden om als richtlijn bij het verdere onderzoek te worden gebruikt.
Deze beschouwingen, die geheel in het kader van de reeds door mij te Parijs verrichte proefnemingen pasten, zijn door mij aan een meer uitgebreid feitenmateriaal getoetst. Een en ander leidde tot een vergelijkend onderzoek van de stof-wisseling van verschillende azijnbacteriënsoorten. Er werd voorts naar gestreefd de uitkomsten van dit onderzoek aan de systematiek der azijnbacteriën dienstbaar te maken.
iff^^^mamm^r^^
DEEL I.
DE OXYDEERBAARHEID VAN
ORGANI-SCHE VERBINDINGEN DOOR DE
SORBO-SE-BACTERIE EN DOOR DAARAAN IN
BIOCHEMISCH OPZICHT ENG VERWANTE
BESCHOUWING DER LITERATUUR EN DAAROP GEBASEERDE CONCLUSIÊN.
§ 1. Inleiding.
Door de onderzoekingen van BERTRAND '), samengevat in zijn in 1904 verschenen verhandeling „Étude biochimiquc de la bacterie du sorbose" werd de aandacht gevestigd op de merkwaardige oxydaties, waartoe bepaalde bacteriën in staat zijn. Wel hadden BOUTROUX *), BROWN ») en SEIFERT *) reeds enkele van dergelijke onder den invloed van bepaalde bac-teriën verloopende oxydaties beschreven, BERTRAND was echter de eerste, die een diepergaande studie van deze ver-schijnselen maakte. In de eerste plaats wil ik daarom BER-TRAND'S onderzoekingen bespreken.
§ 2. Het onderzoek van Bertrand.
Het onderzoek van BERTRAND, aangaande de biochemie der sorbose-bacterie, is voortgevloeid uit door dezen onderzoeker ingestelde proefnemingen, welke tot doel hadden een verkla-ring te vinden voor het raadselachtige feit, dat de bereiding
^) G. BERTRAND. Ann. de Chim. et de Phys., 8e Serie, 3, p. 181—288, (1904).
*) L. BOUTROUX. C . R. de l'Acad. 102, p. 924, (1886) en Ann. Inst. Pasteur 2, p. 309, (1888).
•) A. J, BROWN. Joum. Chem. Soc, Transact. 49, p. 172 ea p. 432, (1886); ibid. 51, p. 638, (1887).
8
van de suiker: sorbose uit het sap van lijsterbessen {Sorbus
aucuparia L.) nu eens wel en dan weer niet slaagde. Bij deze
proefnemingen kwam BERTRAND tot de ontdekking, dat slechts dan uit het lijsterbessap sorbose te isoleeren was, indien dit tijdens de bereiding geïnfecteerd was geweest met een bacterie, waaraan hij den naam van sorbose-bacterie gaf. Uitsluitend onder den invloed van deze bacterie werd de regelmatig in het lijsterbessap voorkomende zeswaardige alcohol sorbiet tot de suiker sorbose geoxydeerd. Dit merkwaardige feit bracht BERTRAND er toe, een studie te maken van het gedrag der bacterie tegenover andere meerwaardige alcoholen. Hierbij kwamen eveneens uiterst belangwekkende feiten aan het licht. Het bleek namelijk, dat een aantal meerwaardige alcoholen, wanneer deze in passende voedingsvloeistoffen aan de bacte-riën geboden werden, werden aangetast en tot de bijbehoo-rcndc ketosen geoxydeerd. Daarentegen vond BERTRAND, dat de bacterie hardnekkig weigerde een aantal andere poly-alcoholen als voedsel te accepteeren, ondanks het feit, dat deze alcoholen ten deele slechts in configuratie van de wel aan-getaste verschilden.
Zoo stelde BERTRAND vast, dat de volgende meerwaardige alcoholen in de daarbij vermelde ketosen werden omgezet:
r . glycerine —> dioxyaceton. • ' -a ' I N -CHjOH—C—CHjOH-^ CHjOH—C—CHjOH. I . II OH O 2°. i-erythriet -+ d-erythrulosc. H H
T
CHjOH~C—C—CHjOH -*• CHjOH—C—C—CH2OH.II ' II I '
- OH OH O OH3°. 1-arabiet —* ketopentose (niet geïsoleerd). O H O H H O OHH
I I I
II I I CH,OH—C—C--C—CHjOH -> CHjOH—C—C—C—CH.OH.I l l I I
H H OH H OH 4°. d-sorbiet —>• d-sorbose. H H OHH I I I I CH2OH—C—C—C—C—CHjOH ->• I I I I O H O H H OH H OHH I I I -> CHjOH—C—C—C—C—CHjOH. II I I I O OHH OH S^. d-mannict —*• d-fructose. H H OHOH I I I I CHjOH—C—C—C—C—CH,OH -> I I I I O H O H H H H OHOH I I I -*• CHjOH—C—C—C—C—CHjOH. II I I I O OHH H 6*. perselt —* ketoheptose (niet geïsoleerd). T . volemiet —>• ketoheptose (niet geïsoleerd).Daarentegen vermeldt BERTRAND, dat de volgende
poly-alcoholen niet worden aangetast ^):
*) BERTRAND spreekt van 1-xylict en d-dulciet; dit moet echter op een vergissing berusten, daar xyliet en dulciet slechts in intra-moleculair inactieven vorm voor kunnen komen.
io
r . glycol: CHjOH—CH,OH. H OHHI I I
T. xyüct: CHgOH—C—C—C—CHjOH.I l l
OHH OH H OHOHHI I I I
3°. dulciet: CH.OH—C—C—C—C—CH,OH.I I I I
OHH H OH OHH OHHI I I I
4°. d-idict: CHgOH—C—C—C-C—CHjOH.I I I I
H OHH OH IAlle volgende beschouwingen van BERTRAND en anderen over de configuratie der wel en niet aantastbare verbindingen hebben klaarblijkelijk uitsluitend betrekking op de configu-ratie, zooals deze af te lezen is uit de structuurformule in de projectie volgens FISCHER. De ruimtelijke configuratie, dus de werkelijke stand der groepen in de ruimte, blijft voorloopig geheel buiten beschouwing.
BERTRAND kwam nu tot de slotsom, dat er in het gedrag der bacteriën ten opzichte van deze verbindingen een zekere regelmatigheid viel waar te nemen, welke hij als volgt formu-leerde ^):
„Tous les alcools attaques renferment un groupement alcoo-lique secondaire dans leur molecule. On se rappelle la forme de ce groupement:
_ c — ' '^' •• ''^
. _ • • •• U ':,...,:-•••:''•:,,
') BERTRAND, 1. c. p. 202. , ' ^ ''.^ .et Ton sait qu'il en existe, en general, plusieurs places les uns <t la file des autres, dans les substances considérées:
H H OHH
I I I I
_c—c—c—c—
I I I I
OHOHH OH
L'existence de ce groupement alcoolique secondaire n'est pas suffisante toutefois pour determiner le choix de la bacterie. C'est seulement lorsque l'oxhydrile OH de ce groupement est disposé de telle fagon que, d'un même cöté de la chaine, il ne soit pas au voisinage d'un atome d'hydrogène faisant partie d'un groupement semblable, qu'on observe l'attaque par la bacterie.
Les alcools plurivalents qui ne prcsentent pas cette dis-position resistent k l'oxydation et peuvent se retrouver même dans des cultures tres anciennes."
Eenige bladzijden verder drukt BERTRAND zich in dit ver-band nog eenigszins anders uit:
„Une consequence interessante de cette remarquablc attitude de la bacterie vis-i-vis des alcools plurivalents est relative k la nature des produits engendrés au cours de la culture.
Toutes les substances attaquées par la bacterie possèdent, avons-nous vu, un groupement commun; selon toute vraisem-blance, c'est done sur ce groupement que la bacterie doit exercer son activité."
Wij zien, hoe hier het eerst geformuleerde negatieve ken-merk voor aantastbaarheid door een meer positieve gevolg-trekking, aangaande de configuratie der aangetaste verbin-dingen, wordt vervangen.
Het is begrijpelijk, dat BERTRAND zich geroepen achtte, zijne waarnemingen hierna ook tot andere verbindingen dan de meerwaardige alcoholen uit te breiden en dat hij daarbij in de eerste plaats aandacht schonk aan de suikers. Deze toch
12
bezitten een bouw, die in vele opzichten overeenstemt met die
der onderzochte alcoholen. i BERTRAND constateerde dan ook, dat zoowel aldosen als
ketosen als voedsel voor de bacterie konden dienen. Bij de laatstgenoemde suikers was het niet mogelijk karakteristieke oxydatieproducten aan te toonen. Wat de aldosen betreft, toonde BERTRAND aan, dat deze nagenoeg volledig in de bij-behoorende aldonzuren werden omgezet:
CHjOH— (CHOH)n — COH -> CHjOH — (CHOH)n — COOH. BERTRAND merkt naar aanleiding hiervan, het volgende op: „Ce n'est done plus ici la structure stéréochimique qui regie le choix de la bacterie du sorbose. L'existence d'un certain groupement non saturé, dont l'oxydation dégage, en general, plus de chaleur que la transformation d'un alcool secondaire en cétone, suffit pour justifier une action générale."
Uit dit citaat blijkt, dat er voor BERTRAND een onderscheid bestaat tusschen de factoren, die de aantasting der poly-alcoholen bepalen en die, welke de aantasting der aldosen beheerschen.
Voorts vond BERTRAND evenwel, dat de sorbose-bacterie, indien men haar glucose als voedsel verstrekte, er zich niet toe beperkte deze suiker in gluconzuur om te zetten, doch laatstgenoemde stof op haar beurt verder oxydeerde tot een verbinding, die identiek bleek met het reeds eerder door BOUTROUX ontdekte oxygluconzuur.
BERTRAND ging nu zoover, op grond van zijn bij de poly-alcoholen waargenomen regelmatigheden, te besluiten, dat het een 5-ketogluconzuur zou zijn van de volgende structuur:
H OHH
l i l
CHgOH—C—C—C—C—COOH.
II I I I ' : o OHH OH
19
Een spoedig daarop verricht onderzoek van BOUTROUX ^) bewees, langs zuiver chemischen weg, de juistheid van deze structuur. *)
Intusschen is het van belang er op te wijzen, dat uit deze door BERTRAND gemaakte gevolgtrekking blijkt, dat BERTRAND niet alleen zijn aanvankelijke sobere formuleering van de regelmatigheden inzake de aantastbaarheid der poly-alcoholen, door den eerder vermelden positieven eisch heeft vervangen, maar zelfs zoo ver is gegaan om voor een niet tot de poly-alcoholen behoorende verbinding uit het feit der
aantastbaar-i heaantastbaar-id te concludeeren tot de confaantastbaar-igurataantastbaar-ie van het molecuul. *)
Hierop vestig ik uitdrukkelijk de aandacht in verband met het feit, dat BERTRAND, bij zijn beschrijving van de met de aldosen verkregen uitkomsten, met nadruk er op wijst, dat de oxydatie dezer stoffen niet door de „structure stéréochimique" wordt beheerscht.
§ 3. Overige literatuur,
In de vorige paragraaf had ik de gelegenheid er op te wijzen, hoe BERTRAND aan de door hem bij de poly-alcoholen waar-genomen regelmatigheden een wijdere strekking gaf, door deze als algemeene grondslag voor een biochemische configu-ratiebepaling te aanvaarden.
1) L. BOUTROUX, C . R. 127, p. 1224, (1898).
*) In het recente werk van PRINGSHEIM (Zuckerchemie, Leipzig, 1925) wordt op grond van de proeven van HÖNIG en TEMPUS aan BOUTROUX' oxygluconzuur de formule van 2-ketogluconzuur toe-gekend. Zooals door C. B. VAN NIEL en mij is uiteengezet (zie: Berichte D. Chem. Ges. 58, p. 1606; 1925) is deze conclusie ten eenenmale ongerechtvaardigd.
^) Hier wordt dus voor de eerste maal aan de sorbose-bacterie waarde toegekend als reagens op de configuratie en BERTRAND wijst dan ook op het belang van een nadere studie dezer bacterie: „même en se plafant au seul point de vue de la chimie pure."
14
Dit voorbeeld werd gevolgd door VOTOCEK en BULIR i), die op grond van het feit, dat het door hen bestudeerde rhodeït niet door de sorbose-bacterie werd aangegrepen, concludeer-den tot de aanwezigheid van een groep:
H CH H Ö H
II II
CHoOH—C—C— en niet van een groep: CH»OH—C—C—.I I \ A
O H 0 H O H H In hoeverre deze redeneering geoorloofd is, zal hieronder
nog nader ter sprake komen. Intusschen zij vermeld, dat een nader chemisch onderzoek de juistheid der opgestelde struc-tuurformule bevestigde.
Het is nu van belang op te merken, hoe de opvatting van
BERTRAND, dat het gedrag der sorbose-bacterie uitsluitsel kan geven aangaande de configuratie eener stof, nog heden ten dage algemeen wordt gedeeld. Zoo vindt men deze opvatting in nagenoeg alle hand- en leerboeken der organische chemie, stereochemie en biochemie weergegeven"). Enkele citaten mogen hier volgen:
MEYER en JACOBSON zeggen:
„Diese aerobe Bakterie oxydiert eine Reihe von mehrwcr-tigen Alkoholen unter Uebertragung des Luftsauerstoffs zu
') E. VOTOCEK en J. BUUR, Zeitschr. f. Zuckerind. in Böhmen, 30, p. 333, (1905/06). Geciteerd naar: LAFAR, Die EssigsSure-garung, Jena, 1913, p. 45; zie ook: E. VOTOCEK, Ber. 43, p . 469, (1910).
*) V, MEYER U. P . JACOBSON, Lehrbuch der Org. Chemie, 1,2, p. 170, (1913).
E. F, ARMSTRONG, The Carbohydrates and the Glucosides, p. 178, (1924).
H. PRINGSHEIM, Zuckerchemie, p. 229, (1925). A. W. STEWART, Stereochemistry, p. 40, (1919).
T . BAUMGXRTEL, Grundiss der theoretischen Bakteriologie, p. 147, (1924).
W. KRUSE, AUgemeine Mikrobiologie, p. 426, (1910). F. CZAPEK, Biochemie der Pflanzen III, p . 65, (1921).
pag. 14, regel 5 v. b . lees:
H OH H H
II II
CHoOH—C—C— en niet van een groep: CHgOH—C—C—.II II
OH H OH OH15
Ketosen, ohne dass daneben Aldosen gebildet werden. Sie führt also die in der Kohlenstoffkette an zweiter Stelle
be-H
I
findlichen Gruppe —C— in Carbonyl über. Der Angriff
I
OH
«rfolgt aber nur bei denjenigen Polyalkoholen, in deren Kon-H
I
figurationsformeln die benachbarte Gruppe —C— das Hy-OH
droxyl auf der gleichen Seite der Kette zeigt, wie das der Oxydation anheimfallende Kettenglied." *)
Bij CZAPEK vindt men een dergelijke formuleering. In de laatste uitgave van „The Carbohydrates and The Glucosides" zegt ARMSTRONG:
„An examination of the formulae of these alcohols shows that the —CHOH— group oxidised to —CO— is next to a —CHgOH group; further, for action to take place, the hydro-xyl group must not be adjacent to a hydrogen atom at the same side of the configuration formulae; in other words, the
H H
II
compound must contain the grouping: CH,OH—C—C—". OH OH
§ 4. Critiek.
Het is nu aangewezen, de in de vorige paragrafen mede-gedeelde feiten aan een critische beschouwing te onderwerpen.
*) De schrijvers merken zelf op, dat zij in deze uitspraak BERTRAND'S formulcering eenigermate wijzigen. Voor de poly-alcoholen komen beide redacties op het zelfde neer.
In de eerste plaats moet ik er dan de aandacht op vestigen, dat geleidelijk aangaande de strekking der door BERTRAND geconstateerde regelmatigheden verschillende opvattingen hebben post gevat, die door de drie volgende formuleeringen worden weergegeven:
1. Alleen indien bij een meerwaardigen alcohol naast de OH der aan te tasten secondaire CHOH groep geen H atoom van een soortgelijke groep aan dezelfde zijde der keten voorkomt, wordt deze alcohol door de sorbose-bacterie aangetast. (regel van BERTRAND).
2. Alleen indien bij een verbinding naast de OH der aan te tasten secondaire CHOH groep geen H atoom van een soortgelijke groep aan dezelfde zijde der keten voorkomt, wordt deze verbinding door de sorbose-bacterie aange-tast (uitgebreide regel van BERTRAND).
3. De door de sorbose-bacterie aan te tasten verbindingen H H
I I
moeten de groep: CHjOH—C—C— bevatten
(verst-I (verst-I
OHOH ,, , gaande regel).
Hieraan moet dadelijk worden toegevoegd, dat de boven beschreven toepassing van de sorbose-bacterie als reagens op de configuratie door VOTOCEK en BULIR berust op een onbewuste nog verder gaande uitbreiding van de door BER-TRAND gegeven regels. Immers, terwijl BERTRAND er zich toe bepaalt, om een eisch op te stellen aangaande de configuratie van een door de sorbose bacterie aangetasten meerwaardigen alcohol, en geheel in het midden laat, of een alcohol, die de geschikte configuratie bezit, ook noodzakelijkerwijze moet worden aangetast, wordt deze laatste gevolgtrekking door
It
VOTOCEK en BULIR stilzwijgend gemaakt. ^) Dit is een voor-beeld van de bekende niet geoorloofde verwisseling van een voorwaardelijke en een oorzakelijke bepaling van een ver-schijnsel.
Het lijkt nu gewenscht, de hierboven vermelde drie inter-pretatie's van de door BERTRAND gevonden regelmatigheden één voor één te bespreken en na te gaan, in hoeverre het beschikbare feitenmateriaal zich al dan niet met deze regels in overeenstemming laat brengen. Daarbij is het aangewezen te beginnen met de derde formuleering, die klaarblijkelijk de verste strekking heeft.
a). De verstgaande regel (3).
Men treft deze formuleering, zooals uit het boven aan-gehaalde citaat blijkt, aan bij ARMSTRONG, waarbij ik in het bijzonder de aandacht vestig op de woorden: „the compound must contain the grouping etc." Dat ARMSTRONG met het woord „compound" niet alleen de poly-alcoholen bedoelt, volgt ten duidelijkste uit het feit, dat hij even verder zegt: „gluconic acid contains the sensitive grouping."
Ik behoef slechts op de algemeene aantastbaarheid der aldosen te wijzen, om te doen uitkomen, dat deze regel on-houdbaar is.
b). De uitgebreide regel van Bertrand (2).
BERTRAND spreekt deze regel nergens met zooveel woorden ^) In dit verband moet er op worden gewezen, dat bij BER-TRAND'S proeven nimmer de aantastbaarheid van twee optische antipoden is vergeleken. Het is nu a priori geenszins uitgesloten, dat evenals dit door FISCHER voor de vergistbaarheid der hexosen werd geconstateerd, de eene antipode wel en de andere niet door de sorbose-bacterie zou worden aangegrepen. VOTOCEK en BULIR
zouden in hunne conclusie dan ook in ieder geval sterker gestaan hebben, indien zij ook de al of niet aantastbaarheid van het fudet, de optische antipode van het rhodeït, onderzocht hadden.
uit, toch is de door hem gegeven formule van het oxyglucon-zuur gebaseerd op de veronderstelling, dat de door hem bij de poly-alcoholen geconstateerde regelmatigheden ook zullen zijn terug te vinden bij andere klassen van verbindingen. Ik wil mij er toe bepalen er op te wijzen, dat voor deze uitbrei-ding destijds geenerlei fundeering aanwezig was. Het feit, dat later de juistheid van de door BERTRAND voor het oxyglu-conzuur gegeven structuur bleek, rechtvaardigt al evenmin tot de geldigheid van deze uitgebreide regel te besluiten. Doch hoe dit ook zijn moge, in ieder geval zal het duidelijk zijn, dat de geldigheid van deze regel teneenenmale afhankelijk is van die van de eerste regel. (Zie hiervoor onder c). c). De regel van Bertrand (1).
Thans rest mij nog onder het oog te zien, in hoeverre ook tegen de eerste sobere formuleering van BERTRAND bezwaren zijn aan te voeren. Ik wil dan direct opmerken, dat op het oogenblik, dat BERTRAND deze regel opstelde, de toen be-kende experimenteele feiten, daarmede in volledige overeen-stemming waren. Echter moet er aan worden herinnerd, dat BERTRAND er zich van heeft onthouden, zijn regel zoo te for-muleeren, dat uit de aanwezigheid van een bepaalde confi-guratie ook tot aantastbaarheid door de sorbose-bacterie zou kunnen worden besloten.
Sedert BERTRAND'S laatste verhandeling op dit gebied het licht zag, verscheen evenwel een publicatie van KLING ^), die in dit verband een nadere bespreking eischt.
Deze onderzoeker toonde aan, dat het door hem bereide 2—3 butyleenglycol onder den invloed van de sorbose-bacterie tot acetylmethylcarbinol werd geoxydeerd. KLING geeft niet op, welk der drie stereoisomere 2—3 butyleenglycolen hij gebruikt heeft. Daar hij het glycol evenwel door reductie van inactief acetylmethylcarbinol met behulp van
natrium-^) A . KLING, Ann. de Chimie et de Phys. 8e Serie, T 5, p. 471, (1905).
19
amalgaan bereidde, was zijn uitgangsmateriaal optisch in-actief. Dit gecombineerd met het feit, dat hij na de aantasting rechtsdraaiend 2—3 butyleenglycol overhield, deed hem te-recht besluiten, dat dan door de bacterie de linksdraaiende vorm was aangetast.
KLING heeft hieruit verder geen conclusies getrokken. Het moet evenwel verwondering baren, dat aan deze waar-neming in verband met BERTRAND'S regels geen grooter waarde is toegekend. Immers de configuratie van het linksdraaiende 2—3 butyleenglycol kan in de projectie van FISCHER slechts wezen:
CHs CHg H—C—OH of: HO—C—H
I I
HO—C—H H—C—OH
I I
CH3 CH3
In ieder geval hebben wij hierin een voorbeeld van een meerwaardigen alcohol, die in strijd met de soberste formu-leering van BERTRAND — naast de aangetaste OH der CHOH groep toch komt een H atoom van een „groupement sem-blable" aan dezelfde zijde van de koolstofketen voor — wèl door de sorbose-bacterie wordt aangegrepen.
Z o o z i e n wij d u s , h o e bij n a d e r e b e s c h o u -w i n g d e r i n d e l i t e r a t u u r v o o r h a n d e n g e g e v e n s g e e n e n k e l e d e r d r i e g e n o e m d e f o r m u l e e r i n g e n v a n d e d o o r B E R T R A N D o n t d e k t e r e g e l m a t i g h e d e n , s t a n d h o u d t . Intusschen is het uiterst bezwaarlijk uit het voorafgaande een juist inzicht te verkrijgen in de factoren, die de al of niet aantastbaarheid van een verbinding door de sorbose-bacterie bepalen. Het leek dus allereerst aangewezen, het beperkte feitenmateriaal door eigen waarnemingen uit te breiden.
Mijne desbetreffende proefnemingen zullen in het vol-gende hoofdstuk worden behandeld.
EIGEN PROEFNEMINGEN.
f 1. Gebruikt bacteriënmateriaal.
Vanzelfsprekend was het in de eerste plaats noodzakelijk de beschikking te krijgen over een of meer bacteriënstammen, die identiek waren met de door BERTRAND bij zijn onderzoek gebruikte sorbose-bacterie. In dit verband moet evenwel worden opgemerkt, dat van volledige identiteit tusschen twee op verschillende plaatsen geïsoleerde bacteriënstammen nim-mer sprake kan zijn. De ervaring leert nu eenmaal, dat, indien men slechts de criteria steeds meer verscherpt, er tusschen twee op het eerste gezicht overeenkomende bacteriënstammen, altijd wel kleine verschillen zijn te vinden. Om deze reden moest ik er mee volstaan, in de eerste plaats bacteriënstammen te zoeken, die in alle essentieele morphologische, zoo wel als physiologische kenmerken met de door BERTRAND beschreven N bacterie overeenstemmen.
Nu moet er op worden gewezen, dat EMMERLING *) reeds in 1899 aantoonde, dat de sorbose-bacterie identiek was met de door BROWN *) beschreven Bacterium xylinum, een op-vatting waarmede BERTRAND zich later vereenigde. Uit de onderzoekingen van BROWN bleek, dat Bact. xylinum behoorde tot de natuurlijke groep der azijnbacteriën. Deze bacteriën worden in de nieuwere literatuur vereenigd in het geslacht
Acetobacter, zoodat de sorbose-bacterie thans algemeen
aan-geduid wordt als Acetobacter xylinum. Tot mijne beschikking stonden aanvankelijk een viertal stammen van deze bacterie,
1) O. EMMERLING, Ber., Bd. 32, 541, (1899). *) A . BROWN, J . Chem. Soc, Vol. 49, 432, (1886),
21
welke in de verzameling van het Laboratorium voor Micro-biologie aanwezig waren. ^) Deze vier stammen stemden in alle essentieele kenmerken overeen. Om deze reden werd door mij de stam uitgekozen, welke zich bij een vergelijkerii onderzoek over de vorming van dioxyaceton uit glycerine onder de door BERTRAND aangegeven voorwaarden de krach-tigste toonde. Dit was de stam, die in de verzameling het nummer: E. I. 4. 4. 3. draagt en welke kort te voren door Mej.
M. E. ARENDS uit azijn was geïsoleerd. . Intusschen was sedert het onderzoek van BERTRAND wel
reeds aan het licht gekomen, dat er behalve Acetobacter
xylinum een aantal andere azijnbacteriënsoorten bestaan,
welke in morphologisch opzicht buiten twijfel van deze bac-terie afwijken, doch die daarmede, wat hare biochemische eigenschappen betreft, ten zeerste overeenstemmen.
Zoo bewees WATERMAN *), dat de door BEIJERINCK ^) in 1911 geïsoleerde merkwaardige pigmentvormende azijnbacte-rie Acetobacter melanogenum in hare stofwisseling talrijke punten van overeenkomst vertoonde met Acetobacter xylinum. Tijdens mijn onderzoek werd voorts, zooals reeds in de in-leiding vermeld, door DE LEEUW een azijnbacterie geïsoleerd, die door KLUYVER en DE LEEUW *) nader bestudeerd werd en beschreven onder den naam Acetobacter suboxydans. Uit het door hen ingestelde onderzoek bleek ten duidelijkste, hoe deze bacterie geheel als A. xylinum in staat is bij diverse verbindingen voorzichtige oxydaties teweeg te brengen.
Het bleek mij, dat deze bacterie voor de bereiding van dioxyaceton uit glycerine zelfs nog hoogere rendementen opleverde.
^) Later werd nog van Dr. E. B. FRED, Madison, Wisconsin een stam ontvangen, afkomstig uit het Lister Institute in London, welke geen bijzondere kenmerken vertoonde en dus niet verder gebruikt werd.
'^ H. I. WATERMAN, Centr. f. Bakt. II, 37, p. 449, (1913). 3) M. W. BEIJERINCK, Centr. f. Bakt. II, 29, p. 169, (1911). '•) A. J. KLUYVER en F. J. G. DE LEEUW, Tijdschr. vergel. Geneesk. 10, 170, (1924).
Om verschillende redenen leek het mij aangewezen, zoowel
A. melanogenum als A. suboxydans in het onderzoek te
be-trekken.
«.! A. melanogenum werd door DE LEEUW geïsoleerd uit bier. Deze stam is in de verzameling van het Laboratorium voor Microbiologie ingeschreven onder het nummer: E. I. 4. 8. 1. Van A. suboxydans werd door mij dezelfde stam gebezigd als waarvan KLUYVER en DE LEEUW in hun onderzoek hadden gebruik gemaakt. Het nummer in de verzameling is: E. I. 4. 7. 1.
De gebruikte bacteriënstammen, evenals nagenoeg alle later te beschrijven azijnbacteriën zijn door mij gecultiveerd op moutagar, waarin 5 % fijn verdeeld krijt was gesuspen-deerd. Het is gebleken, dat deze toevoeging van krijt aan de voedingsbodem een zeer gunstige werking heeft, daar anders de cultures ten gevolge van de in de cultuurmedia gevormde zuren snel in vitaliteit achteruitgaan. De cultures werden geregeld minstens één keer in de 4 weken overgeënt. Het is vooral voor A. melanogenum van belang deze termijn niet langer te nemen.
§ 2. Gang van het onderzoek.
Allereerst herhaalde ik de proefnemingen van BERTRAND over de aantasting van de suikeralcoholen en suikers, om na te gaan, of ook bij gebruikmaking van mijn drie bacteriënsoor-ten dezelfde resultabacteriënsoor-ten verkregen werden als BERTRAND ver-kreeg met zijn sorbose-bacterie.
Van een uitbreiding der waarnemingen ook over niet door BERTRAND onderzochte suikeralcoholen zag ik af wegens de zeer groote moeilijkheden, die zich voordoen bij het ver-krijgen van zelfs kleine hoeveelheden dier veelal zeldzame stoffen. Slechts de pentiet adoniet, die niet door BERTRAND onderzocht was, werd op aantastbaarheid door A. suboxydans getoetst.
23
Het feit, dat de in het vorige hoofdstuk vermelde onder-zoekingen van KLING, betreffende de aantastbaarheid van een optisch actief butyleenglycol door de sorbose-bacterie, in strijd waren met de door BERTRAND gegeven beschouwingen, deed het gewenscht voorkomen ook dit resultaat te verifi-eeren. Het sprak vanzelf, dat in dit verband mijn verlangen er speciaal naar uitging ook het gedrag der optisch actieve erythrieten te leeren kennen. Deze verbindingen toch kan men zich uit de 2—3 butyleenglycolen ontstaan denken door vervanging van twee H-atomen aan de eindstandige C-atomen door OH groepen. Het mag nu verwondering wekken, dat BERTRAND, die tot dusver vrijwel de eenige onderzoeker is geweest, welke d-erythriet in handen heeft gehad en die in zijn eerder besproken samenvattende verhandeling uitvoerig over de bereiding en de eigenschappen van deze stof spreekt, niets mededeelt over de aantastbaarheid van deze stof door de sorbose-bacterie. Tijdens mijn verblijf in het laborato-rium van Professor BERTRAND, in het „Institut Pasteur" te Parijs, vestigde ik zijn aandacht op de belangrijkheid van dit punt. Professor BERTRAND deelde mij mede, dat een desbe-treffend onderzoek door hem reeds was verricht, doch kon geen vrijheid vinden, mij met de resultaten in kennis te stellen. In verband hiermede was het hem ook niet mogelijk mij iets, zij het slechts een kleine hoeveelheid, van de hem nog ter beschikking staande d- en 1-erythriet af te staan. Om deze reden meende ik van een nader onderzoek op dit punt te moeten afzien.
De waametning van KLING ^), dat linksdraaiend a-propy-leenglycol aangetast werd, kwam eveneens zeer voor verifi-catie in aanmerking, aangezien deze stof staat tusschen het aantastbare 2—3 butyleenglycol en het aethyleenglycol, waar-voor BERTRAND aangeeft, dat het niet zou worden aangegrepen. Ook het gedrag van het aethyleenglycol werd vanzelfsprekend nogmaals nader onderzocht.
Een bestudeering van het gedrag van melkzuur, wat toch uit het G-propyleenglycol is afgeleid te denken door vervan-ging der CHjOH groep door COOH, leek nu van belang. Het denkbeeld lag voor de hand, ook het gedrag van een alcohol te bestudeeren, waarin behalve in de aan te tasten secondaire CHOH groep geen enkele OH groep aanwezig was. Hiervoor was isopropylalcohol aangewezen.
Vervolgens werd het gedrag van den tertiairen butylalcohol bestudeerd, een verbinding, waarin dus slechts een tertiaire OH groep voorkomt.
Tenslotte werden de waarnemingen uitgebreid tot een aantal primaire eenwaardige alcoholen.
Het resultaat van al deze proefnemingen is in de volgende paragrafen neergelegd.
§ 3. Proeven met door Bertrand onderzochte
suikeralcoholen en suikers.
In overeenstemming met BERTRAND'S waarnemingen bleken perseït, manniet, sorbiet, erythriet en glycerine in 2 % op-lossing in gistwater gebracht, aantastbaar te zijn door A.
xylinum. Ook A. melanogenum en A. suboxydans gaven een
zelfde resultaat te zien. Steeds kon de vorming der suikers vervolgd worden door bepaling der reductie van FEHLING'S proefvocht. De biochemische bereiding van dioxyaceton, zoo-als BERTRAND die voor zijn sorbose-bacterie beschrijft, gelukte ook met A. xylinum en A. suboxydans. Wellicht moge hier een voorschrift voor een dergelijke bereiding volgen ten dienste van hen, die het anders moeilijk toegankelijke dioxyaceton, ook op deze wijze zouden willen bereiden. ^)
In literkolven (ERLENMEYERS) brengt men 250 cc. gist-') Later is A. suboxydans ook nog door andere onderzoekers gebruikt voor de bereiding van dioxyaceton. Zie hiervoor: A. J. LE FÈVRE. Diss.Utrecht, p. 12, (1924) en B. SJOLLEMA en L. SEEKLES, Ree. 44, p. 82, (1925).
as
water (0,5 % extract) en 5 gram glycerine. De kolven worden van wattenproppen voorzien en gesteriliseerd. Na afkoelen wordt geënt met 0,1 cc. van een jonge cultuur van A.
suboxy-dans (in glycerine-gistwater bijv.). Men vervolgt de vorming
van dioxyaceton door bepaling der reductie. Als de reductie niet meer toeneemt, gewoonlijk na ongeveer 10 dagen, fil-treert men af van een groot deel der bacteriënmassa en dampt bij lage temperatuur de vloeistof in (niet boven 25—30° C) *). Men voegt bij de overblijvende stroop eerst langzaam 5 x het volume aan alcohol (absoluut) en daarna aether, waardoor de onzuiverheden neerslaan. De bovenstaande heldere vloei-stof wordt voorzichtig ingedampt, waarbij de temperatuur 20—25° niet mag overschrijden. De verkregen stroop wordt in een vacuum-exsiccator gebracht. Na korten tijd ontstaan kristallen, die na wasschen met kouden absoluten alcohol een helder wit product geven. Smeltpunt: 79—80° C.
De waarneming van BERTRAND, dat dulciet onaantastbaar was door de sorbose-bacterie werd voor A. suboxydans, A.
xylinum en A. melanogenum bevestigd gevonden.
Ook de door BERTRAND beschreven oxydaties der aldosen tot aldonzuren konden voor de drie beschreven bacteriën worden vastgesteld.
§ 4. Proeven met adoniet.
De gebruikte adoniet was een preparaat van MERCK en vertoonde het juiste smeltpunt: 102° C. Een 2 % oplossing werd op de gebruikelijke wijze gesteriliseerd en geënt met een cultuur van A. suboxydans. Na 3 dagen was reeds groei te bespeuren, die na verloop van een week sterk was toege-nomen. Door jodometrische suikerbepalingen volgens SCHOORL
') Hiervoor is zeer bruikbaar een apparaat door FAUST-HEIM ontworpen en door LAUTENSCHLAGER in den handel gebracht. Zie bv. OHLMi)LLER-SPiTTA: Untersuchung und Beurteilung des Wassers, p. 421, (1921).
werd de vorming van een reduceerende stof geconstateerd en vervolgd: > - >'
TABEL I.
Aantal cc. 0,1 n. natriumthiosulfaat, overeenkomende met 1 cc. van de cultuurvloeistof: gistwater + 2 % adoniet. Aantal dagen Aantal cc. 0 0,10 4, 4,80 7 7,20 27 9,30 Na verloop van 4 weken werd de vloeistof geanalyseerd. Hiertoe werd deze in het eerder genoemde apparaat van FAUST-HEIM tot stroopdikte ingedampt. Deze stroop werd gemengd met een oplossing van 0,5 gram p-nitrophenyl-hydrazine in 5 cc. ijsazijn -I- 10 cc. water. Op het waterbad werd de vloeistof nu 15 minuten verwarmd, waarbij een rood neerslag ontstaat, dat na afkoelen, affiltreeren en wasschen met verdund azijnzuur, water en absoluten alcohol in een ex-siccator gedroogd werd. Het smeltpunt van dit osazon bleek te zijn 252° C.
Het adoniet is vermoedelijk door A. suboxydans omgezet in een ketopentose: H H H H H
I I I I I
CHjsOH—C—C—C—CHjOH -> CH^OH—C—C—C—CH.OH. I l l I I II ' OH OH OH OH OH ODeze suiker zou men in overeenstemming met de door BERTRAND gekozen benamingen kunnen noemen: adoninulose.
Van de normale ketopentosen is nog geen enkele in zuiveren toestand bekend. Wellicht biedt ook hier de biochemische methode een middel om op eenvoudige wijze uit adoniet deze ketopentose te bereiden. Daar mij echter geen groote hoe-veelheden adoniet ter beschikking stonden, zag ik van een nader onderzoek in deze richting af.
s * *
-71
§ 5. Proeven met 2—3 butyleenglycol.
KLING ^) had bij zijne proeven geconstateerd, hoe het linksdraaiende 2—3 butyleenglycol door de door hem gebruikte
Mycoderma aceti *) en door de sorbose-bacterie in
acetyl-methylcarbinol werd omgezet, terwijl rechtsdraaiend 2—3 butyleenglycol in de oorspronkelijke oplossing achterbleef. Voor mijne proeven maakte ik gebruik van butyleenglycol, dat door LEEFLANG in het laboratorium voor Micro-biologie langs biochemischen weg met behulp van Bact.
aerogenes uit glucose was b e r e i d . ' ) Dit glycol was een
waterheldere visceuze vloeistof, welke FEHLING'S proeftocht niet reduceerde en vertoonde in 10 % waterige oplossing, welke verzadigd was met borax, een draaiing van + 1,35° in een 20 c m buis. Het kookpunt was zeer constant: 180—
181° C. Het was dus wel zeer waarschijnlijk, dat wij hier een mengsel van d- en 1- verbinding in handen hadden met een overmaat van den rechtsdraaienden vorm. Indien i-vorm aanwezig ware geweest, zou het kookpunt niet zoo constant zijn gevonden. Het is toch een bekend feit, dat de physische constanten van intramoleculair inactieven vorm en die der optisch actieve vormen steeds van elkaar verschillen.
^) KLING. 1.C. p. 551.
*) De door PASTEUR gebruikte benaming voor de door hem onderzochte bacteriën der wijnazijnbereiding volgens de Orleans-methode. Welke azijnbacteriesoort door KLING bij deze proef-nemingen werd toegepast, laat zich achteraf niet meer vaststellen.
') Het gebruikte 2—3 butyleenglycol was als volgt verkregen: Men brengt een vloeistof van de volgende samenstelling in kolven met kwikafsluiüng:
leidingwater 0,1 % K^HPO, 0,05 % MgSO, 0,1 % (NHJaSO* 10 % gistwater 5 % glucose 2 % krijt.
28
Het bleek mij nu, dat zoowel A. xylinum als A.
suboxy-dans in staat waren dit glycol om te zetten in
acetylmethyl-carbinol. D u s :
CHg CHj CH3 CH3 H—C—OH C = O (en) HO—C—H HO—C—H
I -^ I ( o f ) I - > I
HO—C—H HO—C—H H—C—OH C = 0 I I I I CHg CH3 CH3 Cn^ Voor deze proeven werden 2 % oplossingen van het 2—3
butyleenglycol in gistwater na sterilisatie geënt met A. xylinum of A. suboxydans. Het gevormde acetylmethylcarbinol is aan te toonen door gebruik te maken van de methode van
LEMOIGNE 1), die door KLUYVER, DONKER en mij bruikbaar is gemaakt voor toepassing op diverse cultuurvloeistoffen. *) Het verloop der door de bacteriën bewerkte oxydatie is te volgen door bepaling van de reductie van FEHLING'S proef-vocht. De hoeveelheid 2—3 butyleenglycol, die tot acetyl-methylcarbinol geoxydeerd was, kon hieruit worden berekend. Het acetylmethylcarbinol, dat steeds een sterke rechtsdraaiing vertoonde, werd tevens nog nader geïdentificeerd door de bereiding van een osazon met behulp van phenylhydrazine. Dit osazon had een smeltpunt 243—245° C, terwijl in de lite-ratuur opgegeven staat 242—243° C. Ook uit de hoeveelheid na 2—4 dagen is de gisting afgeloopen. De suiker is dan verdwenen. Van het krijt wordt dan afgefiltreerd. De vloeistof wordt bij lage temperatuur ingedampt tot een dikke stroop. Deze stroop met watervrij Na2S04 opgewreven, en met aether geëxtraheerd. Uit het verkregen extract wordt de aether verwijderd. Het zoo verkregen ruwe glycol wordt met tetrachloorkoolstof gemengd. Deze wordt afgedestilleerd, waarbij dan een groot deel van het water wordt mede genomen. Ten slotte wordt het glycol door destillatie in vacuum gezuiverd. Het aldus verkregen watervrije product, in een exsiccator boven zwavelzuur bewaard, stolt tot een kristalmassa.
1) M. LEMOIGNE. Compt. rend. 170, p. 131, (1920).
*) A. J. KLUYVER, H . J. L. DONKER en F . VISSER 'T HOOFT.
^fv^^^lP^<mp«imR^ip«ipiw^^mp|pnpvn|inpfii**P
3»
osazon kon worden berekend, hoeveel 2—3 butyleenglycol op de beschreven wijze geoxydeerd was. Deze twee cijfers stemden tot op 5 % met elkaar overeen, wat als bevredigend te be-schouwen is, daar een osazon nimmer zonder verliezen te bereiden is. De zoo verkregen cijfers voor de hoeveelheden 2—3 butyleenglycol, die door de bacteriën waren omgezet in acetylmethylcarbinol, waren voor A. suboxydans 77 % en voor A. xylinum 49 %. Het bleek hierbij, dat A. xylinum in staat was het acetylmethylcarbinol verder te oxydeeren, vermoedelijk over het diacetyl, dat steeds in kleine hoeveel-heden, ook bij A. suboxydans in de cultuurvloeistoffen is aan te toonen. Door de bereidwilligheid van Dr. A. KLING te Parijs kwam ik in het bezit van een kleine hoeveelheid van het door hem bij zijne eerste proeven gebruikte 2—3 butyleen-glycol. Ook dit glycol, dat dus zooals reeds eerder uiteen-gezet is, een inactief mengsel van d- en 1- vorm was, werd door de genoemde bacteriën in acetylmethylcarbinol omgezet, waarbij de opbrengsten voor A. suboxydans en A. xylinum respectievelijk 71,5 % en 43,5 % bedroegen. Hier blijkt dus, dat in afwijking van KLING'S opvattingen, althans voor A,
suboxydans zoowel d- als 1-vorm aantastbaar moeten zijn.')
Voor A. xylinum is dit eveneens zeer waarschijnhjk, doch wordt het rendement lager dan 50 % gevonden, daar deze bacterie het gevormde acetylmethylcarbinol direct voor een deel verder oxydeert. *)
Deze proeven leeren ons d u s , dat de twee optische antipoden beide aantastbaar kunnen zijn voor de bacteriën en dat het feit, dat KLING na de oxydatie door de bacteriën een actief 2—3 butyleenglycol overhield, toe te schrijven moet zijn aan een verschil in de oxydatiesnelheid van d- en 1-vorm.
^) In overeenstemming met de waarneming van KLING kon aangetoond worden, dat het achterblijvende glycol, hetwelk van te voren zorgvuldig van de laatste sporen acetylmethylcarbinol was bevrijd, een rechtsdraaiing vertoonde.
") Op dit merkwaardige verschil in gedrag van A. suboxydans en A. xylinum zal ik nog nader terugkomen.
Het is wellicht gewenscht, bij dit laatste punt even stil te staan. D e bekende onderzoekingen van E M I L FISCHER*) over de vergistbaarheid der stereoisomere hexosen door de alcoholgist en over de splitsbaarheid van stereoisomere glucosiden door emulsine en maltase hebben bij velen de opvatting doen ont-staan, dat biochemische agentia gekenmerkt zijn door een absoluut asymmetrisch karakter. Om deze reden is het van belang er hier ter plaatse op te wijzen, dat M A C - K E N Z I E en
HARDEN^), PFEFFER^), U L P I A N I en CONDELLI*), PRINGSHEIM^) e.a.
de juistheid van deze zienswijze hebben bestreden op grond van het feit, dat in de door hen bestudeerde gevallen nagenoeg steeds de beide optische antipoden werden aangetast. Daarbij viel dan slechts een veelal gering verschil in snelheid van aantasting der beide antipoden te constateeren. Een afzon-derlijke vermelding verdienen nog de proefnemingen van FELixEHRLiCH«),die bij zijne onderzoekingen over de aantasting van racemische aminozuren door de alcoholgist in vele gevallen een zoodanig verschil in snelheid van aantasting vaststelde, dat men bijna van een asymmetrische aantasting zou kunnen spreken. Daartegenover stonden echter ook enkele gevallen, waarin de beide antipoden practisch even snel werden aangetast. Ter verklaring wijst EHRLICH er op, dat van de symmetrisch aangetaste aminozuren beide componenten in de natuur zouden zijn aangetroffen, zoodat men hierin een instelling van de gist op de realiteit zou kunnen zien. D e juistheid van het uitgangs-punt van EHRLICH'S verklaring wordt evenwel door
PRINGS-HEIM op goede gronden bestreden,
Het is nu opmerkelijk, dat de onderzoekers, welke het ') Zie o.a. E. FISCHER. Ber. 27, p. 2992, (1894).
') MAC-KENZIE en HARDEN. Journ. Chem. Soc. 83, p. 424, (1903).
3) W. PFEFFER. Jahrb. für wissensch. Bot. 28, p. 205, (1895). *) ULPIANI en CONDELLI. Gazz. Chim. Itahana. 30, p. 344, (1900); 34, p. 86, (1904); 51, p. 309, (1921).
5) H . PRINGSHEIM. Zeitschr. f. Physiol. Ch. 65, p. 97, (1910). «) F . EHRLICH. Biochem. Z. 1, p. 8, (1906), 8, p. 438, (1908), 63. p . 379, (1914).
31
asymmetrisch karakter der aantasting op de voorgrond schui-ven, dit doen op grond van waarnemingen met hydrolyseerende enzymen en van fermentatieve omzettingen, terwijl de talrijke onderzoekers, die aantoonden, dat beide antipoden met merkbare snelheid worden aangegrepen, daarbij oxydatie-ve Omzettingen bestudeerden. Het zou nu ongetwijfeld van belang zijn, dit gezichtspunt nader te vervolgen en te analy-seeren. Ik wil er hier ter plaatse intusschen mede volstaan met vast te stellen, dat de door mij verrichte waarnemingen omtrent de aantasting van het d- 1- 2—3 butyleenglycol geheel in het kader der bovengenoemde oxydatieve omzettingen passen.
§ 6. Proeven met a-propyleenglycol,
KLING had met de sorbose-bacterie en met zijn Mycoderma
aceti aantasting geconstateerd van den linksdraaienden vorm,
die omgezet werd in acetol. De rechtsdraaiende vorm van het a-propyleenglycol bleef in de oplossing achter.
Ik gebruikte zoowel d- 1- a-propyleenglycol afkomstig van KAHLBAUM, als glycol, dat door mij zelf bereid was uit glycerine en natriumhydroxyd ^) en gereinigd volgens KLING. *)
Het bleek mij, dat dit glycol door de bacteriën voor een belangrijk deel werd omgezet in acetol. Dus:
€ 3 ^ CHj CH3 CHg
I l I I
H—C—OH -*- C = O (en) HO—C—H -> C = O. 1 I
( o f )
I ICHjOH CH2OH CH2OH CHjOH Voor mijne proefnemingen bereidde ik weer 2 % oplossin-gen van het a-propyleenglycol in gistwater, die na sterilisatie geënt werden met A. xylinum en A. suboxydans. Als
voor-1) A. NEF, A . 335, p. 291, (1904). *) A. KLING, 1. c.
naamste oxydatieproduct werd steeds gevonden : acetol, dat geïdentificeerd werd door de bereiding van het phenyl-osazon. Dit had het juiste smeltpunt: 146° C. Naast acetol konden meestal kleine hoeveelheden azijnzuur worden aan-getoond en met behulp van de boven beschreven reactie van LEMOIGNE ook acetylmethylcarbinol. Het ontstaan van deze beide stoffen is duidelijk, indien men bedenkt, dat de verdere oxydatie van acetol tot pyrodruivenzuur kan leiden, dat dan over het acetaldehyd óf tot azijnzuur geoxydeerd óf tot acetyl-methylcarbinol gecondenseerd kan worden.
Door bepaling der reductie van FEHLING'S proefvocht werd de hoeveelheid gevormd acetol gevonden en berekend met be-hulp van de door KLING gevonden waarden, hoeveel a-pro-pyleenglycol daarin was omgezet. Hiervoor werd bij A.
suboxydans en A. xylinum respectievelijk gevonden 69,5 %
en 66,0 %, zoodat, zelfs indien men aanneemt, dat deze cijfers eenigszins geflatteerd zijn, doordat het gevormde acetyl-methylcarbinol sterker reduceert dan acetol, men mag beslui-ten, dat zoowel d- als 1-vorm van het d- 1- a-propyleenglycol aangetast zijn door de bacteriën.
Ook hier mag men dus weer slechts van een verschil in de snelheid van aantasting der antipoden spreken.
§ 7. Proeven met aethyleenglycol.
Volgens BERTRAND wordt aethyleenglycol niet door de sor-bosebacterie aangetast. BROWN ^) echter had in 1887 reeds aan-getoond, dat glycol door een bepaalde azijnbacterie in gly-colzuur werd omgezet, terwijl HENNEBERG *) de vorming van een zuur aantoonde in met A. xylinum geënte glycolhoudende media. Ook toonde SEIFERT *) aan, dat enkele der door hem
1) BROWN. Journ. Chem. Soc. Vol. 51, p. 638, (1887).
") HENNEBERG. Die deutsche Essigindustrie, Bd. 2, Nr. 19, (1898).
3) SEIFERT. Centr. f. Bakt. II, Bd, 3, p. 386, (1897).
*.
S3
bestudeerde azijnbacteriënsoorten, nl. B. Pasteurianam en
B. Kutzingianum glycol tot glycolzuur oxydeerden. WATER-MAN 1) vond, dat glycol als voedsel voor A. melanogenum kon dienen.
Het bleek mij, dat glycol door A. xylinum, A. suboxydans en A. melanogenum tot glycolzuur werd geoxydeerd: .
CHgOH—CHjOH -> CHjOH—COOH.
Bij mijne proeven gebruikte ik 2 %-ige oplossingen van glycol (Pur Poulenc, nog eenmaal door mij in vacuum over-gedestilleerd) in gistwater, die gesteriliseerd werden en daarna geënt uit reinculturen van A. xylinum, A. melanogenum of
A. suboxydans. Er werd tegelijkertijd een serie ingezet, waarbij
aan de oplossing wat krijt was toegevoegd, naar aanleiding van het feit, dat BROWN had geconstateerd, dat dit de groei bevorderde door binding van het gevormde zuur,
De kolfjes werden in den thermostaat van 30° geplaatst, Na enkele dagen was steeds een duidelijke groei waar-neembaar, De niet met krijt voorziene media vertoonden dan een duidelijk zure reactie. Als de vloeistoffen weder helder waren geworden, doordat de bacteriën zich op den bodem hadden afgezet, werden de proeven afgebroken,
Het gevormde glycolzuur werd afgezonderd als Ca-zout, door zoo noodig verzadigen van de vloeistof met krijt, affil-treeren, indampen en omkristalliseeren van de gevormde kristallen.
Het gevormde Ca-zout, werd gedroogd bij 120° tot con-stant gewicht en daarna met H^SO^ omgezet in CaSO»,
Gevonden: Berekend voor (CH,OH—COO),Ca: 0,0482 gr. zout 0,0344 gr. CaSO* 0,0345 gr. 0,0707 gr, zout 0,0500 gr, CaSO* 0,0506 gr. ') WATERMAN. Centr. f. Bakt. II, Bd, 38, p, 460, (1913).
De opbrengsten aan zuiver calciumglycolaat bedroegen on-geveer 25 % van de toegevoegde hoeveelheid glycol bij ver-werking van een cultuur van 3 weken, In werkelijkheid moet echter veel meer omgezet zijn, daar de afscheiding van het glycolaat uit het resteerende glycol zeer onvolledig is,
Bij afdestilleeren der cultuurvloeistoffen werd steeds waar-genomen, dat er in het destillaat een vluchtige reduceerende stof voorkwam,
Pogingen om deze stof nader te identificeeren mislukten, daar de hoeveelheid te gering was en ophooping door rectifi-catie niet slaagde. Het is zeer goed mogelijk, dat deze stof glycolaldehyd is en dus de oxydatie van glycol tot glycolzuur, analoog aan de oxydatie alcohol tot azijnzuur, over het alde-hyd verloopt,
§ 8. Proeven met melkzuur en calciumlactaat.
Dat melkzuur en calciumlactaat geschikt waren als kool-stofvoedsel voor sommige azijnbacteriën, was reeds door SEIFERT ^) en door HOYER *) aangetoond,
Voor mijne proeven gebruikte ik melkzuur (Pur Poulenc) en calciumlactaat (Poulenc), omgekristalliseerd uit water en gedroogd bij 110°, Als cultuurvloeistof diende weder gist-water, dat afzonderlijk gesteriliseerd werd en waaraan dan later de benoodigde hoeveelheid melkzuur of calciumlac-taatoplossing werd toegevoegd. Dit geschiedde, omdat bij een direct samenvoegen tijdens de sterilisatie een neerslag van calciumphosphaten ontstond.
De groei was steeds zeer goed. Temp. 30°, Uit melkzuur (lactaat) bleek steeds, zoowel onder den invloed van A. xylinum
^) SEIFERT, Zeitschr. f. d. landw, Versuchsw, in Oesterreich. Bd. 5, S. 462, (1902).
^) HOYER. Bijdrage tot de kennis der azijnbacteriën. Diss. Leiden, p. 110, 112, (1898).
35
als van A. melanogenum en van A, suboxydans, azijnzuur (acetaat) te ontstaan en wel in aanmerkelijke hoeveelheden:
CHsCHOHCOOH -> CHaCOOH.
TABEL II.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Bacterie. A. suboxydans ,i It ft tl A. melanogenum A. xylinum A. suboxydans tl It A. melagogenum A. xylinum It tl Voedingsvloeistof. Gistw. 114% melkïuur " 1 7 2 « Il tt * / z w " / * / 2 // tl 1 ^ /z tl tl , ly^it Ca-lactaat 1 2 ^ „ „ 1 /2 tl tl 2 l ^ ' /Z0 1 / tl tl , ^ / 2 " " Tijd in weken 3 5 10 geen groei geen groei 3 5 4 % 3 Percentage melkzuur of lactaat omge-zet in azijn-zuur of ace-taat. 60 55 53 — — 43 76 84 16 32De methode van onderzoek was steeds als volgt:
Na affiltreeren van de bacteriën, werd de vloeistof met calciumcarbonaat verzadigd, weder afgefiltreerd en bij lage temperatuur ( ± 50°) in vacuum ingedampt. Dit om mogelijke vluchtige verbindingen af te zonderen. Het destillaat werd steeds afzonderlijk onderzocht, waarop later terug zal worden gekomen. De neutraal reageerende resteerende vloeistof werd na afkoelen verzadigd met iets meer dan de berekende hoe-veelheid wijnsteenzuur om de gebonden vluchtige zuren weder in vrijheid te stellen. Een groot deel van de calcium-zouten slaat nu neer als calciumtartraat, dat kan worden afge-filtreerd. 110 cc. van de nu verkregen vloeistof werden aan een destillatie volgens DUCLAUX onderworpen. Deze destillatie stelde de aard en de hoeveelheid der aanwezige vluchtige vet-zuren vast. Steeds werd hier slechts azijnzuur gevonden,
Het oorspronkelijke melkzuur was d, 1 en waar de rende-menten meer als 50 % beliepen en nimmer optisch actieve resten werden gevonden, moeten wij aannemen, dat beide componenten even snel worden aangetast.
§ 9, Proeven met isopropylalcohol.
SEIFERT ^) vond, dat deze stof niet als voedsel kon dienen voor de door hem onderzochte azijnbacteriën, HENNEBERG •) deed dezelfde ervaring op bij enkele andere soorten. Hunne negatieve resultaten zijn vermoedelijk daaraan te wijten, dat zij slechts zuurvorming poogden te constateeren,
Ik maakte voor mijne proeven gebruik van isopropylalcohol van POULENC, die na enkele malen fractioneeren een kookpunt: 81—82° C bezat.
Het bleek mij, dat de drie genoemde bacteriën in staat waren dezen alcohol in aceton om te zetten. Dus:
CHs—CHOH—CHa -> CHs—CO—CHg.
Deze proeven werden weder verricht met 2 % oplossingen in gistwater. De opgekookte isopropylalcohol werd na steri-lisatie van het gistwater, onder de gebruikelijke voorzorgen tegen infectie, toegevoegd. Daarna werd geënt met reincul-tures van A. xylinum, A. melanogenum of A, suboxydans. Er trad steeds goede groei op en na verloop van 1—3 weken werd de vloeistof onderzocht.
De neutrale, niet reduceerende vloeistof werd aan een destillatie onderworpen. De eerste fractie gaf de reactie van DENIGÈS *) op aceton. De volgende fractie's niet meer.
Het aceton werd geïdentificeerd als p-nitrophenylhydrazon
1) SEIFERT. 1. c. p, 348, ^ HENNEBERG, 1. c. p. 147.
*) Zie o.a. G, BERTRAND et P, THOMAS. Guide pour les mani-pulations de Chimie biologique, p. 406, (1919),
37
volgens ALBERDA VAN EKENSTEIN ^). Deze geeft op als
smelt-punt : 141° C. Door mij werd het p-nitrophenylhydrazon van aceton bereid en het smeltpunt bepaald op het blok van MAQUENNE als: 145° C.
Het smeltpunt van het uit het destillaat der cultuur ver-kregen hydrazon was: 144° C , zoodat hierdoor wel de iden-titeit bewezen is,
Bij latere proeven was het gevormde aceton dikwijls reeds door den reuk waar te nemen. Aanvankelijk ondernomen proeven ter bepaling van de hoeveelheden gevormd aceton en achtergebleven isopropylalcohol werden niet voortgezet, toen bleek, dat onder de omstandigheden, waaronder de proeven werden genomen (30° C , in Erlenmeyerkolven) in 6 dagen ongeveer 16 % van het aceton en 10 % van de isopropylal-cohol uit een 2 % oplossing verdampten. De noodzakelijkheid van sterken luchttoevoer voor den groei der bacteriën maakt een afsluiten der kolven bezwaarlijk.
De hoeveelheden gevormd hydrazon waren echter zeer aan-merkelijk.
§ 10. Proeven met tertiairen butylalcohol.
De gebruikte tertiaire butylalcohol, van KAHLBAUM af-komstig, werd eenmaal overgedestilleerd en had een kookpunt van: 81,5° C. Een 2 % oplossing van dezen alcohol in gistwater gaf na enting met A. suboxydans ook na langeren tijd geen ontwikkeling der bacterie te zien.
Tertiaire butylalcohol wordt dus niet door A. suboxydans aangetast.
§ 11. Proeven met eenwaardige primaire
alcoholen.
De oxydatie van aethylalcohol tot azijnzuur is voor diverse *) ALBERDA VAN EKENSTEIN. Ree. 22, p. 434, (1903) en 24, p. 33, (1905).
bacteriën door verschillende onderzoekers vastgesteld. Ook de oxydatie van andere eenwaardige primaire alcoholen werd reeds voor verschillende azijnbacteriën bestudeerd. De verkregen resultaten waren echter niet steeds met elkaar in overeenstemming, zoodat LAFAR ^) opmerkt, dat deze quaestie
dringend opnieuw onderzocht behoorde te worden. Hier interesseert ons echter slechts de aantastbaarheid der een-waardige primaire alcoholen door bacteriën van het type der sorbose-bacterie.
Ik bestudeerde hiertoe het gedrag van A. suboxydans ten opzichte van: 1. methylalcohol 2. aethylalcohol 3. propylalcohol 4. butylalcohol 5. isobutylalcohol 6. amylalcohol.
Ook in deze gevallen werden de proeven bij 30° C. verricht. 1. Methylalcohol.
Uitgegaan werd van zuiveren methylalcohol van KAHLBAUM, die nog eenmaal overgedestilleerd werd. Gebruikt werd de fractie met een kookpunt van: 65°—66° C. Hiervan werd 2 cc, telkens in kolfjes steriel gistwater gebracht, ieder bevattende
100 cc. Geënt werd met een jonge cultuur van A. suboxydans. Na 3 dagen was er een geringe bacteriënontwikkeling te bespeuren, die na verloop van een week niet meer scheen toe te nemen. Er was toen een geringe hoeveelheid zuur in de vloeistoffen aan te toonen:
1 cc. van de vloeistof = 0,30 cc. 0,1 n. loog.
Bij de analyse der cultuurvloeistof kon in het destillaat een zuur worden aangetoond, dat HgCl, tot HgCl reduceerde en
''f#»'*
ê9
AgNOg tot Ag. Vermoedelijk was dus een kleine hoeveelheid mierenzuur ontstaan:
CH3OH -> CHOOH. 2. Aethylalcohol.
Gebruikt werd zuivere absolute alcohol met een kook-punt: 78—79°. Hiervan werd telkens 2 cc. in kolfjes gebracht, die 100 cc. steriel gistwater bevatten. Geënt werd met A.
suboxydans.
Na 1 dag was reeds duidelijk groei waar te nemen. De vorming van azijnzuur werd vervolgd door titratie met loog. Hierbij werden de volgende cijfers verkregen:
TABEL III,
Aantal cc, 0,1 n. loog, geneutraliseerd door 1 cc. van het cultuurmedium: gistwater + 1,6 % aethylalcohol.
Aantal dagen 4 Aantal cc. 3,20 8 3,35 16 3,45 30 3,45 Het gevormde azijnzuur werd geïdentificeerd door middel van een bepaling volgens DUCLAUX. A. suboxydans blijkt aethylalcohol onder de boven beschreven omstandigheden vrij-wel quantitatief in azijnzuur om te zetten:
CHaCHjOH -> CH3COOH. 3. Propylalcohol.
Voor deze proeven diende propylalcohol (KAHLBAUM), die eenmaal overgedestilleerd werd. Gebruikt werd de fractie met een kookpunt: 96°—97° C. Hiervan werd in kolfjes, be-vattende 100 cc. steriel gistwater, telkens 2 cc. gebracht. Geënt werd met A. suboxydans. Na 3 dagen was duidelijk groei waar te nemen. De zuurvorming werd vervolgd:
TABEL IV.
Aantal cc. 0,1 n, loog, geneutraliseerd door 1 cc. van het cultuurmedium: gistwater + 1,6 % propylalcohol.
Aantal dagen Aantal cc. 4 1,35 12 1,40 27 1,65 30 1,85 Het gevormde zuur werd geïdentificeerd als propionzuur door een bepaling volgens DUCLAUX.
A. suboxydans blijkt dus onder de gekozen voorwaarden
propylalcohol voor ± 75 % in propionzuur om te zetten: CgHsCHjOH -> C^HjCOOH.
4. Butylalcohol.
De butylalcohol van KAHLBAUM werd eenmaal overgedes-tilleerd. Gebruikt werd de fractie met een kookpunt van: 115°—116° C. Wederom werd in 100 cc. gistwater 2 cc. alcohol gebracht. Geënt werd met A. suboxydans. Na 3 dagen was reeds duidelijk groei waarneembaar. De zuurvorming werd vervolgd:
TABEL V.
Aantal cc, 0,1 n. loog, geneutraliseerd door 1 cc. van het cultuurmedium: gistwater + 1,6 % butylalcohol.
Aantal dagen Aantal cc. 5 1,00 12 1,05 27 1,10 30 1,30 Het gevormde zuur werd als volgt als boterzuur geïden-tificeerd:
De zure vloeistof werd van een overmaat calciumcarbonaat voorzien. Na affiltreeren werd het filtraat ingedampt tot op de helft van het volume. Daarna werd wijnsteenzuur toegevoegd.
41
Dit stelt de zuren weder in vrijheid en tevens slaat het Ca als calciumtartraat neer. De bovenstaande oplossing van het zuur werd aan een destillatie onderworpen. In het zure destillaat werd door calciumcarbonaat het zuur in zijn Ca-zout omgezet. Het zoo zuiver verkregen Ca-zout kon voor enkele microche-mische reactie's dienen (Cu-zout, Ag-zout) en tevens voor de reactie van CURTIUS en FRANZEN ter onderscheiding van n-boterzuur en ison-boterzuur, welke reactie hieronder nader zal worden besproken.
A. suboxydans blijkt dus onder de gegeven omstandigheden
butylalcohol voor ± 60 % in boterzuur te hebben omgezet: CsH,CH,OH -> CaH^COOH.
5. Isobutylalcohol.
De isobutylalcohol van KAHLBAUM afkomstig, werd eenmaal overgedestilleerd. Gebruikt werd de fractie met een kookpunt van: 106°—106,5° C. In 100 cc. gistwater werd weder 2 cc. alcohol gebracht. Geënt werd met A. suboxydans. Na 3 dagen was ook hier reeds duidelijk groei opgetreden. Door titratie werd de zuurvorming vervolgd:
TABEL VI.
Aantal cc. 0,1 n. loog, overeenkomende met 1 cc, van het cultuurmedium: gistwater + 1,6 % isobutylalcohol,
Aantal dagen Aantal cc. 4 0,70 12 0,80 27 1,05 30 1,20 Het gevormde zuur werd, evenals boven bij het n-boter-zuur beschreven is, in den vorm van zijn Ca-zout afgezonderd. Op het verkregen zout en het boven beschreven zout van n-boterzuur werd met goed gevolg de reactie van CURTIUS en
FRANZEN *) toegepast. Deze berust op het feit, dat uit een koud verzadigde oplossing van calciumbutyraat na toevoegen van een gelijk volume aceton direct een brei van fijne kleur-looze blaadjes van Ca(C4H,02)j + HjO ontstaat, terwijl uit een koud verzadigde oplossing van calciumisobutyraat bij een zelfde behandehng eerst na eenigen tijd fijne naaldjes van Ca(C4H,02)a + 4 H 2 0 uitkristalliseeren. Microscopisch zijn de twee verschillende zouten zeer goed te onderscheiden,
A. suboxydans blijkt dus ook isobutylalcohol te kunnen
aantasten en voor ± 55 % om te zetten in isoboterzuur: (CH8),CHCH,0H -> (CH3),CHC00H.
6. Amylalcohol.
De gebruikte amylalcohol bezat een kookpunt van: 128°-129° C. Een 2 % oplossing van dezen alcohol in gistwater bleek na enting met A. suboxydans ook na langeren tijd geen ontwikkeling der bacterie te vertoonen.
Amylalcohol wordt dus niet door A. suboxydans aangetast.
i) CURTIUS en FRANZEN, Annal. d. Chem. 404, p. 116, (1914). Zie ook L. ROSENTHALER. Der Nachweis organischer Verbindun-gen. (1923).
