Med. Weter. 2012, 68 (9) 525
Artyku³ przegl¹dowy Review
Wspó³czesna hodowla byd³a mlecznego w znacznej mierze zawdziêcza swój rozwój postêpowi biotechno-logii rozrodu, w³¹czaj¹c w to przede wszystkim tech-niki konserwacji nasienia, jego porcjowania, przecho-wywania oraz zabieg sztucznego unasienniania. Dziê-ki wspomnianym wy¿ej procedurom mo¿na z jednego ejakulatu uzyskaæ ponad tysi¹c porcji nasienia, a co za tym idzie, obni¿yæ koszty produkcji, iloæ utrzymy-wanych buhajów, u³atwiæ kontrolê nad pul¹ genow¹ populacji oraz zmniejszyæ ryzyko transmisji chorób zakanych. Ze wzglêdu na stosunkowo nisk¹ liczbê plemników w ejakulacie oraz ma³¹ objêtoæ dawki inseminacyjnej nasienie musi zostaæ zdeponowane bezporednio do trzonu lub rogów macicy. Niejedno-krotnie z powodu b³êdów ludzkich, czy to zwi¹zanych z wykrywaniem rui, czy z nieprawid³owym wykony-waniem zabiegu unasienniania, krowa nie zostaje za-p³odniona. Warto w tym miejscu zaznaczyæ, ¿e wg Sreenan i Diskin odsetek zap³odnieñ po zabiegu inse-minacji wykonanym w prawid³owy sposób i w odpo-wiednim czasie waha siê w granicach 90% (15). Prze-prowadzone przez Petersa i wsp. (11) badania wyka-za³y jednak, ¿e tylko 39% z 586 sprawdzonych inse-minacji wykonanych przez profesjonalnych
insemina-torów zosta³o zakoñczonych wprowadzeniem nasie-nia do trzonu macicy. Ma to istotne znaczenie, gdy¿ szyjka macicy stanowi podstawow¹ barierê dla trans-portu plemników. Szacuje siê, ¿e oko³o 20% krów inseminowanych jest w niew³aciwym terminie, co oznacza, ¿e 1/5 wyprodukowanego nasienia zostaje wykorzystana bezcelowo. Dodaj¹c do tego straty za-rodkowe (na tle ró¿nych przyczyn) uzyskujemy nie-jednokrotnie wskanik zap³adnialnoci (CR Concep-tion Rate) kszta³tuj¹cy siê na poziomie poni¿ej 50%. Badania oraz zabiegi maj¹ce na celu poprawê p³od-noci krów prowadzone s¹ wielokierunkowo. Doty-czy to zarówno skutecznoci wykrywania rui, hormo-nalnego sterowania rozrodem, terapii chorób narz¹du p³ciowego oraz wielu innych aspektów, których nie sposób w tym miejscu wymieniæ.
Jednym z badanych zagadnieñ jest technika wyko-nywania samego zabiegu inseminacji oraz jej skutecz-noæ zale¿na czêsto od umiejêtnoci i wiedzy insemi-natora. Podstawowa metoda inseminacji, polegaj¹ca na wprowadzeniu nasienia do narz¹du p³ciowego, zo-sta³a wielokrotnie przebadana pod k¹tem miejsca oraz g³êbokoci wprowadzenia nasienia. Dowiedziono bo-wiem, i¿ w przypadku krycia jedynie nieznaczny
od-Wspó³czesne pogl¹dy na temat alternatywnych metod
sztucznej inseminacji byd³a mlecznego
JACEK MROWIEC, JAN TWARDOÑ, GRZEGORZ J. DEJNEKA, ROLAND KOZDROWSKI
Katedra Rozrodu z Klinik¹ Zwierz¹t Gospodarskich Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, pl. Grunwaldzki 49, 50-366 Wroc³aw
Mrowiec J., Twardoñ J., Dejneka G. J., Kozdrowski R. Alternative techniques of insemination in dairy cattle
Summary
Progress in stock farming has incontestably been related to the development of reproduction biotechnology, especially the introduction of artificial insemination (AI). In the female genital tract there are natural barriers decreasing the number of spermatozoa after insemination. Moreover, many pathologies of the uterus and oviducts can negatively affect the sperm. A great deal of research has been devoted to determining the optimal site for semen deposition, but the findings have frequently been diverse. The aim of this paper was to describe advanced insemination techniques in dairy cattle, which may improve AI. The paper discusses intraperitoneal insemination (IPI) and intrafollicular insemination (IFI). IPI consists in semen deposition in the peritoneal cavity in two ways: by a transvaginal or trancutaneus (in the right flank) injection. It has been successfully performed in many species: cows, sheep, goats, rabbits, guinea pigs, rhesus monkeys and humans . The result of this method is highly dependent on the number of spermatozoa, precise oestrus detection and the site of sperm deposition. IFI is performed by a direct introduction of semen into the preovulatory ovarian follicle. So far, only one study has been carried out on dairy cattle. The results were promising, but further research is needed. Presumably both techniques will be useful in the treatment of some cases of bovine infertility.
Med. Weter. 2012, 68 (9) 526
setek plemników dociera do miejsca, w którym do-chodzi do zap³odnienia, w zwi¹zku z istnieniem natu-ralnych barier, takich jak: szyjka macicy, po³¹czenie bañki z cieni¹ jajowodu czy produkowany przez gru-czo³y luz, dlatego przyjêto, ¿e efektywnoæ zabiegu powinna poprawiæ g³êboka domaciczna inseminacja. Czêæ autorów (4, 6, 8, 10) badaj¹cych to zagadnienie wykaza³a poprawê zap³adnialnoci przy zastosowaniu g³êbokiej inseminacji do rogu ipsilateralnego w po-równaniu do inseminacji do trzonu macicy. Inni bada-cze nie stwierdzili istotnych ró¿nic pomiêdzy wymie-nionymi miejscami wprowadzenia nasienia (2, 3). W zwi¹zku ze zró¿nicowaniem otrzymanych wyników prowadzane s¹ badania nad zastosowaniem alternatyw-nych technik sztucznego unasienniania byd³a, stoso-wanych ju¿ wczeniej w medycynie cz³owieka i u in-nych gatunków zwierz¹t.
Celem niniejszego artyku³u jest opis metod insemi-nacji bazuj¹cych b¹d na zdeponowaniu nasienia bez-porednio do pêcherzyka jajnikowego przed owula-cj¹, b¹d do jamy otrzewnowej.
Inseminacja dootrzewnowa
Technika inseminacji dootrzewnowej znana jest ju¿ prawie od 60 lat. Po raz pierwszy skutecznego una-siennienia t¹ drog¹ dokona³ Skjerven (cyt. 16) w 1955 r. u ja³ówki. Na przestrzeni lat metod¹ t¹ uda³o siê uzyskaæ ci¹¿ê u byd³a, owiec, kóz, królików (tab. 1), winek morskich, szynszyli, wiñ, naczelnych, w tym u cz³owieka (16). U byd³a oraz u ludzi zosta³a ona na-wet wykorzystana jako metoda leczenia niep³odnoci. Lopez (5) nie uzyska³ statystycznie istotnych ró¿nic pomiêdzy skutecznoci¹ inseminacji domacicznej a dootrzewnowej u krów powtarzaj¹cych objawy ru-jowe.
Idea inseminacji dootrzewnowej bazuje na za³o¿eniu, i¿ plemniki mog¹ osi¹gn¹æ miejsce zap³odnienia ko-mórki jajowej równie¿ z jamy otrzew-nowej (Lopez reviev). Dowiedziono bowiem, i¿ nawet w przypadku kry-cia czy inseminacji konwencjonalnej czêæ plemników mo¿e przedostawaæ siê do jamy otrzewnowej, a stamt¹d z powrotem do jajowodów (z tej sa-mej b¹d przeciwnej strony, od któ-rej wniknê³y). Udowodniono równie¿, ¿e jajowody s¹ w stanie wci¹gaæ drobne cz¹stki z jamy otrzewnowej, takie jak: atrament indyjski, cz¹stki wêgla czy nawet jaja paso¿ytów i transportowaæ je dalej do macicy (5). Lopez i wsp. (17) po inseminacji dootrzewnowej odzyskali plemniki z szyjki macicznej w 12-24 godz. po zabiegu. Dotyczy³o to jednak w g³ów-nej mierze plemników uszkodzonych i nieruchliwych. Obecnoæ gamet
w pobieranych wymazach szyjkowych by³a równie¿ w znacznym stopniu zale¿na od koncentracji plemni-ków w deponowanej dawce. Co ciekawe, Brussow i wsp. (1), stosuj¹c niskie dawki plemników w inse-minacji domacicznej i dootrzewnowej u wiñ, nie byli w stanie potwierdziæ migracji plemników przez jamê otrzewnow¹ do jajowodów. Uzyskanie przez wielu autorów ci¹¿y po inseminacji dootrzewnowej bez-sprzecznie wskazuje na mo¿liwoæ wykorzystania tej metody. W zwi¹zku z odstêpstwami w stosunku do tradycyjnej inseminacji dotycz¹cymi transportu plem-ników do jajowodu pojawiaj¹ siê jednak pytania do-tycz¹ce wp³ywu rodowiska jamy otrzewnowej na gamety, sposobu i miejsca depozycji nasienia, dawki inseminacyjnej oraz ewentualnych skutków ubocznych zabiegu.
Oddzia³ywanie p³ynu w jamie otrzewnowej na plem-niki nie jest w pe³ni wyjanione (16). Solidatii i wsp. (14) stwierdzili, ¿e w czasie fazy oestrus p³yn z jamy otrzewnowej mo¿e swobodnie przep³ywaæ do wnêtrza jajowodu, nie zaburzaj¹c procesu zap³odnienia. Jed-nak p³yn ten zostaje wymieszany z wydzielin¹ gru-czo³ów narz¹du p³ciowego i stanowi jedynie czêæ sk³adow¹ rodowiska jajowodu. Revelli i wsp. (12) uzyskali rozbie¿ne wyniki dot. wp³ywu p³ynu otrzew-nowego u kobiet na plemniki w warunkach in vitro. Równie¿ pytanie o zjawisko kapacytacji plemników w przypadku inseminacji dootrzewnowej pozostaje bez odpowiedzi. Nie wiadomo bowiem, czy plemniki pod-legaj¹ ostatecznemu dojrzewaniu po zetkniêciu siê ze nab³onkiem b³ony surowiczej macicy (17), czy dopie-ro po przejciu do jajowodu oraz co w takim wypadku co stanowi rezerwuar plemników? Nale¿y pamiêtaæ jednak, ¿e plemniki podczas procesu mro¿enia/rozmra-Tab. 1. Liczba uzyskanych ci¹¿ po inseminacji dootrzewnowej u poszczególnych gatunków zwierz¹t w porównaniu z innymi metodami (cyt. 17)
Objanienia: IPI inseminacja dootrzewnowa; IUI inseminacja domaciczna; IVI inseminacja dopochwowa; ICI inseminacja doszyjkowa; zag zagêszczenie; p³ p³ukanie r o t u a / k e n u t a G zLwiicezrbza¹t Metoda nOabsrióebnkiaa pleLmicnzbikaów (× 01 6) n e ¿ ¹ i C ) % ( a w o r K x x x x Skjerven(1955) x x x x McDonaldiSampson(1957) x x x x Lopez-Gaitus(1995) 1 4 2 6 3 6 I P I I P I I P I I U I k a r b k a r b e i n e ¿ o r m e i n e ¿ o r m a n a n z e i n a n a n z e i n 5 4 5 4 o o 1(100) o o 1(25)o o o 9(14,6) o13(20,6) k il ó r K x x x x Adams(1969) x x x x MrouehiMasrtoianni(1966) 2351 IIPPII zazag/gp³ n1i8e5zn-4a5n0a 812(2(54,88)) a z o K x x x x Gonzalez(1972) 10 5 IIPVII rroozzrrzzeeddzzeenniiee 22550000 34((3800)) a c w O x x x x Negobaitkoviwsp.(1981) 50 5 0 1 0 8 5 4 0 4 1 I P I I P I I P I I P I I C I e i n e z d e z r z o r e i n e z d e z r z o r e i n e z d e z r z o r e i n e z d e z r z o r k a r b 0 2 5 2 5 3 0 8 a n a n z e i n ) 4 5 ( 7 2 ) 1 7 ( 5 7 ) 6 7 ( 1 6 ) 3 8 ( 7 3 ) 0 6 ( 4 8
Med. Weter. 2012, 68 (9) 527
¿ania s³omek inseminacyjnych podlegaj¹ procesowi kriokapacytacji.
Co z kolei z dawk¹ inseminacyjn¹? Wyniki wszyst-kich przeprowadzonych dotychczas badañ nad inse-minacj¹ dootrzewnow¹ pozwoli³y na stwierdzenie, ¿e wraz ze zwiêkszaniem liczby zdeponowanych plem-ników rós³ odsetek uzyskanych ci¹¿. Przyk³adowo, zwiêkszaj¹c dawkê z 20 do 80 milionów plemników Negobatikov i wsp. (9) uzyskali wzrost wskanika zap³adnialnoci u owiec o 29%. Z kolei Rowlands i wsp. (13) deponuj¹c 50 milionów plemników do jamy otrzewnowej winek morskich, uzyskali 100% skutecz-noæ (standardowa dawka inseminacyjna wynosi 30 milionów gamet). Niestety, w przypadku byd³a nie mo¿na dok³adnie okreliæ idealnej dawki inseminacyj-nej, gdy¿ brak danych dotycz¹cych iloci wykorzysta-nych plemników w badaniach Skjervena i McDonal-da (za 16) (unasiennienia dokonano nasieniem wie-¿ym). Lopez (5) wykona³ skuteczne inseminacje do-otrzewnowe u krów nasieniem mro¿onym, deponuj¹c 45 milionów plemników.
Zasadniczo istniej¹ dwie podstawowe drogi wy-konania zabiegu: wk³ucie przez sklepienie pochwy i wprowadzenie nasienia na trzon macicy oraz iniek-cja przez pow³oki brzuszne i zdeponowanie nasienia w okolicy jajników pod kontrol¹ ultrasonografu b¹d laparoskopu. U byd³a preferowana jest metoda pierw-sza, gdy¿ jest ³atwiejsza wykonaniu, do kontroli wy-starczy jedynie badanie manualne przez prostnicê, a co najwa¿niejsze, uzyskano przy jej u¿yciu lepsze rezultaty (17).
Technika wykonywania zabiegu jest stosunkowo prosta i nie wymaga skomplikowanego sprzêtu. Lo-pez (5) wykorzystywa³ szklan¹ rurkê o d³ugoci 44 cm i 10 mm rednicy jako prowadnicê dla pistoletu inse-minacyjnego, na os³onkê którego montowa³ ig³ê o d³u-goci 4 cm i rednicy 19. Rurka po uprzedniej dezyn-fekcji wprowadzana by³a wraz z rêk¹ do pochwy i opierana o sklepienie. Nastêpnie wprowadzono pis-tolet uzbrojony w ig³ê, przek³uwano siê przez cianê pochwy i deponowano nasienie w okolicy trzonu ma-cicy. Autorzy niniejszej publikacji sugeruj¹, ¿e szkla-n¹ rurkê mo¿na zast¹piæ prowadnic¹ z metalu lub z tworzywa sztucznego, zmniejszaj¹c ryzyko uszko-dzenia dróg rodnych w przypadku zbicia szk³a.
Poza przygotowaniem aprowizacyjnym oraz wypra-cowaniem odpowiedniej techniki, niezmiernie wa¿ny jest czas wykonywania zabiegu. Sugerowany, najlep-szy okres to czas najbli¿ej owulacji, powinien on jed-nak byæ dopasowany do okrelonego gatunku zwie-rzêcia (16). U byd³a najlepiej termin zabiegu wyzna-czaæ badaniem rektalnym narz¹du p³ciowego.
Wprowadzenie obcego materia³u do jamy otrzew-nowej, jakim jest nasienie, mo¿e nieæ ryzyko infek-cji, szoku anafilaktycznego, tworzenia zrostów lub immunizacji przeciwko plemnikom, jednak tego typu zjawiska zaobserwowano tylko u ludzi, u myszy (któ-rym podawano nasienie bez adjuwantów) oraz u
kró-lików (zwiêkszenie iloci p³ynu oraz zrosty), natomiast u innych gatunków nie by³y one notowane. W celu zmniejszenia prawdopodobieñstwa wyst¹pienia efek-tów ubocznych proponowane jest p³ukanie oraz wiro-wanie nasienia.
Pomimo pewnych niewiadomych dotycz¹cych in-seminacji dootrzewnowej nale¿y traktowaæ j¹ jako realn¹ alternatywê w stosunku do konwencjonalnego zabiegu, gdy¿ umo¿liwia ominiêcie naturalnych ba-rier mechanicznych w narz¹dzie p³ciowym samicy oraz negatywnego wp³ywu na plemniki ewentualnych sta-nów patologicznych.
Inseminacja dopêcherzykowa
Pierwszy zakoñczony sukcesem zabieg inseminacji dopêcherzykowej u byd³a zosta³ opisany przez Lope-za i Huntera (7) w 2011 r. Wczeniej procedura ta by³a wykonywana jedynie u ludzi i koni (cyt. 7).
Istota metody polega na wprowadzeniu nasienia bezporednio do pêcherzyka przedowulacyjnego. Po-dobnie jak w przypadku inseminacji dootrzewnowej wykonanie zabiegu nie jest zbyt skomplikowane (7), wymaga jednak od operatora dobrej umiejêtnoci ba-dania rektalnego, szczególnie w odniesieniu do oceny struktur jajnikowych. Potrzebny sprzêt jest praktycz-nie taki sam, jak do inseminacji dootrzewnowej, jedy-nie ig³a nak³adana na pistolet inseminacyjny powinna mieæ inne rozmiary (23G, 18 mm d³ugoci [7]). W celu wykrycia w³aciwego momentu inseminacji krowy Lopez i Hunter (7) proponuj¹ monitorowane narz¹du p³ciowego badaniem rektalnym palpacyjnym lub ul-trasonograficznym. Samice powinno siê unasienniaæ wówczas, gdy cia³ko ¿ó³te na jajniku ma mniej ni¿ 10 mm b¹d jest niewyczuwalne w badaniu palpacyjnym. Jednoczenie na jednym z jajników powinien zostaæ stwierdzony du¿y, miêkki pêcherzyk, rednicy 12-25 mm. Bada siê równie¿ reaktywnoæ i konsystencjê macicy oraz charakter luzu, wydobywaj¹cego siê ze szpary sromowej. W momencie inseminacji nale¿y wprowadziæ metalow¹ prowadnicê o d³ugoci 44 cm i rednicy 10 mm do pochwy i oprzeæ o jej sklepienie. Osoba wykonuj¹ca zabieg poprzez manipulacje przez prostnicê ustala jajnik w taki sposób, aby ciana po-chwy by³a jedyn¹ barier¹ pomiêdzy koñcówk¹ prowad-nicy i pêcherzykiem. Nastêpnie do rury wprowadza siê uzbrojony w ig³ê pistolet inseminacyjny. Po wk³u-ciu do wiat³a pêcherzyka deponuje siê nasienie. Lo-pez i Hunter (7) wprowadzali 1/4 standardowej dawki inseminacyjnej, tj. 0,06 ml (5 milionów plemników, po rozmro¿eniu 40% o ruchu prawid³owym). W trak-cie wykonywania zabiegu cytowani autorzy nie stwier-dzili ¿adnych uszkodzeñ w obrêbie pêcherzyków czy pochwy oraz dyskomfortu u inseminowanych zwie-rz¹t. Grupê kontroln¹ stanowi³y krowy, które unasien-niano g³êboko do rogu macicy. W przypadku insemi-nacji dopêcherzykowej uzyskano 4 ci¹¿e u 17 (23,5%) unasiennianych samic w stosunku do 3 sporód 33 in-seminowanych konwencjonalnie (9%). W ci¹gu 11 dni
Med. Weter. 2012, 68 (9) 528
po inseminacji nie stwierdzono ¿adnych powik³añ. Nale¿y zaznaczyæ, ¿e dowiadczenie dotyczy³o jednak stada z powa¿nymi problemami rozrodczymi (wska-nik zap³adnialnoci na poziomie 10% w ciep³ych po-rach roku oraz 33% w ch³odniejszych), a dodatkowo by³o wykonywane podczas gor¹cych miesiêcy. Selek-cjonowane do badania samice by³y wolne od chorób narz¹du p³ciowego, chorób wymienia i koñczyn oraz schorzeñ metabolicznych.
Dotychczas nieznane s¹ mechanizmy oraz miejsce kapacytacji i zap³odnienia w przypadku inseminacji dopêcherzykowej. Lopez i Hunter (7) sugeruj¹, i¿ do-chodzi do tego w obrêbie jajowodu, po wydostaniu siê komórki jajowej oraz plemników z pêcherzyka podczas owulacji.
Podsumowanie
Obie omawiane techniki inseminacyjne wymagaj¹ jeszcze wielu badañ oraz udoskonaleñ, jednak¿e ju¿ na obecnym etapie wiedzy mo¿na stwierdziæ, i¿ bêd¹ pewn¹ alternatyw¹ w stosunku do konwencjonalnych metod unasienniania. Istnieje prawdopodobieñstwo, ¿e w przysz³oci mog¹ stanowiæ cenne narzêdzie w zwalczaniu niektórych przypadków niep³odnoci u byd³a.
Pimiennictwo
1.Brüssow K. P., Torner H., Rátky J.: Sperm migration in pigs after deep intrauterine and intraperitoneal insemination. J. Reprod. Dev. 2011, 57, 342--345.
2.Hawk H. W., Conley H. H., Wall R. J., Whitaker R. O.: Fertilization rates in superovulating cows after deposition of semen on the infundibulum, near the uterotubal junction or after insemination with high numbers of sperm. Theriogenology 1988, 29, 1131-1142.
3.Hawk H. W., Tanabe T. Y.: Effect of unilateral cornual insemination upon fertilization rate in superovulating and single-ovulating cattle. J. Anim. Sci. 1986, 63, 551-560.
4.Lopez-Gatius F.: Factors of a noninfectious nature affecting fertility after artificial insemination in lactating dairy cows. A review. Theriogenology 2012, 77, 1029-1041.
5.Lopez-Gatius F.: Intraperitoneal insemination in repeat-breeder cows: a pre-liminary report. Theriogenology 1995, 44, 153-158.
6.López-Gatius F., Camón-Urgel J.: Effect of side of insemination on transute-rine transport of spermatozoa in superovulated dairy cattle. Theriogenology 1990, 33, 843-849.
7.López-Gatius F., Hunter R. H. F.: Intrafollicular insemination for the treat-ment of infertility in the dairy cow. Theriogenology 2011, 75, 1695-1698. 8.López-Gatius F., Urgel J. C., Asensio E. A.: Effects of single deep
insemina-tion on transferable embryo recovery rates in superovulated dairy cows. The-riogenology 1988, 30, 877-885.
9.Negobatikov G., Zhirnokleev V., Zarudnev S.: An experiment on paragenital insemination of sheep. Zhivotnovodstvo 1981, 1, 54-56.
10.Pallares A., Zavos P. M., Hemken R. W.: Fertilization rates and embryonic development in superovulated cattle inseminated in different sites within the reproductive tract. Theriogenology 1986, 26, 709-719.
11.Peters J. L., Senger P. L., Rosenberg J. L., OConnor M. L.: Radiographic of bovine artificial inseminating technique among professional and herdsman--inseminators using .5- and 25-ml french straws. J. Anim. Sci. 1984, 59, 1671-1682.
12.Revelli A., Soldati G., Stamm J., Massobrio M., Topfer E., Balerna M.: Effect of volumetric mixtures of peritoneal and follicular fluid from the same woman on sperm motility and acrosomal reactivity in vitro. Fertil Steril 1992, 57, 654-660.
13.Rowlands I. W.: Insemination of the guinea-pig by intraperitoneal injection. J. Endocrinol. 1957, 16, 98-106.
14.Soldati G. A., Piffaretti A., Medici G., Eppenberger U., Balerna M.: Purifi-cation of a factor from human peritoneal fluid that is able to immobilize spermatozoa. Hum. Reprod. 1993, 8, 428-436.
15.Sreenan J. M., Diskin M. G.: Early embryonic mortality in the cow: its rela-tionship with progesterone concentration. Vet Rec. 1983, 28, 112, 517-521. 16.Yaniz J. L., Lopez-Bejar M., Santolaria P., Rutllant J., Lopez-Gatius F.: Intraperitoneal Insemination in Mammals: A Review. Reprod. Dom. Anim. 2002, 37, 75-80.
17.Yaniz J. L., Lopez-Gatius F.: Intraperitoneal Insemination and Retrograde Sperm Transportin Dairy Cows. J. Vet. Med. A 2000, 47, 83-88.
Adres autora: lek. wet. Jacek Mrowiec, Pl. Grunwaldzki 49, 50-366 Wroc³aw; e-mail: jacek.mrowiec@up.wroc.pl
