Teoretyczne podstawy analizy mieszanin DNA w multipleksowych systemach STR

Jeśli dasz jeden wynik mieszaniny 10 ekspertom, to otrzymasz 10 możliwych wniosków

Peter Gill Wstęp

Zestawy do amplifikacji (namnażania) DNA wykorzy-stywane współcześnie w kryminalistycznych badaniach genetycznych charakteryzują się dużą czułością oraz od-pornością na inhibitory reakcji PCR, co znacząco zwięk-sza zwięk-szansę na uzyskanie profilu DNA nawet z tzw. trud-nych śladów, jakimi niewątpliwie są ślady kontaktowe. W przypadku takich śladów często uzyskuje się wyniki w postaci mieszanych profili DNA, które mogą nie tylko stanowić spore wyzwanie dla eksperta, lecz także budzić wątpliwości u odbiorców opinii. Niezmiernie ważne staje się zatem opracowanie w języku polskim jednolitych za-gadnień teoretycznych bazujących na światowych pu-Joanna Dąbrowska, Żanetta Makowska,

Magdalena Spólnicka, Emilia Szabłowska-Gnap

Teoretyczne podstawy analizy mieszaniny DNA

w multipleksowych systemach STR

blikacjach naukowych, które będą stanowiły podstawę do oceny profili DNA pochodzących od więcej niż jednej osoby. Niniejszy artykuł został przygotowany z myślą o osobach wykonujących badania DNA i traktujących je jako pomocne w analizowaniu wyników, ze szczególnym uwzględnieniem mieszanin DNA oraz opracowywania na ich podstawie wniosków, które wykorzystywane są później przez organy procesowe.

Analizę mieszanin DNA należy przeprowadzać z wiel-ką ostrożnością. Niezwykle istotne jest, aby ich analiza odbywała się niezależnie od wyników uzyskanych dla pro-fili DNA oznaczonych z materiału porównawczego. Cały proces powinien być dokładnie zaplanowany i przepro-wadzony według przemyślanego, logicznego schematu. Za przykład może służyć schemat zaproponowany przez Clytona in. (ryc. 1) [1].

W artykule przedstawiony będzie szczegółowy opis poszczególnych etapów analizy mieszanin DNA według schematu zamieszczonego na rycinie 1.

KROK 1

KROK 2

Identyfikacja liczby osób, od których pochodzi DNA w mieszaninie

KROK 3

Określenie proporcji (stopnia) zmieszania składników mieszaniny DNA

KROK 4

Wyznaczenie dopuszczalnych kombinacji genotypów dla każdego locus

KROK 5

Określenie proporcji (stopnia) zmieszania składników mieszaniny DNA

Identyfikacja mieszaniny DNA i oznaczenie ujawnionych alleli

Etapy w interpretacji mieszanin DNA

Ryc. 1. Analiza mieszanin DNA według schematu opracowanego przez Claytona i in. Fig. 1. DNA mixture analysis according to Clayton et al.

Krok 1 Identyfikacja mieszaniny DNA i oznaczenie ujawnionych alleli

W pierwszym etapie analizy wyniku należy stwierdzić obecność mieszaniny DNA w badanej próbce. W tym celu należy zwrócić szczególną uwagę na obecność w co najmniej jednym locus trzech lub więcej pików odpowia-dających allelom (ryc. 2), pamiętając o możliwości wystę-powania dodatkowych pików w postaci artefaktów (np. podprążków – stutterów, N-pików lub podciągnięć koloru – pull-upów), które charakteryzują się określonymi cecha-mi ułatwiającycecha-mi ich rozpoznanie i odróżnienie od właści-wych pików. Dodatkowo należy uwzględnić możliwość wy-stąpienia zjawiska wypadania alleli, tzw. drop-out. Osoba analizująca wyniki badań DNA powinna również umieć od-różnić rozmaite zjawiska genetyczne od mieszanin DNA, ponieważ dodatkowe piki zaobserwowane szczególnie w jednym locus mogą być wynikiem mutacji, np. translo-kacji, trisomii czy mutacji somatycznych [2].

Ponadto należy sprawdzić, czy długości oznaczonych alleli w stosunku do odpowiadających im alleli w drabinie mieszczą się w przedziale ± 0,5 pz. (pary zasad). Ewen-tualne przesunięcia prążków w stosunku do odpowied-niego prążka w drabinie powinny być stałe we wszystkich układach. W trakcie analizy wyników uwzględnia się rów-nież zbalansowanie pików dla każdego locus oddzielnie. Niezbalansowanie pików w układzie heterozygotycznym jest dopuszczalne na poziomie 40% (tzn. że stosunek pól powierzchni pików – mniejszego do większego – musi za-wierać się w granicach od 0,6 do 1) (ryc. 3).

W większości przypadków niezbalansowanie dwóch pików w obrębie jednego locus może wskazywać na

obec-Ryc. 2. Przykład występowania wielokrotnych alleli w locus Fig. 2. Example of occurence of multi alleles in locus

ność mieszaniny DNA. Należy jednak pamiętać, że amplifi-kacja preferencyjna jednego allela w stosunku do drugiego w danym locus może być również wynikiem zbyt małej ilo-ści DNA (efekt stochastyczny) lub mutacji w obrębie miej-sca wiązania startera reakcji PCR [1–4].

Krok 2 Identyfikacja liczby osób, od których pochodzi DNA w mieszaninie

Maksymalna liczba alleli w danym locus dla mieszaniny od dwóch osób to 4. W związku z tym oznaczenie 5 lub 6 alleli w układzie wskazuje na obecność w badanej próbce DNA pochodzącego od trzech osób lub większej ich liczby, co w praktyce trudno jest jednoznacznie ustalić [1]. Ogól-nie można założyć, że obecność w poszczególnych loci:

2, 3, 4 alleli to obecność DNA dwóch osób (ryc. 4) •

od 5 do 6 alleli to obecność DNA co najmniej trzech •

osób (ryc. 5)

> 6 alleli to obecność DNA co najmniej czterech osób •

(ryc. 6)

Krok 3 Określenie proporcji (stopnia) zmieszania składników mieszaniny DNA

Krok ten przeprowadza się wyłącznie podczas ana-lizy mieszanin DNA pochodzącego od dwóch osób. Do określenia relacji pomiędzy pikami reprezentującymi od-powiednie allele w danym układzie wykorzystuje się tzw. dane ilościowe, tj. wysokości pików lub pola ich powierzch-ni. W praktyce można wyznaczyć dwa parametry analizy

Ryc. 3. Przykład zbalansowania alleli w układach heterozygotycznych (wpn – wysokość piku niższego, wpw – wysokość piku wyższego, PHR – peak height

ratio – różnica w wysokościach pików)

Ryc. 4. Przykład mieszaniny DNA dwóch osób Fig. 4. Example of DNA mixture from two persons

Ryc. 5. Przykład mieszaniny DNA co najmniej trzech osób Fig. 5. Example of DNA mixture from at least three persons

Ryc. 6. Przykład mieszaniny DNA co najmniej czterech osób Fig. 6. Example of DNA mixture from at least four persons

mieszanin DNA pod kątem określenia relacji pomiędzy pi-kami, tj. stopień zmieszania (M_r) lub proporcje zmieszania (Mx) poszczególnych składników:

a) stopień zmieszania poszczególnych składników (M_r – mixing ratio) wyraża stosunek sumy pól powierzchni (wysokości) pików jednego składnika mieszaniny do sumy pól powierzchni (wysokości) pików drugiego składnika,

b) proporcje zmieszania poszczególnych składników (Mx – mixing proportion) wyrażają sumę pól

powierzch-ni (wysokości) pików mpowierzch-niejszego składpowierzch-nika mieszapowierzch-ni- mieszani-ny w stosunku do sumy pól powierzchni (wysokości) wszystkich pików oznaczonych w danym układzie. Wartości M_r i/lub Mx wyznacza się dla każdej

rozpa-trywanej konfiguracji alleli w poszczególnych loci. Biorąc pod uwagę liczbę oznaczonych alleli w danym locus oraz uwzględniając możliwość nakładania się sygnału pocho-dzącego od dwóch niezależnych alleli o takiej samej wiel-kości, stosuje się odpowiednie wzory, które zestawiono w tabeli (tab. 1) [2].

Tabela 1 Określanie wartości proporcji i stopnia zmieszania składników mieszaniny DNA

Determination of proportion and level of DNA mixture components

Liczba alleli w układzie Składnik mniejszy Składnik większy M_x M_r

4 allele 1, 2 3, 4

3 allele

1, 1 2, 3

2, 3 1, 1

Liczba alleli w układzie Składnik mniejszy Składnik większy M_x M_r

2 allele

1, 1 2, 2

1, 2 2, 2

1, 1 1, 2

1, 2 1, 2 brak informacji brak informacji

1 allel 1, 1 1, 1 brak informacji brak informacji

Źródło: (tab. 1–7) opracowanie własne

Ryc. 8. Przykład mieszaniny DNA typu B Fig. 8. Example of DNA type B mixture

Zależności pomiędzy proporcją zmieszania (Mx) a

stop-niem zmieszania (Mr) wyrażają poniższe wzory:

Najbardziej wiarygodnymi wynikami odzwierciedlają-cymi proporcje zmieszania składników mieszaniny są te, które wyznacza się dla układów z oznaczonymi 4 allelami. Jeżeli jest to możliwe, należy wybrać te układy, w których piki mniejszego składnika mieszaniny nie znajdują się w pozycjach sttuterów większego składnika. Przy założe-niu, że analizowana mieszanina DNA pochodzi od dwóch osób, w układzie z czterema allelami nie występuje zjawi-sko tzw. współdzielenia piku przez dwa niezależne allele o takiej samej wielkości, co może mieć miejsce w układach z oznaczonymi trzema lub dwoma allelami. W przypadku mieszanin DNA męskiego i żeńskiego do wyznaczenia proporcji składników mieszaniny wykorzystuje się układ amelogeniny, przy czym należy pamiętać o sprawdzeniu uzyskanych wyników dla amelogeniny z wynikami obliczo-nych proporcji dla inobliczo-nych loci [1, 2, 3].

W zależności od stopnia zmieszania DNA pochodzą-cego od dwóch osób mieszaniny można podzielić na na-stępujące typy:

typ A – mieszanina zbalansowana, bez wyraźnie zdefi-•

niowanego składnika większego i mniejszego (ryc. 7)

typ B – mieszanina, w której można wyraźnie odróżnić •

składnik większy i mniejszy (ryc. 8)

Ryc. 7. Przykład mieszaniny DNA typu A Fig. 7. Example of DNA type A mixture

Ryc. 9. Przykład mieszaniny DNA typu C Fig. 9. Example of DNA type C mixture

typ C – mieszanina o dużej dysproporcji pomiędzy •

tworzącymi ją składnikami; mniejszy składnik na ni-skim poziomie (ryc. 9)

, gdzie

φ

₁ wyraża pole powierzchni (wysokości) mniejszego piku

φ

₂ wyraża pole powierzchni (wysokości) większego piku. Jeżeli w rozpatrywanej konfiguracji jeden z pików jest wspólny dla dwóch niezależnych alleli, to wtedy zbalanso-wanie heterozygot oblicza się według wzoru:

,

gdzie

φ

_s wyraża pole powierzchni (wysokość) wspólnego piku reprezentującego dwa niezależne allele o takiej samej wielkości

φ

₁ i

φ

₂ stanowią pola powierzchni (wysokości) pików alleli nienależących do pary.

Drugim parametrem stosowanym przy ocenie dopusz-czalności danych kombinacji genotypów w analizowanym locus jest stopień zmieszania (Mr) lub proporcje

zmiesza-nia (Mx) poszczególnych składników. Parametry te zostały

omówione w części opisującej krok 3 schematu analizy mieszanin DNA zaproponowanego przez Clytona i in.

Wyznaczone niezależnie dla każdego locus wszystkie dopuszczalne kombinacje genotypów wykorzystywane są następnie w kolejnym etapie interpretacji mieszanin do analizy porównawczej z profilem DNA próbki referencyj-nej, a także do analizy statystycznej [2].

Tabela 2 Możliwe kombinacje genotypów dla mieszaniny DNA

z ujawnionymi 2, 3 lub 4 allelami w locus Possible genotype combinations for DNA mixtures

with detected 2, 3 or 4 alleles in locus

Dla 4 alleli a, b, c, d Dla 3 alleli a, b, c Dla 2 alleli a, b

a,b c,d a,a b,c a,a a,b

a,c b,d b,b a,c a,b a,b

a,d b,c c,c a,b a,a b,b

c,d a,b a,b a,c a,b b,b

b,d a,c b,c a,c a,b a,a

b,c a,d a,b b,c b,b a,a

b,c a,a b,b a,b a,c b,b a,b c,c a,c a,b a,c b,c b,c a,b

Klucz: kombinacje odwrócone zostały oznaczone czcionką koloru czerwonego.

typ D – większość pików mieszaniny ma wysokość po-•

niżej 150 RFU (relative fluorescence units) (ryc. 10) [5]

Krok 4 Wyznaczenie dopuszczalnych kombinacji genotypów dla każdego locus Na tym etapie analizy mieszaniny DNA wyniki uzy-skane z badań próbki porównawczej nie mogą mieć wpływu na interpretację. Na wstępie dla analizowanej mieszaniny DNA zakłada się dopuszczalność wszystkich możliwych kombinacji alleli oznaczonych dla poszcze-gólnych loci, które wyznacza się niezależnie dla każdego układu. Wyznaczając kombinacje alleli, jako punkt odnie-sienia można wykorzystać model Evetta. Jest to metoda jakościowa, która nie uwzględnia aspektów ilościowych profilu (tj. wartości pól powierzchni lub wysokości pików). Zgodnie z przywołanym modelem dla czterech alleli w lo-cus istnieją trzy możliwe kombinacje par alleli. Dla lolo-cus z oznaczonymi trzema allelami można wyznaczyć sześć kombinacji par alleli, natomiast w przypadku ujawnie-nia dwóch alleli w locus możliwe są cztery kombinacje genotypów (tab. 2). W locus z oznaczonym jednym alle-lem jedyną możliwością jest to, że obie osoby w danym układzie będą miały identyczne allele (układ homozygo-tyczny) [1].

Wiele kombinacji genotypów wyznaczonych z wyko-rzystaniem danych jakościowych można wykluczyć na podstawie dwóch parametrów uwzględniających dane ilościowe stanowiące niejako filtry, na podstawie któ-rych dokonuje się selekcji i rozstrzyga, czy rozpatrywa-na kombirozpatrywa-nacja genotypów jest dopuszczalrozpatrywa-na, czy też można ją wykluczyć z dalszej analizy. Pierwszym pa-rametrem jest stopień zbalansowania heterozygot (Hb) w rozpatrywanych konfiguracjach alleli. W sytuacji gdy wyklucza się możliwość nakładania się sygnałów dwóch alleli, zbalansowanie heterozygoty (Hb) wyraża się sto-sunkiem pola powierzchni (wysokości) mniejszego piku na elektroforegramie do pola powierzchni (wysokości) większego piku:

Ryc. 10. Przykład mieszaniny DNA typu D Fig. 10. Example of DNA type D mixture

Krok 5 Porównanie otrzymanego wyniku z profilem DNA próbki referencyjnej

Chcąc uniknąć stronniczości niezwykle istotne jest dopilnowanie, by opisane powyżej kroki przeprowadza-ne były niezależnie od wyników uzyskanych dla próbek referencyjnych. Dopiero na tym etapie dopuszcza się po-równanie wyników. O ile opiniowanie w przypadku poje-dynczego profilu DNA raczej nie przysparza problemów ekspertowi, o tyle analiza porównawcza mieszanin DNA jest bardziej skomplikowana. W przypadku gdy w analizo-wanej mieszaninie DNA pochodzącego od dwóch osób obecne są wszystkie allele charakterystyczne dla profilu DNA próbki referencyjnej i pasują do wyznaczonych na podstawie analizy ilościowej dopuszczalnych kombinacji genotypów, istnieje prawdopodobieństwo, że jednym ze składników analizowanej mieszaniny jest DNA oznaczone z próbki porównawczej.

Odwrotna sytuacja ma miejsce, gdy w badanych ukła-dach analizowanej mieszaniny DNA brakuje alleli charak-terystycznych dla profilu DNA próbki referencyjnej. Wów-czas należy rozważyć wykluczenie obecności DNA osoby stanowiącej źródło materiału referencyjnego. Opiniowanie wykluczające obecność DNA oznaczonego z próbki po-równawczej w analizowanej mieszaninie ma miejsce rów-nież wtedy, gdy w badanej próbce obecne są wszystkie allele charakterystyczne dla profilu DNA próbki referen-cyjnej, ale nie pasują one do żadnej z wyznaczonych do-puszczalnych kombinacji genotypów [3].

Ze względu na to, że sposób wyrażania mocy dowo-dowej wyników uzyskanych w ramach opinii genetycznej może budzić wiele kontrowersji, uzyskane wyniki oraz wnioskowanie na ich podstawie powinno być wsparte od-powiednio dobranymi metodami statystycznymi.

Metody statystyczne wykorzystywane w analizie wyników profilowania

Do analizy statystycznej wykorzystywane są różne metody opierające się na częstości występowania alleli w danej populacji, których zastosowanie uzależnione jest od złożoności otrzymanego wyniku badań.

Prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności Prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności jest stosowane w odniesieniu do pojedynczych profili DNA. Na wstępie analizy w metodzie tej przyjmuje się hipotezę oznaczaną jako hipotezę zerową (H₀) odnoszącą się do pochodzenia DNA w badanym śladzie. Hipoteza zerowa zakłada, że DNA otrzymane z materiału dowodowego nie pochodzi od osoby podejrzanej, pomimo zgodności wszystkich alleli w zakresie badanych układów, a może

pochodzić od innej przypadkowej osoby z populacji, niespokrewnionej z osobą podejrzaną. Formalnie praw-dopodobieństwo przypadkowej zgodności zapisuje się wzorem:

Pr(E/H₀),

co należy rozumieć jako prawdopodobieństwo dowodu (E) przy założeniu hipotezy zerowej (H₀).

Podczas analizy wszystkie badane układy są rozpatry-wane niezależnie. Dla loci, w których oznaczono dwa allele (konfiguracja heterozygoty), częstość występowania danej konfiguracji alleli, np. A i B, oblicza się, stosując wzór:

Pr(E/H₀)= 2p_Ap_B,

gdzie p_A i p_B oznaczają częstości występowania alleli A i B w populacji.

Dla locus z ujawnionym pojedynczym allelem, np. C, częstość jego występowania w konfiguracji homozygoty oblicza się według wzoru:

Pr(E/H₀)= (p_C)2_,

gdzie p_C oznacza częstość występowania allela C w po-pulacji.

Wynik końcowy, stanowiący iloczyn wartości uzyska-nych dla poszczególuzyska-nych loci, wyraża, jakie jest prawdo-podobieństwo, że przypadkowa osoba z danej populacji, poza osobą podejrzaną i z nią niespokrewnioną, mogłaby mieć taki sam profil DNA. Wartość prawdopodobieństwa przypadkowej zgodności określa jednocześnie, z jaką częstością w populacji występuje profil DNA otrzymany z badanej próbki. Im mniejsza jest wartość prawdopo-dobieństwa przypadkowej zgodności, tym bardziej praw-dopodobne jest, że DNA z badanego śladu pochodzi od osoby podejrzanej. Przykładowo, gdy wartość prawdopo-dobieństwa przypadkowej zgodności wynosi np. 0,000001 oznacza to, że w przybliżeniu jedna osoba na milion nie-spokrewnionych osób w danej populacji może mieć DNA o profilu zgodnym z profilem DNA uzyskanym z badanego śladu [2].

W przypadku analizy statystycznej opierającej się na prawdopodobieństwie przypadkowej zgodności istnieje możliwość uwzględnienia współczynnika pochodzenia F_st (coancestry coefficient), który definiowany jest dla ca-łej populacji. Współczynnik ten określa, jakie jest praw-dopodobieństwo, że dwa allele wzięte losowo od dwóch różnych osób, również losowo wybranych z populacji, są identyczne z pochodzenia. Współczynnik ten w zależno-ści od rodzaju populacji, dla której jest określany, wynosi odpowiednio:

F

• _st = 0,01 dla populacji typowych, F

• _st = 0,03 dla małych odosobnionych populacji lub po-pulacji trudno poddających się asymilacji.

Prawdopodobieństwo włączenia (P_i – inclusion) i wykluczenia (P_ex – exclusion)

Zgodnie z zaleceniami International Society of Foren-sic Genetics (ISFG) prawdopodobieństwo wykluczenia i prawdopodobieństwo włączenia w analizie wyników uzy-skanych dla mieszanin DNA od dwóch osób lub większej ich liczby powinno się stosować w przypadkach, w których wyklucza się możliwość wystąpienia zjawiska wypadania alleli. Metody te są powszechnie stosowane, zwłaszcza w przypadku mieszanin DNA pochodzącego od dwóch osób, w których możliwe jest wyraźne rozróżnienie skład-nika większego i mniejszego. Jeżeli wszystkie allele cha-rakterystyczne dla DNA oznaczonego z materiału porów-nawczego są obecne wśród pików profilu analizowanej mieszaniny DNA, nie można wykluczyć obecności DNA tej osoby w otrzymanej mieszaninie i możliwe jest warunko-we opiniowanie, którego siła uzależniona jest od wartości prawdopodobieństwa włączenia/wykluczenia [2, 3, 6].

Prawdopodobieństwo włączenia (P_i) przyjmuje zało-żenie, że możliwe są wszystkie kombinacje geneotypów w danym locus, które nie mogą być wykluczone z miesza-niny DNA. Każdy z układów rozpatrywany jest niezależ-Każdy z układów rozpatrywany jest niezależ-nie. Prawdopodobieństwo włączenia (P_i) oblicza się na podstawie wzoru: Pi= (p_A + p_B + p_C + ... + p_n)2, gdzie p • _A, p_B, p_C – częstości alleli A, B, C p

• _n – częstość ostatniego allela w locus.

Analogicznie jak w przypadku prawdopodobieństwa przypadkowej zgodności wynik końcowy stanowi iloczyn wartości wyznaczonych dla każdego locus niezależnie.

Prawdopodobieństwo wykluczenia (P_ex) określa, z ja-kim prawdopodobieństwem przypadkowa osoba z popu-lacji może być wykluczona jako źródło DNA w badanym śladzie. Podobnie, jak w przypadku prawdopodobieństwa przypadkowej zgodności, każdy układ alleli rozpatrywany jest niezależnie. Dla konfiguracji heterozygoty (np. A i B) – locus z ujawnionymi dwoma allelami – wartość prawdopo-dobieństwa wykluczenia oblicza się na podstawie wzoru:

P_ex = 1 – 2p_Ap_B,

zaś dla konfiguracji homozygoty (np. C) – locus z ujawnio-nym jedujawnio-nym allelem – prawdopodobieństwo wykluczenia wynosi:

P_ex = 1 – (p_C)2

Wynik końcowy, będący iloczynem wartości otrzyma-nych dla poszczególotrzyma-nych loci, określa, jakie jest prawdo-podobieństwo potwierdzenia hipotezy zerowej, że

przy-padkowa osoba z populacji będzie mogła być wykluczona jako źródło DNA w badanym śladzie. Im wyższa jest war-tość prawdopodobieństwa wykluczenia, tym bardziej prawdopodobna jest słuszność przyjętego na wstępie za-łożenia (H₀). W porównaniu z wynikiem prawdopodobień-stwa przypadkowej zgodności wynik prawdopodobieńprawdopodobień-stwa wykluczenia jest trudniej interpretować pod względem siły dowodowej analizowanego wyniku.

Prawdopodobieństwo włączenia i prawdopodobień-stwo wykluczenia są metodami komplementarnymi i pod-legają następującym zależnościom [4]:

P_ex = 1 – Pi Pex(1…n) = 1 – [Pi1 x Pi2 x … x Pin]

Iloraz wiarygodności LR (likelihood ratio)

Zgodnie z rekomendacją opracowaną przez ISFG pre-ferowanym sposobem interpretacji mieszanin DNA jest iloczyn prawdopodobieństwa warunkowego najczęściej dwóch hipotez, który służy do wyrażania siły dowodu – pro-filu DNA otrzymanego ze śladu. Jedną z nich jest hipoteza oskarżyciela (oznaczana jako H_p), która zakłada, że bada-ny ślad biologiczbada-ny pozostawiobada-ny został na miejscu zdarze-nia przez osobę podejrzaną, co wynika ze zgodności profili DNA uzyskanego z materiału dowodowego i porównawcze-go. Drugą hipotezą jest hipoteza obrońcy (oznaczana jako H_d), która zakłada, że DNA w śladzie pochodzi od przy-padkowej osoby z populacji, niespokrewnionej z osobą po-dejrzaną, o profilu wykazującym zgodność z profilem DNA uzyskanym z materiału dowodowego. Szansa, że to osoba podejrzana zostawiła na miejscu zdarzenia ślad biologicz-ny (tzw. szansa a posteriori) stanowi iloczyn szans przema-wiających za przyjęciem takiej hipotezy przed wykonaniem badań biologicznych (szanse a priori) i wartości LR:

szanse a posteriori = LR x szanse a priori Wartość LR wyraża stosunek prawdopodobieństwa do-wodu z badań DNA przy założeniu dwóch hipotez (oskar-życiela i obrońcy), co zapisuje się w postaci wzoru [2]:

gdzie:

E – dowód z badań DNA H_p – hipoteza oskarżyciela H_d – hipoteza obrońcy

W przypadku mieszanin DNA pochodzącego od dwóch osób rozpatrywane hipotezy można sklasyfikować w trzy zasadnicze grupy [2]:

H_p – mieszanina zawiera DNA ofiary (podejrzanego) i po-dejrzanego (ofiary)

Hd – mieszanina zawiera DNA ofiary (podejrzanego) i

nie-znanej osoby

Hp – mieszanina zawiera DNA ofiary 1 (podejrzanego 1)

i ofiary 2 (podejrzanego 2)

Hd – mieszanina zawiera DNA pochodzące od dwóch

nie-znanych, niespokrewnionych osób

Hp – mieszanina zawiera DNA ofiary (podejrzanego) i

nie-znanej, niespokrewnionej osoby

Hd – mieszanina zawiera DNA pochodzący od dwóch

nie-znanych, niespokrewnionych osób.

W zależności od rozpatrywanej grupy hipotez co do pochodzenia DNA w mieszaninie oraz od liczby alleli oznaczonych w danym locus w obliczeniach wartości LR stosuje się odpowiednie wzory przedstawione w tabelach poniżej (tab. 3, 4 i 5) [2].

Tabela 3 Obliczanie wartości LR dla mieszaniny DNA pochodzącego od dwóch osób,

do której stosuje się hipotezy z grupy I

Calculation of LR for DNA mixture originating from two persons, where group I hypothesis is applicable

Analizowana mieszanina – oznaczone allele Genotyp DNA ofiary Genotyp DNA osoby podejrzanej LR A₁, A₂, A₃, A₄ A₁, A₂ A₃, A₄ A₁, A₂, A₃ A₁, A₂ A₁, A₃; A₂, A₃; A₃, A₃ A₁, A₂, A₃ A₁, A₁ A₂, A₃ A₁, A₂ A₁, A₂ A₁, A₁; A₁, A₂; A₂, A₂ A₁, A₂ A₁, A₁ A₁, A₂; A₂, A₂ A_1, A₁ A₁, A₁ A₁, A₁ Tabela 4 Obliczanie wartości LR dla mieszaniny DNA pochodzącego od dwóch osób,

do której stosuje się hipotezy z grupy II

Calculation of LR for DNA mixture originating from two persons, where group II hypothesis is applicable

Analizowana mieszanina – oznaczone allele Genotyp DNA podejrzanego 1 Genotyp DNA podejrzanego 2 LR A₁, A₂, A₃, A₄

Każda kombinacja genotypów składająca się z alleli oznaczonych w badanych układach A₁, A₂, A₃

A₁, A₂

Tabela 5 Obliczanie wartości LR dla mieszaniny DNA pochodzącego od dwóch osób,

do której stosuje się hipotezy z grupy III

Calculation of LR for DNA mixture originating from two persons, where group III hypothesis is applicable

Analizowana mieszanina

– oznaczone allele Genotyp DNA znanego podejrzanego LR

A1, A2, A3, A4 A1, A2 A₁, A₂, A₃ A₁, A₂ A₁, A₂, A₃ A₁, A₁ A₁, A₂ A₁, A₂ A1, A2 A1, A1 A_1, A₁ A₁, A₁ Tabela 6 Zależności pomiędzy numeryczną wartością LR a słownym wyrażeniem siły dowodowej wyniku Relationship between LR numerical value and evidential

strength of results

Wartość LR Siła dowodu Wspierana

hipoteza 1 000 000 + D. supermocny Hp 100 000 D. bardzo mocny 10 000 D. mocny 1000 D. umiarkowanie mocny 100 D. umiarkowany 10 D. ograniczony 1 D. nierozstrzygający 0,1 D. ograniczony Hd 0,01 D. umiarkowany 0,001 D. umiarkowanie mocny 0,0001 D. mocny 0,00001 D. bardzo mocny 0,000001 D. super mocny Wartość LR oblicza się dla każdego locus niezależnie

na podstawie częstości konfiguracji alleli w danym locus, a wynik końcowy stanowi iloczyn wartości uzyskanych dla poszczególnych układów.

Obliczoną wartość LR dla analizowanego profilu DNA należy zinterpretować pod względem siły dowodu i wy-razić ją słownie. Zestawienie zależności pomiędzy nu-meryczną wartością LR a słownym wyrażeniem siły do-wodowej otrzymanego wyniku zamieszczone zostało w tabeli (tab. 6) opracowanej przez Forensic Science Se-rvice (FSS) [2].

Jeżeli wartość LR = 1 oznacza to, że wynik z badań DNA jest nierozstrzygający, gdyż szanse przemawiające za hipotezą oskarżyciela, po uwzględnieniu wyniku z ba-dań DNA (szanse a posteriori), nie zmieniają się w sto-sunku do szans potwierdzających słuszność twierdze-nia oskarżyciela przed wykonaniem badań DNA (szans a priori).

W przypadku gdy wartość LR > 1, szanse, że hipoteza oskarżyciela jest słuszna, są wzmocnione przez dowód z badań DNA. Natomiast jeśli wartość LR < 1, analizowany wynik genotypowania DNA przemawia za hipotezą obroń-cy, osłabiając tym samym stanowisko oskar życiela.

Wyżej opisane metody statystyczne wykorzystywane razem bądź niezależnie wspomagają analizę wyników z badań DNA, a ich wybór uzależniony jest od otrzymane-go wyniku genotypowania DNA (tab. 7).

Tabela 7 Zestawienie wykorzystania metod statystycznych w zależności od otrzymanego wyniku genotypowania

DNA

Collation of use of statistical methods depending on the result of DNA genotyping

Metody statystyczne Profil DNA jednej osoby Mieszanina DNA dwóch osób Mieszanina DNA trzech osób lub większej ich liczby Prawdopo-dobieństwo przypadkowej zgodności X X Prawdopo-dobieństwo włączenia/ wykluczenia X X LR X X

Uwzględniając omówione w niniejszym opracowaniu zagadnienia związane z analizą wyników uzyskanych z badań genetycznych, poniżej przedstawiono w skrócie przykładowy sposób postępowania podczas analizy mie-szanin DNA pochodzącego od dwóch osób lub większej ich liczby.

Przykładowy sposób postępowania podczas analizy mieszanin DNA pochodzącego od dwóch osób

Na wstępie analizy mieszanin DNA pochodzącego od dwóch osób wykorzystuje się dane jakościowe pozwala-jące na wyznaczenie wszystkich możliwych kombinacji alleli w locus. Następnie kombinacje te są weryfikowane na podstawie danych ilościowych (tj. pola powierzchni lub wysokości pików) przez ocenę dwóch parametrów, tj. stopnia zbalansowania heterozygot oraz stopnia/pro-porcji zmieszania składników mieszaniny DNA. Analiza oparta na wyżej wymienionych parametrach jest możliwa tylko w przypadku mieszanin z wyraźnie wyodrębniony-mi poszczególnywyodrębniony-mi składnikawyodrębniony-mi – wyodrębniony-mieszaniny typu B i C. Zaakceptowane dopuszczalne kombinacje genotypów są wykorzystywane do dalszej analizy porównawczej z pro-filem DNA oznaczonym dla próbki referencyjnej, jak rów-nież do analizy statystycznej. Sytuacja komplikuje się, gdy mamy do czynienia z mieszaninami DNA typu A (bez wyodrębnionego składnika mniejszego i większego), ponieważ w takich przypadkach nie ma możliwości

se-lekcji wyznaczonych kombinacji genotypów. W związku z powyższym w analizie wykorzystywane są wszystkie możliwe kombinacje.

W przypadku mieszanin DNA pochodzącego od dwóch osób możliwe jest wykorzystanie wszystkich wyżej opisa-nych metod statystyczopisa-nych, a rodzaj zastosowanej meto-dy zależy od typu, do jakiego dana mieszanina została zakwalifikowana.

Przykładowy sposób postępowania podczas analizy mieszanin DNA pochodzącego od więcej niż dwóch osób

Interpretacja wyników genotypowania mieszanin DNA pochodzącego od więcej niż dwóch osób wymaga zawsze indywidualnego podejścia i jest uzależniona od stopnia złożoności oraz jakości uzyskanego wyniku, a także od pochodzenia śladu. W interpretacji tego typu wyników ba-dań DNA pomija się etap analizy z wykorzystaniem da-nych ilościowych. W analizie statystycznej wykorzystuje się prawdopodobieństwo włączenia lub prawdopodobień-stwo wykluczenia. Zaletą metody prawdopodobieństwa włączenia lub wykluczenia DNA przypadkowej osoby z populacji zastosowanej w analizie mieszanin DNA jest to, że nie wymaga ona ustalenia faktycznej liczby osób, od których pochodzi DNA w badanej próbce. Zastosowa-nie ilorazu wiarygodności (LR) w analizie mieszanin DNA pochodzącego od więcej niż dwóch osób jest utrudnione, gdyż wymaga ustalenia faktycznej liczby osób, od których pochodzi DNA w badanej próbce, co w przypadku takich mieszanin jest często niemożliwe. Utrudnione jest również rozpatrywanie hipotez co do pochodzenia DNA w śladzie. W przypadku interpretacji mieszanin DNA pochodzą-cego od więcej niż dwóch osób, w zależności od wyniku analizy statystycznej, tj. wartości prawdopodobieństwa włączenia (wykluczenia), możliwe jest warunkowe opi-niowanie stwierdzające, że w otrzymanej mieszaninie obecne są cechy DNA osoby, od której pobrano materiał porównawczy i „mogą one od niej pochodzić” lub że „nie można wykluczyć” obecności DNA tej osoby w dowodo-wej mieszaninie DNA.

Z praktyki wynika, że większość mieszanin DNA po-chodzącego od więcej niż dwóch osób, ze względu na trudności w ich interpretacji, nie kwalifikuje się do przepro-wadzenia analizy porównawczej.

BIBLIOGRAFIA

1. T.M. Clayton, J.P. Whitaker, R. Sparkes, P. Gill: Ana-lysis and interpretation of mixed forensic stains using DNA STR profiling, Forensic Science International, 1998.

2. J. Buckleton, C.M. Triggs, S.J. Walsh: Forensic DNA Evidence Interpretation, CRC Press, London, 2005.

3. P. Gill, C.H. Brenner, J.S. Buckleton, A. Carracedo, M. Krawczak, W.R. Mayr, N. Morling, M. Prinz, P.M. Schne-ider, B.S. Weir: DNA commission of the International So-ciety of Forensic Genetics: Recommendations on the in-terpretation of mixtures, Forensic Science International, 2006.

4. J.M. Butler: Forensic DNA Typing, Elsevier Aca-demic Press, second edition, 2005.

5. P.M. Schneider, R. Fimmers, W. Keil, G.Molsberger, D. Patzelt. W. Pflug, T. Rothämel, H. Schmitter, H. Schnei-der, B. Brinkmann: Allgemeine Empfehlungen der Spuren-kommission zur Bewertung von DNA-Mischspuren.

6. N. Rudin, K. Inman: Forensic DNA Analysis, CRC Press, second edition, 2002.

Streszczenie

Analiza śladów biologicznych zawierających DNA od dwóch osób lub większej ich liczby jest jednym z najtrudniejszych wyzwań stojących przed ekspertami z zakresu kryminalistycznych badań genetycznych. Tego rodzaju ślady wymagają od eksperta wykonującego badania, poza dosko-nałym warsztatem badawczym, także umiejętności poprawnej analizy wyników przeprowadzonej zgodnie z ogólnie przyjętymi na świecie zasa-dami. Ponadto ekspert, analizując wyniki badań DNA, powinien wykazać się poprawnym zastosowaniem metod analizy statystycznej otrzymanego

wyniku oraz zachowaniem szczególnej ostrożności przy formułowaniu wniosków. Artykuł powstał z myślą o opracowaniu jednolitych podstaw teoretycznych w języku polskim bazujących na światowych publikacjach naukowych będących pomocnym narzędziem w analizie wyników badań DNA, ze szczególnym uwzględnieniem mieszanin DNA.

Słowa kluczowe: mieszanina DNA, stopień zmieszania, proporcje

zmieszania, balans heterozygotyczny, prawdopodobieństwo przypadko-wej zgodności, iloraz wiarygodności, prawdopodobieństwo wykluczenia, prawdopodobieństwo włączenia.

Summary

The analysis of DNA biological traces originating from more than two persons belongs to one of the most challenging tasks of forensic DNA experts. DNA mixtures require not only excellent research background of the expert but also their ability to provide the most pertinent analysis of findings, conducted in line with generally approved principles. On top of this, the forensic expert, when analyzing DNA results, should be able to utilize proper statistical methods whilst taking particular care in formu-lating the results. The paper has been elaborated with the view of devel-oping uniform theoretical basis for examiners in Poland, and which are based on worldwide scientific publications helpful in interpreting DNA analytical findings with a particular emphasis on DNA mixtures.

Keywords: DNA mixture, mixture level, mixture proportion,

heterozygotic balance, random match probability, likelihood ratio, prob-ability of exclusion, probprob-ability of inclusion.