Przegląd metod przydatnych do laboratoryjnej diagnostyki afrykańskiego pomoru świń – możliwości i ograniczenia

(1)

A

frykański pomór świń (African swine fever – ASF) jest obecnie uważany za najgroźniejszą chorobę zwierząt z rodzi- ny świniowatych (Suidae). Od 2007 r. sytuacja epidemiologiczna w zakresie afry- kańskiego pomoru świń, zwłaszcza na wschodzie Europy, jest bardzo niekorzyst- na. W związku z ostatnimi ogniskami choroby u świń w Rosji, na Ukrainie i Białoru- si należy uznać, że Polska znalazła się aktualnie w strefie realnego zagrożenia ASF.

Podstawą monitorowania sytuacji epi- demiologicznej, kontrolowania nowych ognisk oraz zwalczania afrykańskiego pomoru świń jest szybkie i pewne laboratoryjne rozpoznanie choroby (1, 2, 3). Z tego powodu celowe wydaje się przybliżenie le- karzom wiedzy na temat możliwości i ogra- niczeń wybranych technik przydatnych do laboratoryjnej diagnostyki tej choroby.

Materiał do badań

Należy pamiętać o fundamentalnej zasa- dzie: badanie laboratoryjne zaczyna się już w chlewni. Stąd bardzo duże znaczenie ma dbałość o właściwy dobór i pobór próbek (rodzaj i liczba próbek oraz czas od zaka- żenia do ich pobrania). Materiał do badań diagnostycznych w kierunku afrykańskie- go pomoru świń może być pobierany przy- życiowo (krew) lub pośmiertnie (wycinki tkanek). Optymalnymi narządami do ba- dań wirusologicznych są: krew oraz węzły chłonne, nerka i śledziona, które powinny być pobrane od co najmniej dwóch zwie- rząt padłych lub zabitych w szczycie choroby. Bardzo istotne jest, aby materiał do badań pobrany był w sposób możliwie ste- rylny, do plastikowych lub szklanych szczel- nie zamkniętych pojemników, a następnie w stanie schłodzonym szybko dostarczony do laboratorium. W przypadku próbek krwi należy dodać środki zapobiegające krzepli- wości (np. EDTA lub heparynę) i dokładnie wymieszać zawartość probówki. Z kolei do wykrycia obecności przeciwciał wykorzystuje się surowicę, która powinna być pobrana od świń podejrzanych o zakażenie, chorujących najdłużej (4, 5). Krew do ba- dań serologicznych powinna być pobrana

do probówek bez dodatku EDTA, odwiro- wana celem uzyskania surowicy, a następnie schłodzona lub zamrożona i przesłana do badań. Bardzo ważne jest prawidłowe ozna- kowanie i zapakowanie próbek przed ich transportem. Każda próbka powinna być zapakowana oddzielnie i posiadać czytelną etykietę zawierającą numer identyfikacyjny zwierzęcia, rodzaj próbki oraz datę i miejsce pobrania (1). Szczegółowa informacja odnośnie do zasad pobierania, pakowania i transportu próbek do badań w kierunku afrykańskiego pomoru świń wykonywa- nych w Krajowym Laboratorium Referen- cyjnym ds. ASF w Państwowym Instytucie Weterynaryjnym – Państwowym Instytu- cie Badawczym znajduje się na stronie In- stytutu (www.piwet.pulawy.pl).

Aktualnie dysponujemy panelem sze- regu metod przydatnych do laboratoryjnego rozpoznania afrykańskiego pomoru świń. Pozwalają one na wykrycie antygenu, przeciwciał lub materiału genetycz- nego wirusa.

Badania serologiczne

W przebiegu afrykańskiego pomoru świń wirus znajduje się w krwiobiegu niemal przez całe życie zakażonych świń, począwszy od około 2 dnia po zakażeniu (d.p.z.), a prze- ciwciała syntetyzowane są niezwykle szybko – przeciwciała klasy IgM można wykryć już od około 4 d.p.z., a wtórną odpowiedź humoralną, czyli obecność IgG, można po- twierdzić od około 7–10 d.p.z. Przeciwcia- ła utrzymują się bardzo długo, maksymal- ną ich ilość odnotowuje się w 5–6 tygodniu, równocześnie we krwi można stwierdzić obecność wirusa (1). Zatem krew pobrana po okresie inkubacji, po wystąpieniu pierw- szych objawów wskazujących na zakażenie wirusem afrykańskiego pomoru świń jest próbką optymalną, zarówno do badań wirusologicznych, jak i serologicznych. W tym miejscu należy zwrócić uwagę na fakt, że próbki krwi (surowic) należy traktować jako materiał potencjalnie wysoce zakaźny, któ- ry powinien być badany w laboratoriach po- siadających odpowiedni stopień zabezpie- czenia biologicznego.

Badania serologiczne, mimo iż mogą wykazywać pewien odsetek wyników fał- szywie dodatnich i ujemnych, z uwagi na możliwość jednoczesnej analizy dużej liczby próbek pochodzących od różnych zwie- rząt, krótki czas i łatwość wykonania oraz niski koszt są wykonywane najczęściej. Są one przydatne do wykrywania zwierząt podejrzanych o zakażenie, rozpoznawania po- dostrej i przewlekłej postaci choroby oraz do monitorowania obecności nosicieli wirusa (1, 6). Aktualnie do tego celu wykorzystywane są następujące techniki: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), immunoblotting (IB), test immunoperoksy- dazowy (immunoperoxidase test – IPT) oraz test pośredniej immunofluorescen- cji (indirect immunofluorescence, IIF – 7).

Przegląd metod przydatnych do laboratoryjnej diagnostyki afrykańskiego pomoru świń – możliwości i ograniczenia

Iwona Markowska-Daniel, Edyta Kozak

z Krajowego Laboratorium Referencyjnego ds. ASF Zakładu Chorób Świń Państwowego Instytutu Weterynaryjnego – Państwowego Instytutu Badawczego w Puławach

Survey of the methods useful for laboratory diagnosis of African swine fever – their benefits and limitations

Markowska-Daniel I., Kozak E., Department of Swine Diseases, National Veterinary Research Institute, Pulawy

The aim of this paper was to review and evaluate diagnostic methods used for African swine fever (ASF).

Due to the unfavorable epidemiological situation of ASF in Eastern Europe, this disease is considered as the global pig health priority. Laboratory diagnosis of ASF is a core for contingency plans and disease eradi- cation. The serious risk of ASF virus transmission from Belarus or Russian Federation has forced high level of diagnostic preparedness in our country. Therefore, the overview of the diagnostic methods enabling the detection of antigens, antibodies or genetic materi- al of ASFV, with special emphasis to their advantag- es and limitations was prepared. The choice of the suitable technique depends on the aim of the study, costs, current epidemiological situation and biosafety laboratory conditions. Serological studies are jus- tified due to the possibility of early detection of antibodies in animals suspected of being infected and the monitoring of the virus carriers. However, serological methods are not accurate and results obtained often must be confirmed by more specific and sensitive techniques. In recent years techniques of molecular biology are increasingly used, allowing une- quivocal, very early identification of ASF virus. The real-time PCR, which allows simultaneous, quantitative reading results is used as the only method of choice.

Taking presented facts into account it is recommend- ed to perform serological and virological tests simul- taneously. Since the ASF virus can be present in the pig blood/serum from 2^nd day post infection till death, the laboratory diagnosis should be performed under proper biosafety conditions to avoid the environment contamination and spread of the virus throughout the country with diagnostic samples.

Keywords: African swine fever, serology, molecular biology techniques.

(2)

ELISA jako technika prosta, specyficzna, czuła, szybka, ekonomiczna, umożli- wiająca łatwą interpretację wyniku, zna- lazła zastosowanie na dużą skalę. Pozwala ona na osiągnięcie bardzo dobrej powta- rzalności i odtwarzalności. Najczęściej stosuje się test pośredni, w którym mikropłyt- ka opłaszczona jest antygenem (zwykle jest to białko VP73), uzyskanym w komórkach nerki małpy (monkey stable kidney cell line – MS), zainfekowanych szczepem hiszpań- skim (E70) wirusa afrykańskiego pomoru świń. Jako koniugat stosowane jest przeciw- ciało monoklonalne (monoclonal antibody – Mab) wyznakowane peroksydazą. W przypadku obecności przeciwciał w badanej próbce dochodzi do utworzenia komplek- su antygen-przeciwciało, do którego następ- nie przyłącza się koniugat. Po wypłukaniu i dodaniu substratu (najpowszechniej sto- sowanym substratem jest DMAB/MBTH) obserwuje się reakcję barwną, która wska- zuje na obecność przeciwciał. Natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia im- munoglobulin. Aby dokładnie określić stę- żenie przeciwciał, konieczne jest spektro- fotometryczne odczytanie absorbancji przy określonej długości fali, zależnej od substratu, za pomocą automatycznych czytników do ELISA. Badanie trwa ok. 3 godzin. Czu- łość i specyficzność testu przyjmuje odpowiednio wartości ok. 95,8% i 97,3% (7). Pan i wsp. (8) wykazali, że dzięki zastosowaniu testu ELISA można rozpoznać ok. 6% więcej zwierząt zakażonych, w porównaniu z im- munoelektroosmoforezą (immunoelektro- osmophoresis – IEOP).

W celu potwierdzenia dodatniego wyniku w teście ELISA w krajach wolnych od afrykańskiego pomoru świń oraz wyniku wątpliwego na obszarach endemicznego występowania choroby, można stosować różne metody, m.in. IIF, opartą na połą- czeniu technik histologicznych i immu- nologicznych (7, 9, 10). Technika ta skła- da się z dwóch etapów. W pierwszej fazie antygen łączy się z przeciwciałami obec- nymi w badanej próbce, natomiast w drugiej powstałe kompleksy antygen-przeciw- ciało są wykrywane za pomocą przeciwciał drugorzędowych znakowanych barwnikami fluoroscencyjnymi. Najczęściej stosowany jest izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), który po wzbudzeniu emituje ko- lor zielony. Wynik badania odczytuje się przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Można go uzyskać w czasie od kilku godzin do 2 dni. IIF wykazuje większą czułość niż technika bezpośrednia stoso- wana do wykrycia antygenów wirusa afry- kańskiego pomoru świń (7, 10). Pan i wsp.

(8) porównali czułość i swoistość IIF do innych metod. Badania wymienionych auto- rów dowiodły, że IIF jest bardziej czuła niż ELISA (zgodność wynosiła 86%) i zbliżona do IPT (zgodność wynosiła 98%).

Dobrą alternatywą dla IIF jest IB – test zalecany przez OIE i wykorzystywa- ny w Krajowym Laboratorium Referen- cyjnym ds. ASF (10). W pierwszym etapie – elektroforezie w warunkach denaturują- cych, białka są rozdzielane pod wpływem prądu elektrycznego, zależnie od ich masy molekularnej. Na żelu poliakrylamidowym przybierają one postać prążków. Kolejno są one przenoszone na membranę nitro- celulozową pod wpływem napięcia prą- du stałego, przy zastosowaniu stężonych buforów niskojonowych. Bufory wysoko- jonowe nie są wykorzystywane ze wzglę- du na dużą emisję ciepła (7, 11). Następ- nie z membrany wycinane są paski, które poddawane są wysycaniu, najczęściej 2%

mlekiem w proszku, w celu zablokowania wszystkich miejsc niezwiązanych. Doda- tek badanej surowicy z zawartymi w niej przeciwciałami sprawia, że wiążą się one z odpowiednim antygenem. Po odpłukaniu nadmiaru przeciwciał dodawany jest koniugat (przeciwciało drugorzędowe wyznakowane peroksydazą). Powstające immu- nokompleksy uwidaczniają się pod wpły- wem substratu – 4-chloro-1-naftolu (7).

Wynik badania odczytuje się, porównu- jąc wzór białkowy i intensywność koloru prążków do kontrolnych surowic dodatnich (9). Podczas opracowywania testu IB przeprowadzono wiele badań nad zastosowaniem odpowiednich filtrów oraz bu- forów blokujących. Najlepsze właściwości jako membrana wykazywała nitroceluloza, polidifluorek (PVD) i nylon dawały wyż- sze tła. Spośród buforów blokujących naj- bardziej użyteczne okazało się 2% mleko w proszku (12). IB posiada wiele zalet, dla- tego jest powszechnie stosowany jako metoda potwierdzająca obecność przeciwciał swoistych dla wirusa afrykańskiego pomoru świń. Charakteryzuje się wysoką specy- ficznością i czułością (98%), nawet w krót- kim czasie po zakażeniu (7–9 d.p.z.), umoż- liwia prostą interpretację wyników, lepszą identyfikację próbek słabo dodatnich oraz wykrycie bezobjawowych nosicieli. Bar- dzo ważne jest również to, iż IB jest zalecany w przypadku próbek źle zachowanych, które w ELISA mogą wykazywać aż do 20% wyników fałszywie dodatnich (7).

Ponadto stosowanie pasków antygenowych eliminuje ryzyko przeniesienia czynnika zakaźnego, jak ma to miejsce w przypadku rozpuszczalnego antygenu stosowane- go do opłaszczania mikropłytek w teście ELISA. Paski antygenowe przechowywane w temperaturze pokojowej pozostają stabilne przez długi okres (min. 6 miesięcy), bez wpływu na ich przydatność do badań (12).

Kolejnym testem potwierdzającym, za- lecanym przez OIE do wykrywania prze- ciwciał przeciwko wirusowi afrykańskiego pomoru świń, jest IPT, który także jest wy- korzystywany w Krajowym Laboratorium

Referencyjnym ds. ASF. Z uwagi na dużą czułość i specyficzność pozwala on po- twierdzić wyniki dodatnie i wątpliwe uzy- skane w ELISA (zgodność wyników wynosi 87%). W naturalnych warunkach wirus afrykańskiego pomoru świń zakaża ko- mórki układu odpornościowego, mono- cyty oraz makrofagi. IPT oparty jest na zdolności namnażania się wirusa w cyto- plazmie komórek, zwłaszcza linii komór- kowej MS lub Vero, będących źródłem antygenu. Po utrwaleniu płytek i dodaniu badanej surowicy tworzy się kompleks immunologiczny wykrywany po dodaniu koniugatu i substratu (roztworu 3-aminoety- lokarbazolu i dimetyloformamidu). Uzy- skane czerwone zabarwienie cytoplazmy komórek świadczy o wyniku pozytywnym, jasnoróżowe o wątpliwym, a brak zabar- wienia oznacza, że próbka jest ujemna (7).

Dużą zaletą IPT jest odczytywanie wyni- ków przy użyciu mikroskopu ze światłem białym. Pozwala to na przebadanie dużej liczby próbek (nawet do 400 dziennie) (8).

Najnowsze doświadczenia wykazały, iż do rozpoznania ASF metodami ELISA i IPT może być przydatna również ślina (13). Badania Mur i wsp. (13) dowiodły jednak, iż przeciwciała w próbkach surowic pobranych od świń zakażonych szczepem portugalskim NHV/P68 wykrywano w ciągu 8–11 d.p.z., natomiast w ślinie do- piero po upływie 11–30 d.p.z. Pojawienie się przeciwciał w ślinie było skorelowane z mianem przeciwciał w surowicy (w przypadku miana poniżej 1:2500 w surowicy, nie wykrywano jeszcze przeciwciał w śli- nie). Ze względu na koszt badań próbek krwi, a jednocześnie większą możliwość rozprzestrzenienia się wirusa podczas jej pobierania, ślina staje się atrakcyjną alter- natywą w programach nadzoru i zwalczania różnych chorób, w tym także afrykań- skiego pomoru świń.

Wykrywanie antygenów wirusa afrykańskiego pomoru świń

Oprócz metod serologicznych w diagnostyce ASF stosowane są badania wiruso- logiczne, mające na celu wykrycie anty- genów wirusa. Do nich należą ELISA antygenowa (antigen ELISA), bezpośrednia fluorescencja (direct immunofluorescence – DIF) oraz hemadsorpcja (haemadsorp- tion reaction – HAD). Techniką możliwą do zastosowania na dużą skalę, w ostrej postaci choroby, jest ELISA antygenowa (7).

Test przeprowadzany jest w kilku etapach.

W pierwszej fazie płytka jest opłaszczana przeciwciałem specyficznym dla antygenu.

Następnie niezwiązane przeciwciała są od- płukiwane i dodawana jest próbka badana.

Jeśli będzie w niej obecny antygen, utwo- rzy on kompleks immunologiczny z prze- ciwciałem. Po kolejnym etapie płukania

(3)

dodawane jest przeciwciało specyficzne dla antygenu, znakowane enzymem – pe- roksydazą chrzanową (koniugat). W kolejnym etapie do enzymu przyłącza się sub- strat, dając reakcję barwną. Ze względu na brak odpowiedniej czułości metoda nie jest przydatna w przypadkach podostrych i przewlekłych, może wówczas dochodzić do zablokowania oddziaływania antygenu z koniugatem poprzez powstałe kompleksy immunologiczne antygen-przeciw- ciało (14). Z tego powodu podjęto próby ulepszenia testu. Dowiedziono, iż przygo- towanie antygenu i zastosowanie odpowiednich przeciwciał ma znaczny wpływ na poprawę jego swoistości i czułości (15).

Vidal i wsp. (15) porównywali nieoczysz- czony antygen (komórki linii Vero zakażo- ne dawką 20 jtk ASFV /komórkę, ekstrakt zawierał kilka białek) z częściowo oczysz- czonym (białko VP73) oraz Mabs i prze- ciwciała poliklonalne. Dowiedli, iż w przypadku częściowo oczyszczonego antygenu aktywność była 200 razy większa. Przeciw- ciała 18BG3 i 17LD3 reagowały z antygenem VP73 we wszystkich rodzajach eks- traktów, natomiast 1F8 i 19BA2 posiadały tę właściwość wyłącznie dla nieoczysz- czonego produktu. Wynika z tego, iż etap oczyszczania powoduje częściową denatu- rację białka. Zaobserwowano również, iż wykrywalność antygenu w teście opartym na Mabs wyniosła 0, 05 µg/ml białka VP73, a w ELISA z przeciwciałami poliklonalnymi poziom detekcji wynosił 0, 6 µg/ml VP73.

Prowadzono również badania nad wyko- rzystaniem rekombinowanego białka wirusowego jako antygenu i dowiedziono, że wykazuje ono większą czułość w stosunku do surowic w stanie rozkładu (7). Ponad- to eliminuje konieczność pracy z wirusem zakaźnym (16). Gallardo i wsp. (16), sto- sując białka rekombinowane P54, PK205R, PB602L i PA104R, uzyskali zgodność dla większości badanych próbek z technikami rekomendowanymi przez OIE, z użyciem białek klasycznych. W przypadku nega- tywnych próbek europejskich specyficz- ność dla białek PA104R i PK205R wyniosła 99%, dla P54 97%, a dla PB602L 95%. Spe- cyficzność ELISA OIE była bardzo zbliżona i wyniosła 95%. W przypadku próbek europejskich dodatnich wyniki również były porównywalne (nieco niższą specyficz- ność zaobserwowano tylko w przypadku białka PA104R), co potwierdza, że białka P54 i PB602L mogą znaleźć zastosowanie w serodiagnostyce ASF. Przeciwciała przeciwko białku P54 są stabilne nawet po dłu- giej inkubacji w 37°C. Wysoką specyficz- ność białek rekombinowanych i ELISA-OIE potwierdzono także w odniesieniu do pró- bek pochodzących z zachodniej i wschodniej Afryki, natomiast w przypadku próbek dodatnich z Ugandy i Mozambiku białka rekombinowane były mniej czułe. Ponadto

zaobserwowano, iż przeciwciała wobec P54 i PB602L pojawiły się po 10 dniach po zakażeniu w odniesieniu do szczepów po- chodzących z Ugandy i Hiszpanii. W przypadku zakażenia hiszpańskim izolatem E75 CV14 miano przeciwciał utrzymy- wało się do 30 d.p.z. Hutchings i wsp. (17) oceniali dwa testy ELISA pośrednie, oparty na zastosowaniu Mab (4H3) i stosują- cy kombinację Mab z surowicą poliko- nalną (przeciwciała królicze anty-śwince morskiej, królicze anty-mysie oraz kozie anty-królicze). Czułość testu opartego na przeciwciałach świnki morskiej i królika była najlepsza dla wirusa o mianie pomię- dzy 2,74 i 6,55 log₁₀ HAD50/ml, natomiast w przypadku połączenia Mab z przeciw- ciałem króliczym najlepszymi wartościa- mi okazały się 3,64 i 6,25 log₁₀ HAD₅₀/ml.

Przydatność obydwu testów w wykrywaniu antygenów różnych szczepów wirusa afrykańskiego pomoru świń była bardzo duża, jednakże test stosujący przeciwcia- ła poliklonalne cechował się nieznacznie większą czułością.

Techniką stosowaną do potwierdzenia pozytywnych wyników testu ELISA antygenowa, w szczególności w przypadku wy- stąpienia ognisk pierwotnych afrykańskie- go pomoru świń, jest izolacja wirusa oraz wykazanie hemadsorpcji – HAD. Z uwagi na pracę z materiałem wysoce zakaźnym badania te mogą być przeprowadzane w laboratoriach spełniających wymagania okre- ślone w decyzji Komisji 2003/422/WE. Izo- lacja wirusa opiera się na zakażeniu homo- genizatem tkanek lub krwi, pochodzącym od świń podejrzanych o zakażenie, hodowli komórkowej pierwotnej szpiku kostnego, leukocytów, monocytów lub makrofagów (14). Hemadsorpcja polega na tym, że ery- trocyty adsorbują do powierzchni komórek zakażonych wirusem afrykańskiego pomoru świń, tworząc charakterystyczne rozety.

W przebiegu zjawiska hemadsorpcji duże znaczenie mają dwa geny – ORF EP402R odpowiada za adhezję krwinek czerwo- nych świni do zakażonych komórek, natomiast ORF EP153R pełni funkcję stabiliza- tora erytrocytów. Po 48–49 godzinach re- plikujący w komórce wirus afrykańskiego pomoru świń wywołuje efekt cytopatyczny (cpe), objawiający się degradacją komórek (7). Wynik odczytuje się przy użyciu mikroskopu, odczyt mający na celu stwier- dzenie hemadsorpcji lub wystąpienie cpe powinien być przeprowadzany codzien- nie, pierwszą obserwację należy wykonać już po upływie 14–16 godzin od zakażenia.

W przypadku próbek silnie dodatnich he- madsorpcję można zauważyć już w ciągu 24 godzin (14). Zastosowanie hemadsorpcji jest przydatne w przypadku ujemnego wyniku innych testów diagnostycznych (10).

Pozytywny wynik HAD jest traktowany jako ostateczny w rozpoznawaniu nowych

ognisk afrykańskiego pomoru świń (14).

Warto nadmienić, że hemadsorpcja jest charakterystyczna dla większości szcze- pów wirusa afrykańskiego pomoru świń, ponadto wirus ten jako jedyny spośród wi- rusów atakujących świnie wywołuje to zja- wisko. Niekiedy można spotkać szczepy niehemadsorpcyjne o niskiej zjadliwości lub wywołujące typową ostrą postać afry- kańskiego pomoru świń. Mimo możliwości wykrycia niskiego miana wirusa afrykań- skiego pomoru świń, hemadsorpcja posiada pewne wady. Do wykonania testu nie- zbędna jest świeża hodowla komórkowa, której podtrzymywanie wiąże się z wie- loma problemami (słaby wzrost, koszty).

Niekiedy przyczynia się to do opóźnienia otrzymania ostatecznego wyniku badania.

W niektórych przypadkach zadeklarowa- nie wyniku ujemnego może nastąpić do- piero po 6 dniach (14, 17).

Innym testem polegającym na wykrywaniu antygenów wirusa afrykańskiego pomoru świń jest DIF. Podobnie jak IPT, technika ta wykazuje wysoką czułość w przypadku ostrej postaci choroby, natomiast w przypadkach podostrych i przewlekłych obserwuje się spadek jej czułości nawet do 40%. Test opiera się na wykrywaniu anty- genów wirusowych w skrawkach lub od- ciskach tkanek pochodzących od świń podejrzanych o zakażenie, za pośrednictwem koniugatu antywirusowego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym (najczę- ściej FITC). W zakażonych komórkach fluoryzuje cytoplazma. Bezpośrednia im- munofluorescencja ma także zastosowanie w wykrywaniu niehemadsorpcyjnych szczepów wirusa afrykańskiego pomoru świń. Ponadto bardzo dobrze rozróżnia efekt cytopatyczny charakterystyczny dla tego wirusa (7, 14). Jednoczesne zastosowanie obydwu technik – DIF i IIF jest bardzo skuteczne, ponieważ w czasie krót- szym niż 3 godziny umożliwia identyfika- cję 89%–95% przypadków afrykańskiego pomoru świń (10).

Badania molekularne

W ostatnich latach coraz większe zastosowanie znajdują techniki biologii molekularnej i inżynierii genetycznej, mające na celu wykrycie DNA wirusa afrykańskiego pomoru świń (6, 14). Najpowszechniej wy- korzystywaną jest łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR). Ze względu na jej wysoką czułość, łatwość i szybkość wykonania (wynik można uzyskać w ciągu 4 godzin), moż- liwe jest bardzo wczesne wykrycie wirusa w badanych próbkach, zanim pojawią się objawy chorobowe u zakażonych zwierząt (7). Ponadto umożliwia ona wykorzystanie różnorodnego materiału biologicznego do izolacji DNA (18). Podobnie jak w przypadku badań wirusologicznych, badania te

(4)

mogą być przeprowadzane w laboratoriach spełniających wymagania określone w decyzji Komisji 2003/422/WE. W przypadku tkanek do badania pobiera się niewiel- ki wycinek, który następnie jest homoge- nizowany i wirowany. Tak przygotowany homogenizat stosuje się jako materiał do izolacji DNA (9). Izolacja DNA rozpoczyna się od inkubacji badanej próbki z proteina- zą K w obecności soli chaotropowych, co doprowadza do rozpadu komórek i uwol- nienia kwasu nukleinowego. Izolacja prze- prowadzana jest na kolumienkach zawie- rających włókna szklane, na których bardzo dobrze osadzają się kwasy nukleinowe, które są następnie oczyszczane w kolej- nych etapach płukania i wirowania. Osta- tecznie DNA jest uwalniane z kolumienki dzięki elucji za pomocą jałowej wody lub odpowiedniego buforu. Wyizolowany DNA stanowi matrycę dla reakcji PCR, przepro- wadzanej w kilku etapach. W pierwszym etapie, w temperaturze 95°C, następuje roz- dzielenie podwójnej nici kwasu nukleinowego. W kolejnym etapie, w niższej temperaturze, odbywa się przyłączenie krótkich odcinków DNA, tzw. starterów (prime- rów) komplementarnych, do odpowiednich fragmentów matrycy. Temperatura, w której przyłączają się startery w przypadku wirusa afrykańskiego pomoru świń wynosi najczęściej 62 i 58°C. Jest ona za- leżna od temperatury topnienia starterów, ściśle powiązanej z ich sekwencją nukle- otydową. W trzecim etapie (temp. 72°C), przy użyciu enzymu polimerazy, następu- je przyłączenie komplementarnych nukle- otydów (dNTPs), co rozpoczyna syntezę drugiej nici kwasu nukleinowego. Prze- prowadzenie PCR jest możliwe dzięki zastosowaniu termocyklerów. W przypadku wirusa afrykańskiego pomoru świń stosuje się 40 cykli amplifikacji, celem powiele- nia fragmentu DNA do bardzo dużej ilości kopii, co pozwala na wizualizację produktu reakcji po zastosowaniu odpowiedniego barwnika. W diagnostyce wirusa afrykań- skiego pomoru świń stosowane są dwa ro- dzaje testów: PCR konwencjonalny i PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR).

Konwencjonalny PCR dla wirusa afrykań- skiego pomoru świń opiera się na zastosowaniu starterów komplementarnych do wysoce konserwatywnego regionu genomu VP72. W celu uwidocznienia produktu PCR konwencjonalnego przygotowu- je się żel agarozowy z dodatkiem bromku etydyny wiążącego DNA. Do specjalnych studzienek w żelu przenosi się mieszaninę reakcyjną powstałą podczas reakcji PCR, kontrolę dodatnią oraz wzorzec masy molekularnej. Mieszanina reakcyjna zawiera odpowiedni barwnik, zwykle bromofenol.

Po przeprowadzeniu elektroforezy, produkty PCR oraz kontrola dodatnia, dzięki działaniu promieni UV uwidaczniają się

na żelu w postaci pojedynczych prążków, natomiast wzorzec molekularny przyjmuje postać drabinki złożonej z wielu prążków.

DNA próbki badanej jest porównywane do wzorca masy molekularnej, dzięki czemu możliwe jest oszacowanie jego wielkości.

Próbkę DNA uznaje się za dodatnią, jeśli prążek na żelu będzie na tej samej wysoko- ści, co prążek kontroli pozytywnej. W kontroli negatywnej nie obserwuje się obecno- ści prążków. Konwencjonalny PCR zalecany przez OIE charakteryzuje się czułością i specyficznością osiągającą blisko 100% (7).

W celu potwierdzenia uzyskanych wy- ników można przeprowadzić trawienie am- plifikowanych produktów PCR za pomocą endonukleaz restrykcyjnych. Agüero i wsp.

(19), używając 10-krotnych rozcieńczeń szczepu Spain 70 o mianie 1, 6 x 10⁶ 50% jednostek hemadsorpcji (HADU₅₀/ml), określili granice wykrywalności testu PCR opartego na VP73. Dzięki analizie sekwencji genomu ograniczonej zestawem starterów PPA-1/2 określili miejsca cięcia restrykcyjnej endo- nukleazy BsmAI oraz podział amplikonu na dwa fragmenty o długości 173 i 84 pz.

Startery PPA-1/2 dawały 10-krotny wzrost czułości PCR, w porównaniu do zestawu starterów OIE, oraz pozwoliły na wykrycie genomu ASFV o 1 dzień wcześniej (już 2 d.p.z.). Startery te zastosowano również do analizy zdegradowanych próbek oraz wy- cinków nerki świń eksperymentalnie zaka- żonych szczepem Lizbon 60 i przechowy- wanych w temperaturze pokojowej przez 14 i 28 dni. Oba zestawy starterów okaza- ły się przydatne, jednak PPA-1/2 wykazały wyższą czułość – 0, 12 HADU₅₀, w porów- naniu do testu zalecanego przez OIE oraz bardzo dużą przydatność do wykrywania światowych izolatów wirusa afrykańskie- go pomoru świń. Metoda ta jest znormali- zowana i może być zastosowana dla próbek krwi, surowicy oraz dla słabo zachowanych tkanek. Ponadto jest bardzo specyficzna, gdyż nie wykazuje fałszywie dodatnich reakcji, a czas osiągnięcia ostatecznego wyniku jest krótszy niż 5 godzin.

Ze względu na manipulację amplifikowa- nych fragmentów, a tym samym większe ryzyko zakażenia, konwencjonalny PCR coraz częściej zastępowany jest przez inne techniki. Jedną z nich jest real-time PCR. Mimo iż jej opracowywanie jest pracochłonne i kosz- towne, posiada ona wiele zalet, w porów- naniu do konwencjonalnego PCR (20). Jest techniką bardziej zautomatyzowaną, czułą, szybką oraz pozwala na jednoczesny, ilościo- wy odczyt wyników i wyeliminowanie reakcji krzyżowych (14, 21). Real-time składa się z analogicznych etapów, jak konwencjonalny PCR, z pominięciem etapu elektroforezy, dzięki czemu eliminuje się szkodliwe dzia- łanie bromku etydyny, natomiast w badaniu wykorzystuje się dodatkowy reagent – son- dę specyficzną dla wysoce konserwatywnego

regionu VP72 ASFV, np. typu TaqMan oraz fluorochromy. Pozwala to na ciągłą obser- wację dynamiki powielania fragmentu DNA na podstawie krzywej określającej intensyw- ność sygnału fluorescencji. W badaniu wy- znacza się tzw. treshold cyklu (Ct) – jest to wartość, w której fluorescencja osiąga wy- krywalny poziom, a jej sygnał przewyższa sygnał tła. Treshold wykazuje wartości od- wrotnie proporcjonalne do ilości amplifiko- wanego fragmentu DNA. Jeżeli wartość Ct będzie poniżej 38, a wykres wystąpi w postaci krzywej sigmoidalnej, próbkę uznajemy za pozytywną. Przy wartościach Ct w prze- dziale 38–40 i w przypadku pojawienia się wykresu sigmoidalnego próbki traktujemy jako wątpliwe, przy braku Ct lub linio wym kształcie wykresu uznajemy je za ujem- ne. Pierwszy real-time PCR do wykrywania ASFV, oparty na białku VP72 i sondzie TaqMan wyznakowanej barwnikami fluore- scencyjnymi (na końcu 3’ 6-carboxy-fluore- sceine (FAM), a na końcu 5’ 6-carboxy-tetra- methyl-rhodamine (TAMRA) został opracowany przez King i wsp. (22). Test wykazał czułość analityczną na poziomie pomię- dzy 10 a 100 kopii (14). Kolejny test oparty na białku strukturalnym VP72, opisany przez Zsak i wsp. (23), podobnie jak w pracy King i wsp. (22) opierał się na użyciu sondy TaqMan, jednakże na końcu 3’ znajdował się wygaszacz minor grove binder nonflu- orescent quencher. Czułość testu opartego na badaniu DNA wyizolowanego z zainfekowanych makrofagów oraz z próbek krwi od świń zakażonych szczepem Pr4 wyno- siła od 1000 do 10000 HAD₅₀/ml. W teście tym wszystkie spośród 48 badanych szcze- pów uznano za dodatnie, natomiast czu- łość analityczna kształtowała się na poziomie od 1, 4 do 8, 4. Podczas badania dużej liczby próbek klinicznych test charaktery- zował się wysoką specyficznością (100%), a jego czułość dla zeskrobin z migdałków i wymazów z nosa, zwłaszcza w przypadku niskiego miana wirusa, wyniosła odpowiednio 95,4% i 92,8%. Mniejszą czułość testu, na poziomie 89,7%, zaobserwowano w przypadku próbek krwi. McKillen i wsp.

(24) zaprojektowali test z zastosowaniem sondy minor groove binder, wyznakowanej na końcu 3’ FAM, a na końcu 5’ wyga- szaczem (Eclipse Dark Quencher), skon- struowanej zgodnie z sekwencją genu 9GL wirusa afrykańskiego pomoru świń. Sonda posiadała trójwymiarową konformację, dzię- ki temu pozwalała na bliskie położenie wy- gaszacza i fluoroforu. Podczas przeprowa- dzania optymalizacji testu dowiedziono, iż wykazuje on bardzo dobrą liniowość i zdol- ność wykrywania od 2×10¹ do 2×10¹⁰ kopii DNA/µl. Test oparty na sondzie minor groove binder wykazał większą czułość w po- równaniu do testu TaqMan PCR, wynoszą- cą odpowiednio 40 i 20% dla materiału ge- netycznego rozcieńczonego 10^-5. Natomiast

(5)

porównywany konwencjonalny PCR wyka- zał 20% możliwość wykrycia powielonego materiału w rozcieńczeniu 10^-4 oraz 100%

w 10^-3. Do opracowania tego testu wyko- rzystano szczep Spain 75 wirusa afrykań- skiego pomoru świń, natomiast jego oce- nę przeprowadzano w oparciu o 14 innych szczepów wirusa należących do genotypu I, V, VIII i IX. Czułość analityczna testu wy- niosła 20 kopii.

Tignon i wsp. (25) wykazali ulepszoną czułość diagnostyczną i analityczną testu dla białka VP72 opartego na kontroli wewnętrznej B-aktyny, która wyniosła 5, 7–57 kopii. Test opierał się na zastosowaniu sondy TaqMan wyznakowanej barwnikami FAM i TAMRA. W odniesieniu do konwencjonalnego testu PCR Agüero i wsp. (19) specyficzność tej techniki wy- niosła 96%, a czułość 85%, natomiast w po- równaniu do real-time PCR wg. King i wsp.

(22) specyficzność i czułość osiągnęły odpowiednio 99 i 82%. Opisany test Real-Time PCR wykazywał zdolność do wcześniejsze- go wykrywania infekcji (już w 3–7 d.p.z.).

Najnowsza technika opracowana przez Fernández-Pinero i wsp. (20), wykorzysty- wana aktualnie w Krajowym Laboratorium Referencyjnym ds. ASF, opiera się na amplifikacji fragmentu DNA wewnątrz regionu kodującego VP72. Stosuje ona specjal- nie zaprojektowany zestaw starterów oraz zbiór 165 sond o długości 8–9 kwasów nu- kleinowych, wyznakowanych dwoma barwnikami, FAM na końcu 5’ i dark quencher na końcu 3’ – Universal Probe Library (UPL).

Kontrola wewnętrzna testu opiera się na detekcji fragmentu genu endogennej B-akty- ny. Do zalet sond UPL należy łatwość wyko- nania badania oraz dość niskie koszty. PCR z zastosowaniem UPL, w porównaniu z testem referencyjnym OIE z sondą TaqMan opracowanym przez King i wsp. (22), po- siadał 10-krotnie lepszą czułość analitycz- ną w odniesieniu do szczepów ASFV na- leżących do genotypu I występującego na Sardynii i Afryce Zachodniej, VIII (genotyp o największej rozbieżności) i IX występu- jącego w Afryce Wschodniej. Granica wy- krywalności PCR stosującego UPL wynio- sła 14–18 kopii. Identyfikacja wirusowego DNA w niektórych próbkach pochodzących od zwierząt zakażonych szczepami ASFV o różnej wirulencji (należących do genotypu I, II, IX i X) możliwa była o tydzień wcze- śniej niż z sondą TaqMan. W przypadku braku typowych objawów klinicznych i obec- ności przeciwciał test oparty na sondzie UPL umożliwiał wykrycie zakażenia. Czu- łość diagnostyczna testu stosującego son- dę UPL była wyższa, co potwierdzono wy- kryciem ponad 10% więcej próbek pozytywnych w porównaniu z metodą referencyjną.

Ze względu na podobieństwo objawów klinicznych afrykańskiego pomoru świń i klasycznego pomoru świń (CSF) zalecane

jest zastosowanie technik umożliwiających jednoznaczne rozróżnienie tych jednostek chorobowych (26). Do tego celu używany jest między innymi konwencjonalny multiplex PCR opracowany przez Agüero i wsp.

(27) oparty na dwóch zestawach specyficz- nych starterów, odpowiednich dla każde- go z patogenów. Wykrywanie produktów reakcji polega na porównaniu amplifiko- wanych fragmentów o różnej długości.

Test umożliwiał wczesne wykrycie wiru- sów – już od 3 DPZ. Multiplex PCR wy- kazał 10-krotnie niższą czułość niż poje- dynczy (simplex) PCR Agüero i wsp. (19).

W teście hot start multiplex PCR, opracowanym przez Giammarioli i wsp.

(26), mającym na celu odróżnienie ASFV i CSFV, zaobserwowano o 2 log mniejszą czułość, w porównaniu z konwencjonal- nym simplex PCR opracowanym przez Agüero i wsp. (19) i o 1 log mniejszą niż wspomniany powyżej multiplex PCR wg Agüero i wsp. (27). Optymalizacja multiplex PCR wymaga doboru odpowiednich warunków reakcji, przede wszystkim stężeń reagentów i temperatury przyłączania star- terów. Zastosowanie różnorodnych starte- rów w tej samej probówce reakcyjnej może wywołać negatywne skutki, ze względu na ich wzajemne oddziaływanie i blokowanie reakcji. Poważne konsekwencje w zakresie czułości testu może wywołać zmiana zale- dwie kilku par zasad startera. W reakcjach multiplex PCR, w których sprawdzane są zarówno DNA (ASFV), jak i RNA (CSFV), odwrotna transkrypcja powinna być prze- prowadzona w niskiej temperaturze. Bar- dzo istotne jest zatem zastosowanie hot start Taq polimerazy, ponieważ pozwala to uniknąć niespecyficznych amplifikacji spowodowanych przez przyłączanie się startera w niskich temperaturach (26, 27).

W przypadku braku specjalistyczne- go sprzętu do amplifikacji materiału ge- netycznego możliwe jest zastosowanie te- stów izotermicznych, które przeprowadzane są w jednej temperaturze (14). Odczyt wyników odbywa się za pomocą prostego fluorescencyjnego czytnika płytek. Pierw- szy izotermiczny test opracowany dla ASF przez Hjertner i wsp. (28) nie wykazywał reakcji krzyżowej z RNA wirusa afrykańskie- go pomoru świń. Czułość testu wynosząca 2500 kopii była wystarczająca do wykrycia DNA w próbkach, w których stężenie wirusa było wysokie, jednakże była niższa niż w przypadku innych testów molekularnych.

W szybkim wykryciu niewielkich ilości wirusa przydatność wykazał test LAMP (29).

Różnice między izolatami wirusa afry- kańskiego pomoru świń można wykazać również za pomocą sekwencjonowania (14). Boshoff i wsp. (30), analizując cen- tralny region zmienności (CVR) charakte- ryzujący 9RL ORF (kodujący jedno z naj- ważniejszych białek strukturalnych ASFV

– VP72), wyróżnili występowanie 22 głów- nych genotypów wirusa afrykańskiego pomoru świń na kontynencie afrykańskim.

Inną metodą diagnostyczną wykorzystu- jącą materiał genetyczny jest hybrydyzacja, jednakże jej wykorzystanie w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej afrykańskiego pomoru świń jest ograniczone ze względu na kosztowność i pracochłonność metody.

Oura i wsp. (31) dzięki zastosowaniu sondy DIG zaobserwowali występowanie wirusa afrykańskiego pomoru świń w mono- cytach-makrofagach, komórkach nabłon- ka, neutrofilach i hepatocytach. Ponadto udowodnili wewnątrzjądrową lokalizację wirusa afrykańskiego pomoru świń w za- każonych komórkach, co mogło być efek- tem wczesnego zakażenia. Badania Carra- sco przeprowadzone w 1996 r. wykazały, iż wewnątrzjądrowe barwienie limfocytów T świadczy o ich podatności na zakaże- nie w późniejszych stadiach choroby (32).

Podsumowanie

Pojawienie się ognisk afrykańskiego pomoru świń w niedalekiej odległości od wschodniej granicy Polski, a tym samym zwiększo- ne ryzyko przeniesienia wirusa afrykańskie- go pomoru świń do kraju i wynikające z tego poważne konsekwencje ekonomiczne, wy- muszają gotowość diagnostyczną. Jak wynika z przedstawionych powyżej informacji, aktualnie dysponujemy różnorodnymi klasycznymi i nowoczesnymi technikami umożliwiającymi bezpośrednią lub pośred- nią identyfikację wirusa afrykańskiego pomoru świń. Wiele z nich jest wykorzystywa- nych w Krajowym Laboratorium Referencyj- nym ds. ASF. Wybór metody zależy przede wszystkim od aktualnej sytuacji epidemiolo- gicznej kraju, możliwości zapewnienia przez laboratorium pracy zgodnej z zasadami bio- bezpieczeństwa oraz kosztów. W okresie za- grożenia wprowadzenia wirusa afrykańskie- go pomoru świń do kraju wolnego od choroby, z uwagi na obecność wirusa we krwi już od 2 dnia po zakażeniu aż do śmierci zwierzęcia, każda próbka surowicy powinna być traktowana jak materiał potencjalnie wysoce zakaźny i powinna być równo- legle badana w kierunku obecności wirusa oraz swoistych przeciwciał. Podejmując de- cyzje dotyczące laboratoryjnego rozpoznawania choroby, trzeba mieć świadomość, że niewłaściwie zorganizowany system badań może sprzyjać rozprzestrzenianiu się wirusa wraz z materiałem diagnostycznym.

Piśmiennictwo

1. Markowska-Daniel I.: Aktualne dane na temat sytuacji epizootycznej w zakresie afrykańskiego pomoru świń.

Życie Wet. 2008, 83, 982-990.

2. Markowska-Daniel I.: Sytuacja epizootyczna afrykańskie- go pomoru świń w latach 2007-2010. Życie Wet. 2010, 85, 736-742.

(6)

3. Markowska-Daniel I., Ziętek-Barszcz A., Bocian Ł., Ku- kier M., Pejsak. Z.: Ocena ryzyka przeniesienia afrykań- skiego pomoru świń z Obwodu kaliningradzkiego do Pol- ski. Życie Wet. 2011, 86, 427-431.

4. Pejsak Z.: Pomór afrykański świń. W: Choroby świń. Pol- skie Wydawnictwo Rolnicze Sp. z o.o., Poznań 2002.

5. Sánchez-Vizcaíno J.M.: Afrykański pomór świń – aktu- alny stan wiedzy. Magazyn Wet. czerwiec 2011, Choro- by świń– monografia, 546-548.

6. Pejsak Z., Truszczyński M.: Znaczenie badań laborato- ryjnych w rozpoznawaniu chorób zakaźnych świń, Życie Wet. 2006, 81, 103-108.

7. asf-referencelab.info

8. Pan I. C., Huang i T.S., Hess W.R.: New method of antibody detection by indirect immunoperoxidase plaque staining for serodiagnosis of African swine fever. J. Clin.

Microbiol. 1982, 16, 650-655.

9. www.oie.int

10. Sánchez-Vizcaíno J.M.: African swine fever. W: Diseases of Swine. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA 1999, s. 90-102.

11. Summers F.A., Mason R.P., Ehrenshaft M.: Development of immunoblotting techniques for DNA radical detection.

Free Radic. Biol. Med. 2013, 56, 64–71.

12. Pastor M.J., Laviada M.D., Sánchez-Vizcaíno J.M., Escri- bano J.M.: Detection of African swine fever virus antibo- dies by immunoblotting assay. Can. J. Vet. Res. 1989, 53, 105-107.

13. Mur L., Gallardo C., Soler A., Zimmermman J., Pelayo V., Nieto R., Sánchez-Vizcaíno J.M., Arias. M.: Potential use of oral fluid samples for serological diagnosis of African swine fever. Vet. Microbiol. 2013, 165, 135-139.

14. Oura C.A., Edwards L., Batten. C.A.: Virological diagnosis of African swine fever-Comparative study of available tests. Virus. Res. 2013, 173, 150-158.

15. Vidal M.I.m Stiene M., Henkel J., Bilitewski U., Costa J.V., Oliva A.G.: A solid-phase enzyme linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies, for the detection of African swine fever virus antigens and antibodies. J. Vi- rol. Methods. 1997, 66, 211-218.

16. Gallardo C, Reis A.L., Kalema-Zikusoka G., Malta J., So- ler A., Blanco E., Parkhouse R.M., Leitão A.: Recombi- nant antigen targets for serodiagnosis of African swine fever. Clin. Vaccine. Immunol. 2009, 16, 1012-1020.

17. Hutchings G.H., Ferris N.P.: Indirect sandwich ELISA for antigen detection of African swine fever virus: Compa- rison of polyclonal and monoclonal antibodies. J. Virol.

Methods. 2006, 131, 213-217.

18. Markowska-Daniel I., Stępniewska K.: Przegląd metod wy- korzystywanych do wykrywania i charakterystyki szcze- pów Pasteurella multocida i Bordetella bronchiseptica.

Med. Weter. 2009, 65, 166-170.

19. Agüero M., Fernández J., Romero L., Sánchez Mascara- que C., Arias M., Sánchez-Vizcaíno J.M.: Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fe- ver virus in clinical samples. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 4431-4434.

20. Fernández-Pinero J., Gallardo C., Elizalde M., Robles A., Gόmez C., Bishop R., Heath L., Couacy-Hymann E., Fa- sina F.O., Soler A., Arias M.: Molecular diagnosis of Afri- can swine fever by a new real-time PCR using universal probe library. Transbound. Emerg. Dis. 2013, 60, 48-58.

21. McKillen J., Hjertner B., Millar A., McNeilly F., Belák S., Adair B., Allan G.: Molecular beacon real-time PCR de- tection of swine viruses. J. Virol. Methods. 2007, 140, 155-165.

22. King D.P., Reid S.M., Hutchings G.H, Grierson S.S, Wil- kinson P.J, Dixon L.K., Bastos D.S., Drew T.W.: Develop- ment of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. J.Vi- rol. Methods. 2003, 107, 53-61.

23. Zsak L., Borca M.V., Risatti G.R., Zsak A., French R.A., Lu Z., Kutish G.F., Neilan J.G., Callahan J.D., Nelson W.M., Rock D.L.: Preclinical diagnosis of African swine fever in contact-exposed swine by a real-time PCR assay. J. Clin.

Microbiol. 2005, 43, 112-119.

24. McKillen J., McMenamy M., Hjertner B., McNeilly F., Ut- tenthal A., Gallardo C., Adair B., Allan G.: Sensitive detection of African swine fever virus using real-time PCR with a 5’conjugated minor groove binder probe. J. Virol.

Methods. 2010, 168, 141-146.

25. Tignon M., Gallardo C., Iscaro C., Hutet E., Van der Ste- de Y., Kolbasow D., De Mia G.M., Le Potier M.F., Bishop R.P., Arias M., Koenen F.: Development and inter-laboratory validation of an improved new real-time PCR assay with internal control for detection and laboratory diagnosis of African swine fever virus. J. Virol. Methods.

2011, 178, 161-170.

26. Giammarioli M., Pellegrini C., Casciari C., De Mia G.M.:

Development of a novel hot-start multiplex PCR for simultaneous detection of classical swine fever virus, Afri- can swine fever virus, porcine circovirus type 2, porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porci- ne parvovirus. Vet. Res. Commun. 2008, 32, 255-262.

27. Agüero M., Fernández J., Romero L.J., Zamora M.J., Sán- chez C., Belák S., Arias M., Sánchez-Vizcaíno J.M.: A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and Classical swine fever in clinical samples. Vet. Res. 2004, 35, 551-563.

28. Hjertner B., Meehan B., McKillen J., McNeilly F., Belák S.: Adaptation of an Invader assay for the detection of African swine fever virus DNA. J. Virol. Methods. 2005, 124, 1-10.

29. James H.E., Ebert K., McGonigle R., Reid S.M., Boonham N., Tomlinson J.A., Hutchings G.H., Denyer M., Oura C.A., Dukes J.P., King D.P.: Detection of African swine fever virus by loop-mediated isothermal amplification.

J. Virol. Methods 2010, 164, 68–74.

30. Boshoff C.I., Bastos A.D., Gerber L.J., Vosloo W. Gene- tic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973–1999). Vet.. Micro- biol. 2007, 121, 45–55.

31. Oura C.A., Powell P.P., Parkhouse R.M..: Detection of African swine fever virus in infected pig tissues by im- munocytochemistry and in situ hybridization. J. Virol.

Methods. 1998, 72, 205-217.

32. Ballester M., Galindo-Cardiel I., Gallardo C., Argilaguet J.M., Segalés J., Rodríguez J.M., Rodríguez F.: Intranuc- lear detection of African swine fever virus DNA in seve- ral cell types from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues using a new in situ hybridisation protocol. J. Virol.

Methods. 2010, 168, 38-43.

Prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel, Krajowe Labora- torium Referencyjne ds. ASF, Zakład Chorób Świń, Pań- stwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy, Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy, e-mail:

iwonamd@piwet.pulawy.pl

Ocena świń

jako źródła zoonotycznych salmoneli, w porównaniu do drobiu i bydła

Jak wynika z raportu EFSA za 2010 r. (cyt.

wg 1), salmoneloza stanowi nadal jedną z najważniejszych zoonoz, związanych z zakażeniami pokarmowymi ludzi po spo- życiu zanieczyszczonej salmonelami żyw- ności, zwłaszcza pochodzenia zwierzęce- go. W 2010 r., podobnie jak w poprzednich sprawozdaniach rocznych EFSA, dane do- tyczące źródeł odzwierzęcej salmonelozy

ludzi dostarczały wszystkie kraje członkow- skie Unii Europejskiej oraz Islandia, Nor- wegia i Szwajcaria. Z informacji tych wynika, że salmoneloza odzwierzęca (drób, by- dło) ludzi wywołana była najczęściej przez serowary: Salmonella Enteritidis i S. Ty- phimurium. Znaczącym źródłem S. Ty- phimurium była w kolejności świnia oraz wieprzowina i jej produkty, skąd S. Typhi- murium była izolowana najczęściej w po- równaniu do innych serowarów (S. Cho- leraesuis, S. Heidelberg, S. Agona i S. In- fantis; 2).

Dane dotyczące wykrycia w 2010 r.

obecności pałeczek Salmonella u świń w fermach dostarczyły: Estonia (zbadanych 1095 próbek kału, 3,1% wyników dodatnich), Finlandia (zbadanych 840 gospo- darstw; 0% wyników dodatnich), Włochy (1272 świń zbadanych; 0,6% wyników dodatnich). W Norwegii zbadano bakteriolo- gicznie 2226 świń, uzyskując poniżej 0,1%

wyników dodatnich. Poza tym w 2010 r.

w Estonii, Finlandii, Hiszpanii, na Słowacji, w Słowenii i Szwecji oraz Norwegii moni- torowano salmonele w węzłach chłonnych świń poddawanych ubojowi. Najwięcej re- zultatów pozytywnych uzyskano w Hiszpa- nii (35,9%), Estonii (8,2%) i Słowenii (5,5%).

W pozostałych krajach UE wynosiły one od 0,1 do 0,6% (cyt. wg 1).

Rozszerzeniem powyższych danych o znaczeniu i ograniczaniu tego źródła zakażeń u świń jako rezerwuaru pałeczek Salmonella jest przedstawienie:

1. Obecnego stanu wiedzy na temat zoo- notycznego znaczenia pałeczek Salmo- nella:

a) w fermach loch produkujących pro- sięta oraz

b) w tuczarniach.

Świnie jako rezerwuar pałeczek

Salmonella chorobotwórczych dla ludzi – sposoby ograniczania nosicielstwa i siewstwa z kałem na fermie

Marian Truszczyński, Zygmunt Pejsak

z Zakładu Chorób Świń Państwowego Instytutu Weterynaryjnego – Państwowego Instytutu Badawczego w Puławach