Mak jest jedn¹ z najstarszych roœlin rolniczych, któ-rej œlady uprawy s¹ spotykane w wykopaliskach arche-ologicznych z czasów prehistorycznych. Wykorzysty-wano go w celu pozyskania œrodków odurzaj¹cych, zw³aszcza opium, którym handel w wiekach XVII–XIX przyczyni³ siê do rozwoju francuskich i an-gielskich kolonii w Indiach. W Europie do XIX wieku mak uprawiano na potrzeby domowe oraz jako roœlinê ozdobn¹. Po II wojnie œwiatowej nast¹pi³ wzrost area³u jego uprawy.
Do rodzaju mak (Papaver) nale¿y oko³o stu gatun-ków ró¿ni¹cych siê wieloma cechami, m.in. pokrojem roœliny, kolorem i kszta³tem p³atków korony, kszta³tem makówki, barw¹ i sk³adem chemicznym nasion oraz zawartoœci¹ alkaloidów w roœlinie. Znaczenie rolnicze ma mak lekarski (Papaver
somni-ferum L.). Najbardziej rozpo-wszechniony jest jego podgatunek euroazjatycki – ssp. euroasiaticum o torebkach zamkniêtych pod tar-cz¹ znamienia i nieosypuj¹cych siê nasionach.
Obecnie w Polsce, w celu uzy-skania nasion bêd¹cych surow-cem w przemyœle cukierniczym i piekarniczym, uprawiany jest wy-³¹cznie mak niskomorfinowy. W 1990 r. zarejestrowano jego pierwsz¹ odmianê – Przemko, charakteryzuj¹c¹ siê bardzo nisk¹ zawartoœci¹ alkaloidów morfino-wych w dojrza³ych makówkach. W nastêpnych latach wyhodowano kolejne odmiany maków niskomor-finowych, które zosta³y zapisane w Rejestrze Odmian [1] (tab. 1).
Wyhodowanie nowych odmian maków niskomorfinowych maj¹-cych ró¿ny pokrój lub barwê p³at-ków korony, w porównaniu do od-miany wysokomorfinowej, której uprawa jest zakazana, u³atwia
kontrolê zasiewów, a tak¿e likwidacjê nielegalnych plantacji.
Zgodnie z Ustaw¹ o przeciwdzia³aniu narkomanii uprawa maku, z wyj¹tkiem maku niskomorfinowego, mo¿e byæ prowadzona wy³¹cznie na potrzeby przemy-s³u farmaceutycznego i nasiennictwa. Mak mo¿na pro-dukowaæ na podstawie umowy kontraktacyjnej i uzy-skanego z urzêdów gmin p³atnego pozwolenia na upra-wê [2].
Aktualne zapotrzebowanie na nasiona maku na ryn-ku krajowym nie jest pokrywane przez rodzimych pro-ducentów. Jest to spowodowane przede wszystkim wprowadzeniem zakazu uprawy maku wysokomorfino-wego, œcis³ej kontroli jego uprawy i rejonizacji. W 2001 Mariola Burstein
Badanie zawartości morfiny
w płynach ustrojowych osób po spożyciu
produktów spożywczych zawierających mak
oraz jej oznaczanie w tych wyrobach
Tabela 1 Zestawienie odmian maków niskomorfinowych w Rejestrze Odmian
Varieties of low morphine poppies registered on Variety Index Odmiana Hodowca Rok rejestracji Zawartoœæ morfiny w makowinach [%] Barwa kwiatów PRZEMKO IHAR Poznañ we wspó³pracy
z ZD HAR Borowo 1990 < 0,06 bia³e z fioletowym oczkiem MIESZKO ZD HAR Borowo we wspó³pracy z IHAR Poznañ
1999 < 0,04
ciemnoró¿owe z jasnofioletowym,
oczkiem MICHA£KO
IHAR Poznañ we wspó³pracy z ZD HAR Borowo
1999 < 0,04 bia³e z fioletowym oczkiem RUBIN
ZD HAR Borowo we wspó³pracy z IHAR Poznañ
2000 < 0,04 ciemnoró¿owe z jasnofioletowym, oczkiem AGAT ZD HAR Borowo we wspó³pracy z IHAR Borowo
2000 < 0,05
ró¿owe z jasnofioletowym,
oczkiem ZAMBO
IHAR Poznañ we wspó³pracy z ZD HAR Borowo
2000 < 0,05
ró¿owe z jasnofioletowym,
r. zbierano plony z powierzchni 2054 ha, a w 2003 r. ju¿ tylko z 1200 ha.
Mak zajmuje w Polsce stosunkowo niewielk¹ po-wierzchniê uprawy, a jego cena jest bardzo wysoka. Tak jak w pañstwach oœciennych jego nasiona s¹ u¿y-wane w naszym kraju przede wszystkim w przemyœle piekarniczym, cukierniczym i gastronomicznym. Wyso-ko ceni siê tak¿e spo¿ywczy i przemys³owy olej maWyso-ko- mako-wy.
Sta³e zagro¿enie stwarza import konsumpcyjnych nasion maku wysokomorfinowego wykorzystywanych do zak³adania nielegalnych plantacji.
Wyniki wielu badañ analitycznych i liczne donie-sienia wskazywa³y, ¿e po spo¿yciu produktów zawiera-j¹cych mak lub po za¿yciu leków, których sk³adnikiem jest kodeina, w moczu pozostaj¹ œlady morfiny. Po-twierdzi³y to badania przeprowadzone w Pracowni Psy-chofarmakologii Katedry Psychiatrycznej Akademii Me-dycznej w Warszawie. Jednorazowym testem jakoœcio-wym na obecnoœæ narkotyków zbadano mocz 16-let-niego ch³opca. Uzyskano wynik dodatni, poniewa¿ test wskaza³ obecnoœæ morfiny.
Mocz poddano badaniu metod¹ FPIA na analizato-rze TDX firmy Abott. Stê¿enie morfiny w moczu wynio-s³o 425 ng/ml i przekroczy³o wartoœæ progow¹ wyno-sz¹c¹ 250 ng/ml. Z przeprowadzonego z ch³opcem i je-go matk¹ wywiadu wynika³o, ¿e badany zjad³ poprzed-niego dnia dro¿d¿ówkê z makiem. Zaniepokojona ta-kim wynikiem matka ch³opca, w celu sprawdzenia wia-rygodnoœci otrzymanych wyników badañ, zjad³a w ci¹-gu dwóch dni trzy dro¿d¿ówki, które kupi³a w tej samej piekarni. Równie¿ w jej moczu wykazano obecnoœæ morfiny, której stê¿enie w teœcie FPIA wynios³o 975 ng/ml. Badanie przeprowadzono nastêpnie na kolej-nych trzech osobach, które spo¿y³y dro¿d¿ówki pocho-dz¹ce z tego samego Ÿród³a. Wyniki równie¿ by³y do-datnie.
Pozytywne wyniki w tych samych próbkach moczu zosta³y potwierdzone przez inne laboratoria: Pracow-niê Toksykologiczn¹ Instytutu Ekspertyz S¹dowych w Krakowie, Pracowniê Badañ Narkotyków w P³ynach Ustrojowych CLK KGP oraz Pracowniê Zak³adu Badañ Antydopingowych Instytutu Sportu. Oznaczenia wyko-nano metodami HPLC i GC-MS [3].
Opisany w raporcie opublikowanym przez Pracow-niê Psychofarmakologii problem wystêpowania morfiny w moczu powy¿ej wartoœci progowej po zjedzeniu wy-robów zawieraj¹cych mak zainspirowa³ autorkê niniej-szej pracy do przeprowadzenia niezale¿nych, w³a-snych badañ. Dodatkowym bodŸcem by³ fakt, ¿e nie znaleziono publikacji naukowych dotycz¹cych badañ na wykrywanie obecnoœci morfiny w p³ynach ustrojo-wych po spo¿yciu produktów cukierniczych zawieraj¹-cych mak.
Alkaloidy opium – charakterystyka
Opium otrzymuje siê przez wysuszenie odpowied-nio przygotowanego soku z niedojrza³ych makówek maku lekarskiego (Papaver somniferum L.). Zawarte w opium substancje maj¹ silne dzia³anie farmakolo-giczne, co odkryto ju¿ ponad 6000 lat temu (œwiadcz¹ o tym zapisy na sumeryjskich tabliczkach). Obecnie na œwiecie produkuje siê oko³o 520 ton opium w prze-liczeniu na czyst¹ morfinê – g³ównie w po³udniowo--wschodniej i po³udniowo-zachodniej Azji, Ameryce Po³udniowej i Meksyku.
Opium zawiera oko³o 20 alkaloidów nale¿¹cych do dwóch grup:
– alkaloidy fenantrenowe (morfina, kodeina, teba-ina),
– alkaloidy izochinolinowe (papaweryna, narkotyna (noskapina), narceina).
Spoœród tych alkaloidów najwiêksze znaczenie ma-j¹ morfina, kodeina i tebaina, która nie ma dzia³ania narkotycznego, ale s³u¿y do produkcji innych zwi¹zków psychoaktywnych [4].
Morfina – charakterystyka
Morfina (3,6-dihydroksy-4,5-epoksy-N-metylomor-finen-7) zosta³a po raz pierwszy wyizolowana z opium przez Sertürnera w 1805 r. Jej strukturê okreœli³ w 1927 r. Richardson, a jej pierwsza synteza zosta³a przeprowadzona 150 lat po wyizolowaniu, czyli w 1952 r. (ryc. 1).
W celach klinicznych morfina jest stosowana w po-staci siarczanu – bia³ego proszku rozpuszczalnego w wodzie (1 g w 15,5 ml wody) i praktycznie nieroz-puszczalnego w chloroformie i eterze. Wch³ania siê z przewodu pokarmowego w ograniczonym stopniu, w 15–75% zale¿nie od w³aœciwoœci osobniczych. Dzia-³a uspokajaj¹co i przeciwlêkowo, poprawia samopo-czucie, zmniejsza zdolnoœæ odczuwania bólu. Wi¹¿e siê z bia³kami krwi w 35–40% i ³atwo przenika do wszystkich tkanek. Metabolizowana jest w w¹trobie,
Ryc. 1. Wzór strukturalny morfiny Fig. 1. Morphine structural formula
przez O-metylacjê do kodeiny i N-metylacjê do normor-finy, szybko przenika przez œcianê b³ony ³o¿yska i do mleka matki. Wydalana jest g³ównie z moczem i w niewielkiej iloœci z ka³em. Okres po³owicznego wy-dalania wynosi 1–2 godziny.
Dawka toksyczna morfiny wynosi oko³o 60 mg, a dawka œmiertelna 300 mg po przyjêciu doustnym i 120–200 mg przy podaniu pozajelitowym. Morfina i jej metabolity s¹ sprzêgane z kwasem glukuronowym i wydalane z moczem.
Podstawowym zagro¿eniem, jakie stwarza przyjmo-wanie morfiny, jest rozwój tolerancji, a nastêpnie uza-le¿nienie. Nag³e odstawienie morfiny prowadzi do wy-st¹pienia objawów abstynencji. Morfina nasila dzia³a-nie innych opioidów, leków uspokajaj¹cych, nasen-nych, psychotropowych i etanolu.
Morfina wystêpuje w organizmie w postaci wolnej i sprzê¿onej. W moczu ludzkim w 10% w postaci wol-nej i 75% w postaci 3-glukuronidu morfiny (o okresie po³owicznego wydalania do 4 godzin). Pozosta³¹ czêœæ stanowi 6-glukuronid, 3-etero-siarczan i 3,6-diglukuro-nid morfiny. Wymienione metabolity s¹ równie¿ obecne we krwi i w osoczu.
Heroina – charakterystyka
Znacznie silniejszym œrodkiem uzale¿niaj¹cym jest heroina (diacetylomorfina) (ryc. 2), która zosta³a otrzy-mana przez diacetylacjê morfiny w 1898 r. i wprowa-dzona do u¿ytku jako lek przeciwbólowy przez firmê Bayer. Na rynku narkotykowym wystêpuje w postaci bia³ego proszku. Zawartoœæ heroiny w jednej dawce wynosi 21–60%. Pozosta³e sk³adniki to wype³niacze, którymi mog¹ byæ zwi¹zki obojêtne farmakologicznie (laktoza, skrobia), jak równie¿ aktywne: benzodiazepi-ny, strychnina, skopolamina i paracetamol.
Osoby uzale¿nione za¿ywaj¹ morfinê i heroinê ró¿-nymi drogami: do¿ylnie, donosowo, przez wdychanie lub palenie. Heroinê (w Polsce tzw. kompot) najczê-œciej przyjmuje siê do¿ylnie.
Rycina 3 ukazuje metabolizm opiatów zachodz¹cy w organizmie cz³owieka.
Heroina wprowadzona do ustroju ulega szybkiej hy-drolizie do 6-O-monoacetylomorfiny, która nastêpnie ulega powolnej hydrolizie do morfiny. G³ównymi meta-bolitami heroiny wystêpuj¹cymi w moczu przez 20–40 godzin po podaniu do¿ylnym s¹: 3-O-glukuronian mor-finy (38,2% dawki), 6-O-monoacetylomorfina (1,3%), wolna morfina (4,2%) oraz niezmieniona heroina (0,1%). Inne glukuroniany morfiny oraz normorfina po-wstaj¹ z heroiny w znikomych iloœciach [6].
W moczu ludzi przyjmuj¹cych ten narkotyk wystêpu-je czêsto kodeina, która nie wystêpu-jest metabolitem heroiny, ale powstaje w wyniku deacetylacji acetylokodeiny sta-nowi¹cej zanieczyszczenie nielegalnie produkowanej heroiny.
Heroina ulega bardzo szybkiemu metabolizmowi, przez co nie mo¿na jej w zasadzie wykryæ w p³ynach biologicznych – okres pó³trwania wynosi 2–3 minuty. Informacjê o tym, czy dana osoba za¿ywa³a heroinê, uzyskuje siê, oznaczaj¹c jej g³ówny metabolit – morfi-nê. O stosowaniu heroiny mo¿e œwiadczyæ tak¿e obec-noœæ w moczu 6-O-monoacetylomorfiny (MAM), jednak metabolit ten udaje siê wykryæ jedynie bezpoœrednio w ci¹gu 2–8 godzin po przyjêciu heroiny, gdy¿ szybko przekszta³ca siê on w woln¹ morfinê.
Ryc. 2. Wzór strukturalny heroiny Fig. 2. Heroin structural formula
Ryc. 3. Metabolizm opiatów w organizmie cz³owieka Fig. 3. Opiates metabolism in human body
Kodeina – charakterystyka
Kodeina (metylomorfina) jest naturalnym alkaloidem wystêpuj¹cym w opium. Po raz pierwszy zosta³a wyizo-lowana w 1832 r. przez Robiqueta (ryc. 4). Jest stoso-wana w postaci fosforanów i siarczanów jako lek prze-ciwkaszlowy i w mieszankach przeciwbólowych (wyka-zuje 20% przeciwbólowej aktywnoœci morfiny). Jako lek kodeina jest podawana doustnie lub podskórnie.
Kodeina stanowi sk³adnik „polskiej heroiny” i jest przyjmowana do¿ylnie. Dobrze wch³ania siê z przewo-du pokarmowego i po podaniu domiêœniowym (maksy-malne stê¿enie jest obserwowane po 15–60 minutach). Po podaniu doustnym maksymalne stê¿enie jest osi¹-gane po oko³o godzinie do dwóch.
Kodeina ulega biotransformacji do morfiny (O-de-metylacja) i norkodeiny (N-de(O-de-metylacja). Zarówno ko-deina, jak i jej metabolity ulegaj¹ nastêpnie sprzêganiu z kwasem glukuronowym (ryc. 5).
Oznaczanie morfiny
obecnej w moczu i ślinie
po spożyciu cukierniczych produktów
spożywczych zawierających mak
– wyniki własne
Oznaczanie morfiny obecnej w moczu po spo¿yciu dro¿d¿ówek z makiem – eksperyment I
Zebrano grupê jedenastu ochotników, którym poda-no do zjedzenia dro¿d¿ówki z makiem kupione w jed-nej z warszawskich piekarni (pochodzi³a z niej tak¿e dro¿d¿ówka zjedzona przez ch³opca, którego mocz ba-dano w Pracowni Psychofarmakologii Katedry Psychia-trycznej AM w Warszawie). Nastêpnie po up³ywie okre-œlonego czasu od ka¿dej z osób pobrano próbkê mo-czu, któr¹ nastêpnie poddano badaniom metod¹ immu-noenzymatyczn¹ na automatycznym analizatorze EVOLIS firmy Bio-Rad z wykorzystaniem firmowego zestawu odczynników na opiaty. Wyniki przedstawia tabela 2.
Ryc. 4. Model cz¹steczki kodeiny
Fig. 4. Codeine particle Ryc. 5. Schemat metabolizmu kodeiny [4] Fig. 5. Codeine metabolism scheme [4]
Tabela 2 Wyniki badañ próbek moczu
Results of urine sample analysis
Lp. Nr próbki (kolejna badana osoba) Czas, po którym pobrano próbkê [h] Uzyskane stê¿enie narkotyków z grupy opiatów [ng/ml] Wynik badania próbki 1 d1M 7,5 965,7 Pozytywny 2 d2M 7,5 255,1 Pozytywny 3 d3M 6 99,3 Negatywny 4 d4M 7,5 100,0 Negatywny 5 d5M 7,5 186,2 ???1 6 d6M 6 93,9 Negatywny 7 d7M 6 94,4 Negatywny 8 d8M 6 81,4 Negatywny 9 d9M 7,5 151,7 ???1 10 d10M 7,5 97,8 Negatywny 11 d11M – – –
1 – ??? – wynik w¹tpliwy (nieco mniejszy od „cut-off”)
„Cut-off” – graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania moczu wynosi 200 ng/ml. 1 – ??? – questionable result (slightly lower than „cut-off”)
„Cut-off” – treshold value of detection which separates positive and negative results, in case of opiates – amounts to 200 ng/ml for urine samples
Wyniki powy¿ej wartoœci „cut-off” s¹ wynikami pozytywnymi, w przedziale miêdzy 150 ng/ml a 200 ng/ml, w¹tpliwymi, zaœ poni¿ej wartoœci 150 ng/ml negatywnymi.
Kryteria walidacji metody immunoenzymatycznej na obecnoœæ opiatów przedstawiono w tabeli 3.
S1 > S2, 1,142 > 0,147 S2 > S3, 0,147 > 0,089 S3 > S4, 0,089 > 0,054
Na podstawie uzyskanych parametrów zosta³a wy-kreœlona krzywa zale¿noœci absorbancji od stê¿enia morfiny (ryc. 6).
Oznaczanie morfiny obecnej w œlinie po spo¿yciu dro¿d¿ówek z makiem – eksperyment II
Od tej samej grupy ochotników pobrano równie¿ próbki œliny w odstêpach czasowych odpowiednio po 2 i 4 godzinach od zjedzenia dro¿d¿ówki z makiem. Próbki te, podobnie jak próbki moczu, poddano bada-niu metod¹ immunoenzymatyczn¹ na automatycznym analizatorze EVOLIS firmy Bio-Rad z wykorzystaniem firmowych zestawów odczynników na opiaty. Uzyskane wyniki badañ zosta³y przedstawione w tabeli 4.
Wynik Stê¿enie opiatów [ng/ml] Absorbancja S1 0,000 1,142 S2 50,000 0,147 S3 300,000 0,089 S4 500,000 0,054 Tabela 3
Ryc. 6. Wykres zale¿noœci absorbancji od stê¿enia morfiny Fig. 6. Relationship between absorbance and morphine concentration
Tabela 4 Wyniki badañ próbek œliny
Results of saliva sample analysis
Lp. Nr próbki (kolejna badana osoba) Uzyskane stê¿enie po 2 h [ng/ml]
Wynik badania próbki
Nr próbki (kolejna badana osoba) Uzyskane stê¿enie po 4 h [ng/ml]
Wynik badania próbki 1 d1S1 15,1 ???1 d1S2 2,7 Negatywny 2 d2S1 15,4 ???1 d2S2 15,4 ???1 3 d3S1 9,4 Negatywny d3S2 7,1 Negatywny 4 d4S1 8,7 Negatywny d4S2 7,6 Negatywny 5 d5S1 13,3 Negatywny d5S2 11,7 Negatywny 6 d6S1 18,3 ???1 d6S2 16,6 ???1 7 d7S1 64,3 Pozytywny d7S2 3,9 Negatywny 8 d8S1 6,2 Pozytywny d8S2 1,9 Negatywny 9 d9S1 105,4 Pozytywny d9S2 11,1 Negatywny 10 d10S1 13,5 Negatywny d10S2 6,8 Negatywny 11 d11S1 17,0 ???1 d11S2 11,7 Negatywny
1 – ??? – wynik w¹tpliwy (nieco mniejszy od „cut-off”)
„Cut-off” – graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania œliny wynosi 20 ng/ml 1 – ??? – questionable result (slightly lower than „cut-off”)
Wyniki powy¿ej wartoœci „cut-off” s¹ wynikami pozytywnymi, w przedziale pomiêdzy 15 ng/ml a 20 ng/ml s¹ wynikami w¹tpliwymi, a poni¿ej wartoœci 15 ng/ml s¹ wynikami negatywnymi.
Kryteria walidacji dla tej metody zilustrowano w tabeli 5.
S1>S2, 1,263 > 0,597 S2>S3, 0,597 > 0,199 S3>S4, 0,199 > 0,060
Osoba d11 bra³a tylko udzia³ w badaniu œliny. Na podstawie parametrów zosta³a wykreœlona krzywa zale¿noœci absorbancji od stê¿enia morfiny (ryc. 7).
Badania instrumentalne próbek moczu i śliny
Próbki moczu i œliny z wynikami pozytywnymi, tj. d1M, d2M, d5M, d9M oraz d1S1, d2S1, d6S1, d7S1, d9S1, d11S1, d2S2 i d6S2 zosta³y poddane chemicz-nym badaniom instrumentalchemicz-nym metod¹ chromatogra-fii gazowej sprzê¿onej ze spektrometri¹ masow¹ na urz¹dzeniu GC/MS QP-5050 firmy Shimadzu, zgod-nie z ustalon¹ w CLK KGP metodyk¹ do wykrywania opiatów i oznaczania morfiny i kodeiny. Badania prze-prowadzono w nastêpuj¹cych warunkach analitycz-nych:
– kolumna HP-5MS, d³ugoœæ 15 m, œrednica we-wnêtrzna 0,25 mm, gruboœæ filmu 0,25 μm, prze-p³yw – 1,8 ml/min,
– program temperaturowy: izoterma 100oC – 2 min, przyrost 24oC/min do 280oC, izoterma 280oC – 3,5 min,
– dozownik – temp. 250oC, nastrzyk: 1 μl, tempera-tura linii transferowej: 280oC.
Monitorowane jony wyszczególniono w tabeli 6.
W wyniku przeprowadzonych badañ stwierdzono w próbkach moczu d1M, d2M, d5M, d9M obecnoœæ morfiny oraz kodeiny (tab. 7).
Chromatogramy próbki moczu d1M i jej widmo masowe przedstawiono na rycinach 8 i 9.
W próbkach œliny d1S1, d2S1, d6S1, d11S1 oraz d2S2, d6S2 stwierdzono obecnoœæ morfiny na poziomie „œlepej próby”, a w próbce d7S1 œladow¹ iloœæ kodeiny oraz morfiny. Próbki d9S1, ze wzglêdu na bardzo ma³¹ iloœæ badanego materia³u, nie poddano badaniom potwierdzaj¹cym (tab. 8).
Wynik Stê¿enie opiatów [ng/ml] Absorbancja S1 0,000 1,263 S2 10,000 0,597 S3 100,000 0,199 S4 500,000 0,060 Nr próbki Zawartoœæ iloœciowa morfiny [ng/ml] Zawartoœæ iloœciowa kodeiny [ng/ml] d1M 786 131 d2M 274 53 d5M 251 32 d9M 300 56
Lp. Nazwa Widmo masowe [m/z] 1 kodeina 178, 196, 371 2 kodeina D3 181, 199, 374 3 morfina 401, 414, 429 4 morfina D3 404, 417, 432 5 6-MAM 287, 340, 399 6 6-MAM D3 290, 343, 402 Tabela 5 Tabela 6 Tabela 7 Stê¿enie kodeiny i morfiny w próbkach moczu Concentration of codeine and morphine in urine samples
Ryc. 7. Wykres zale¿noœci absorbancji od stê¿enia morfiny Fig. 7. Relationship between absorbance and morphine concentration
Oznaczanie morfiny obecnej w moczu i w œlinie po spo¿yciu dro¿d¿ówek z makiem – eksperyment III (z u¿yciem testu IsoTech oraz SmartClip)
W eksperymencie wzi¹³ udzia³ ochotnik, któremu podano dwa kawa³ki makowca kupione w przypadko-wej cukierni oraz dro¿d¿ówkê z makiem pochodz¹c¹ z tego samego Ÿród³a, co dro¿d¿ówki spo¿ywane przez ochotników w dwóch wczeœniejszych eksperymentach. Celem eksperymentu by³o zbadanie, czy wystêpuj¹ ró¿nice w obecnoœci morfiny w cukierniczych wyrobach spo¿ywczych zawieraj¹cych mak, pochodz¹cych z ró¿-nych Ÿróde³. Aby to stwierdziæ, wykorzystano test im-munologiczny do wykrywania morfiny w moczu o stê-¿eniu powy¿ej 300 ng/ml – Morfina-TEST IsoTech.
Przed przyst¹pieniem do badañ, czyli zanim ochot-nik zjad³ ciastka, wykonano tzw. œlep¹ próbê – pobrano od niego próbkê moczu i zbadano za pomoc¹ testu – wynik by³ negatywny. Nastêpnie ochotnik zjad³
ciast-ko. Próbki moczu, które poddawano badaniu, pobierano od niego co godzinê. Wyniki bada-nia zestawiono w tabeli 9.
Po tygodniu podjêto eksperyment i podano ochotni-kowi dro¿d¿ówkê z makiem pochodz¹c¹ ze wspomnia-nej ju¿ piekarni. Jednoczeœnie pobierano od niego do badañ próbki œliny – równie¿ co godzinê od chwili zjedzenia ciastka. Nastêpnie próbki œliny poddano ba-daniu za pomoc¹ testów œlinowych SmartClip firmy Envitec. Wyniki przedstawiono w tabelach 10 i 11.
Ryc. 8. Chromatogram próbki moczu d1M Fig. 8. d1M urine sample chromatogram
Ryc. 9. Widmo masowe próbki moczu d1M Fig. 9. Mass spectrum of d1M urine sample
Nr próbki Zawartoœæ iloœciowa morfiny [ng/ml] Zawartoœæ iloœciowa kodeiny [ng/ml] d7S1 14 6 Tabela 8 Stê¿enie kodeiny i morfiny w próbce œliny d7S1 Concentration of codeine and morphine in d7S1 saliva sample
Lp. Czas badania moczu od spo¿ycia ciastka [h] Wynik testu
1 „œlepa próba” ujemny 2 0,5 ujemny 3 1 ujemny 4 2 dodatni 5 3 dodatni 6 4 dodatni 7 5 ujemny 8 6 ujemny Tabela 9 Zestawienie wyników badania moczu po zjedzeniu
przez ochotnika dwóch kawa³ków makowca Collation of results (urine) after consumption
of two pieces of poppy seeds cake
Lp.
Czas badania moczu od spo¿ycia ciastka
[h]
Wynik testu
1 „œlepa próba” ujemny
2 1 ujemny 3 2 dodatni 4 3 dodatni 5 4 dodatni 6 5 dodatni 7 6 dodatni 8 22 ujemny Tabela 10 Zestawienie wyników badania moczu po zjedzeniu
przez ochotnika dro¿d¿ówki z makiem Collation of results (urine) after consumption
Oznaczanie morfiny obecnej w moczu
i w ślinie metodą immunoenzymatyczną
na automatycznym analizatorze EVOLIS
W celu sprawdzenia powtarzalnoœci wyników po ko-lejnym tygodniu podano ochotnikowi dro¿d¿ówkê z ma-kiem (z tej samej co wczeœniej piekarni). Nastêpnie
po up³ywie okreœlonego przedzia³u czasu pobierano od niego próbki moczu oraz œliny, które nastêpnie pod-dano badaniom metod¹ immunoenzymatyczn¹ na au-tomatycznym analizatorze EVOLIS firmy Bio-Rad z wy-korzystaniem firmowych zestawów odczynników na opiaty.
Mocz zbadano jednoczeœnie za pomoc¹ testu Iso-Tech. Wyniki badania ukazuj¹ tabele 12 i 13 oraz ryci-na 10.
Wyniki powy¿ej wartoœci „cut-off” s¹ wynikami pozy-tywnymi, w przedziale pomiêdzy 150 ng/ml a 200 ng/ml w¹tpliwymi, zaœ poni¿ej wartoœci 150 ng/ml negatywny-mi.
Tabela 11 Zestawienie wyników badania œliny po zjedzeniu
przez ochotnika dro¿d¿ówki z makiem Collation of results (saliva) after consumption
of poppy seeds cookie
Lp.
Czas badania œliny od spo¿ycia ciastka
[h]
Wynik testu 1 „œlepa próba” ujemny
2 1 dodatni 3 2 ujemny 4 3 ujemny 5 4 ujemny 6 5 ujemny 7 6 ujemny Lp. Nr próbki
Czas badania moczu od spo¿ycia ciastka [h] Uzyskane stê¿enie [ng/ml] Wynik
badania próbki Wynik testu IsoTech 1 dOM1 1 88,4 Negatywny ujemny 2 dOM2 2 911,6 Pozytywny dodatni 3 dOM3 3 748,5 Pozytywny dodatni 4 dOM4 4 436,2 Pozytywny dodatni 5 dOM5 5 96,0 Negatywny dodatni 6 dOM6 6 90,5 Negatywny dodatni 7 dOM7 7 85,2 Negatywny ujemny 8 dOM8 48 65,8 Negatywny ujemny
Tabela 12 Wyniki badañ próbek moczu
Results of urine sample analysis
Ryc. 10. Wykres zale¿noœci uzyskanego stê¿enia od czasu badania moczu
Fig. 10. Relationship between obtained concentration and time of urine sample analysis
„Cut-off” – graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania moczu wynosi 200 ng/ml „Cut-off” – treshold value of detection which separates positive and negative results, in case of opiates – amounts to 200 ng/ml for urine samples
Wyniki powy¿ej wartoœci „cut-off” s¹ wynikami pozy-tywnymi, w przedziale miêdzy 15 ng/ml a 20 ng/ml w¹t-pliwymi, zaœ poni¿ej wartoœci 15 ng/ml negatywnymi.
Oznaczanie morfiny
obecnej w moczu i w ślinie
za pomocą badań instrumentalnych
Próbki moczu i œliny z wynikami pozytywnymi, tj. dOM2, dOM3, dOM4 oraz dOS1 i dOS2, zosta³y podda-ne badaniom instrumentalnym metod¹ chromatografii gazowej sprzê¿onej ze spektrometri¹ masow¹ na urz¹-dzeniu GC/MS QP-5050 firmy Shimadzu, zgodnie z ustalon¹ w CLK KGP metodyk¹ do wykrywania
opia-tów i oznaczania morfiny i kodeiny. W wyniku przepro-wadzonych badañ w próbkach moczu dOM2, dOM3, dOM4 stwierdzono obecnoœæ morfiny oraz kodeiny (tab. 14). W próbkach œliny dOS1 i dOS2 obecnoœæ mor-finy i kodeiny stwierdzono na poziomie „œlepej próby”.
Wszystkie próbki wskazane do powy¿szych badañ potwierdzaj¹cych wykaza³y obecnoœæ morfiny i kode-iny.
Tabela 13 Wyniki badañ próbek œliny
Results of saliva sample analysis
Lp. Nr próbki Czas badania œliny od spo¿ycia ciastka [h] Uzyskane stê¿enie [ng/ml] Wynik badania próbki 1 dOS1 1 25,8 Pozytywny 2 dOS2 2 16,2 ???1 3 dOS3 3 11,4 Negatywny 4 dOS4 4 10,5 Negatywny 5 dOS5 5 6,4 Negatywny 6 dOS6 6 3,8 Negatywny 7 dOS7 7 2,9 Negatywny
1 – ??? – wynik w¹tpliwy (nieco mniejszy od „cut-off”)
„Cut-off” – graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania œliny wynosi 20 ng/ml. 1 – ??? – questionable result (slightly lower than „cut-off”)
„Cut-off” – treshold value of detection which separates positive and negative results, in case of opiates – amounts to 20 ng/ml for saliva samples
Ryc. 11. Wykres zale¿noœci uzyskanego stê¿enia od czasu badania œliny Fig. 11. Relationship between obtained concentration and saliva analysis time Nr próbki Czas badania moczu od spo¿ycia ciastka [h] Zawartoœæ iloœciowa morfiny [ng/ml] Zawartoœæ iloœciowa kodeiny [ng/ml] dOM2 2 761 65 dOM3 3 490 39 dOM4 4 376 34 dOM16 16 119 18 Tabela 14 Stê¿enie kodeiny i morfiny w próbkach moczu Concentration of codeine and morphine in urine samples
Ryc. 12. Wykres zale¿noœci uzyskanego stê¿enia morfiny i kodeiny od czasu badania moczu
Fig. 12. Relationship between obtained codeine and morphine concentration and urine analysis time
Ryc. 13. Chromatogram próbki moczu dOM3 Fig. 13. dOM3 urine sample chromatogram
Oznaczanie morfiny obecnej w maku
pochodzącym z różnych źródeł
W celu zbadania, czy w maku dostêpnym w handlu detalicznym mo¿na stwierdziæ obecnoœæ morfiny, a je-œli tak, to w jakim stê¿eniu, kupiono mak pochodz¹cy z ró¿nych Ÿróde³:
– M1 i M2: kupiony na wagê na bazarze i w hali targowej,
– M3: mak niebieski paczkowany firmy WIKPOL z Piotrkowa Trybunalskiego.
Wszystkie trzy próbki maku poddano badaniom za pomoc¹ mikroskopu steroskopowego firmy OLYM-PUS SZX12, stosuj¹c dziesiêciokrotne powiêkszenie.
W próbkach maku M1 i M3 stwierdzono obecnoœæ domieszek s³omy makowej (ryc. 15–16).
W próbce maku M2 nie znaleziono domieszek s³o-my makowej (ryc. 17).
Ze wszystkich trzech próbek pobrano nawa¿ki po 15 g, po czym ka¿d¹ zalano 50 ml gor¹cej wody. Po dekantacji otrzymano oko³o 5 ml roztworu do analizy i dodano standardy wewnêtrzne: morfiny-D3, kodeiny--D3 i 6-MAMkodeiny--D3, 4 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 6 i ekstrahowano na kolumienkach Bond Eluit Certify zgodnie z metodyk¹.
Tak przygotowane próbki maku zosta³y poddane chemicznym badaniom instrumentalnym metod¹ chro-matografii gazowej sprzê¿onej ze spektrometri¹ maso-w¹ na urz¹dzeniu GC/MS QP-5050 firmy Shimadzu, zgodnie z ustalon¹ w CLK KGP metodyk¹ do wykrywa-nia opiatów i oznaczawykrywa-nia morfiny i kodeiny. Wyniki ba-dañ ukazuje tabela 15.
Z próbek maku M1, M2 i M3 oraz masy makowej po-branej z dro¿d¿ówki z piekarni warszawskiej (M1PL) oraz z ciastka makowego (M2CM) pobrano próbki po oko³o 400 mg i ka¿d¹ z nich ekstrahowano:
Ryc. 14. Widmo masowe próbki moczu dOM3 Fig. 14. Mass spectrum of dOM3 urine sample
Ryc. 15. Próbka maku M1 Fig. 15. M1 poppy seed sample
Ryc. 16. Próbka maku M3 Fig. 16. M3 poppy seed sample
Ryc. 17. Próbka maku M2 Fig. 17. M2 poppy seed sample
Nr próbki Zawartoœæ iloœciowa morfiny w 15 g nawa¿ki [ng] Zawartoœæ iloœciowa morfiny w 1 g [ng] Zawartoœæ iloœciowa kodeiny w 15 g nawa¿ki [ng] Zawartoœæ iloœciowa kodeiny w 1 g [ng] M1 2669 178 369 25 M2 2520 168 404 27 M3 69 5 16 1 Tabela 15 Stê¿enie kodeiny i morfiny w próbkach maku Concentration of codeine and morphine in poppy seed samples
– 40 ml metanolu (5 cykli): M1, M2, M3, M1PL, M2CM),
– 40 ml wody destylowanej (6 cykli): M1W, M2W, M3W, M1PLW, M2CMW,
z u¿yciem sterowanego automatycznie ekstraktora firmy IKA Werke.
1. Badania metod¹ chromatografii cieczowej Otrzymane ekstrakty analizowano na chromatogra-fie cieczowym firmy Shimadzu HPLC10Avp z automa-tycznym podajnikiem próbek w nastêpuj¹cych warun-kach:
– kolumna LiChrospherTM5μ, 60 RP-select B, 4 mm
na 125 mm,
– eluent: A: woda: kwas fosforowy (1000:0,1), B: acetonitryl, w gradiencie stê¿enia: od 10%B, w 5 min – 35%B, od 6 do 10 min – 80%B, w 11 min – 10%B, od 11 do 22 min – 10%B,
– przep³yw 1,0 ml/min, – czas analizy 22 min, – temp. 30oC,
– detektor DAD, UV λ = 210 nm.
W wyniku przeprowadzonych badañ w opisanych warunkach w analizowanych próbkach nie stwierdzono obecnoœci morfiny w iloœci >0,01%. Dla czasu retencji morfiny w tych próbkach by³o porównywalne widmo ab-sorpcji promieniowania z widmem bibliotecznym morfi-ny. OdpowiedŸ detektora by³a rejestrowana, ale nie mo¿na by³o tych widm porównaæ. Nie mo¿na by³o
jed-noznacznie stwierdziæ, czy by³ to szum, czy pik zwi¹z-ku.
2. Badania metod¹ chromatografii gazowej sprzê¿o-nej ze spektrometri¹ masow¹ (GC/MS)
Z próbek M2, M2CM, M1PL oraz M2W pobrano po 2 ml ekstraktu, odparowano do sucha w strumieniu azotu, a nastêpnie poddano derywatyzacji (200 μl BSA i 1 ml acetonitrylu ogrzewano w temp. 70oC przez 30 minut) i analizowano na chromatografie gazowym GC/MS HP-6890 (+)/MSD-5973 firmy Hewlett Packard.
Badania przeprowadzono w nastêpuj¹cych warun-kach analitycznych i z wykorzystaniem sprzêtu:
– kolumna HP-5: d³ugoœæ – 30 m, œrednica we-wnêtrzna – 0,25 mm, gruboœæ filmu – 0,25 μm, przep³yw – 1,7 ml/min,
– program temperaturowy: izoterma 100oC – 0,5 min; przyrost 15oC/min do 290oC, izoterma 290oC – 2 min, czas ca³kowity – 15,17 min,
– dozownik: split 1:80, temp. – 250oC, nastrzyk – 1–2 μl, solvent delay – 2 min, temperatura linii transferowej – 300oC,
– skanowanie: 41–550 m/z.
Nie uzyskano jednoznacznych wyników. Otrzymane na chromatogramie piki nie wskazuj¹ jednoznacznie na obecnoœæ morfiny w badanych próbkach. Powodem s¹ zbyt ma³e nawa¿ki przygotowanych próbek do ana-lizy lub niew³aœciwy dobór warunków analitycznych.
Dyskusja
W Polsce, zgodnie z Ustaw¹ o ruchu drogowym, obowi¹zuje bezwzglêdny zakaz prowadzenia pojaz-dów mechanicznych pod wp³ywem „œrodków dzia³aj¹-cych podobnie do alkoholu” (zasada „zero tolerancji”). Rozporz¹dzenie Ministra Zdrowia z dnia 11 czerw-ca 2003 r. (nowelizacja 2004 r.) wskazuje na koniecz-noœæ wykonywania badañ na obeckoniecz-noœæ wymienionych w rozporz¹dzeniu, nastêpuj¹cych œrodków dzia³aj¹-cych podobnie do alkoholu:
– opiaty,
– amfetamina i jej analogi, – kokaina,
– tetrahydrokannabinole, – benzodiazepiny.
Dopuszcza siê badania œliny (metod¹ nielaborato-ryjn¹ wykorzystuj¹c¹ jednorazowe testy immunoche-miczne), krwi i moczu (metoda laboratoryjna).
W przypadku wykrywania opiatów w materiale biolo-gicznym substancj¹ oznaczan¹ jest g³ównie morfina, kodeina i glukuronidy morfiny. Praktycznie nie da siê oznaczyæ heroiny ani 6-O-monoacetylomorfiny, gdy¿
Ryc. 18. Chromatogram nawa¿ki maku – próbki M2 Fig. 18. Chromatogram of poppy seed analytical sample – M2
Ryc. 19. Widmo masowe nawa¿ki maku – próbki M2 Fig. 19. Mass spectrum of poppy seed analytical sample – M2
ich okres po³owicznego rozk³adu jest bardzo krótki: dla heroiny wynosi 9 minut, a dla 6-O-monoacetylomorfi-ny 38 minut. Ujawnienie obecnoœci morfi6-O-monoacetylomorfi-ny i kodei6-O-monoacetylomorfi-ny w materiale biologicznym, zgodnie z zasad¹ „zero tole-rancji”, mo¿e poci¹gaæ za sob¹ dalsze czynnoœci praw-ne wobec badapraw-nego kierowcy, w tym mo¿liwoœæ oskar-¿enia o przestêpstwo z artyku³u 178a k.k., w przypad-ku stwierdzenia morfiny we krwi.
Z przeprowadzonych badañ wynika, ¿e obecnoœæ morfiny i kodeiny w organizmie nie musi byæ skutkiem za¿ywania tylko narkotyków opiatowych.
Od 12 ochotników nieza¿ywaj¹cych narkotyków po-brano próbki œliny i moczu. U piêciu osób stwierdzono pozytywne wyniki wstêpnych badañ immunologicznych na zawartoœæ opiatów po zjedzeniu ciastka z makiem. Wyniki w badanych próbkach moczu potwierdzi³y siê w trzech przypadkach i waha³y siê w granicach od 436 ng/m (dOM4) do 965 ng/ml (d1M). W próbkach œli-ny pozytywne wyniki potwierdzi³y siê równie¿ u trzech osób i waha³y siê w granicach od 25 ng/ml (dOS1) do 105 ng/ml (d7S1).
Próbki w badaniach potwierdzaj¹cych metod¹ GC-MS wykaza³y obecnoœæ morfiny i kodeiny, których iloœciowa zawartoœæ waha³a siê w granicach od 119 ng/ml do 786 ng/ml w przypadku morfiny i od 18 ng/ml do 131 ng/ml dla kodeiny.
Wyniki powy¿szych badañ potwierdzaj¹ istnienie problemu poruszonego w raporcie opracowanym przez Instytut Psychiatrii i Neurologii w biuletynie „Alkoholizm i Narkomania” [3] i wskazuj¹ na potrzebê wykonania przez w³aœciwe instytucje naukowo-badawcze dal-szych badañ na obecnoœæ morfiny: nie tylko w moczu i œlinie, lecz tak¿e – a raczej przede wszystkim – we krwi.
W powy¿szej pracy przeprowadzono równie¿ bada-nia próbek maku pochodz¹cych z trzech Ÿróde³:
– supermarketu (w oryginalnym opakowaniu, z ety-kiet¹ producenta),
– hali handlowej (bez opisu i charakterystyki produ-centa),
– bazaru (bez opisu i charakterystyki producenta), tj. prawdopodobnie z prywatnej uprawy.
Spo¿ywanie maku w Polsce w postaci cukierniczych wyrobów (makowce, torty makowe, dro¿d¿ówki z ma-kiem) jest bardzo popularne i czêsto wi¹¿e siê z trady-cjami œwi¹tecznymi. Uprawê maku w Polsce reguluj¹ przepisy Ustawy o przeciwdzia³aniu narkomanii (Usta-wa z dnia 29 lipca 2005 r).
Uprawa maku wysokomorfinowego mo¿e byæ pro-wadzona wy³¹cznie na potrzeby przemys³u farmaceu-tycznego i nasiennictwa, zaœ maku niskomorfinowego dla celów spo¿ywczych i nasiennictwa.
Makiem niskomorfinowym okreœla siê roœlinê z ga-tunku mak lekarski nale¿¹c¹ do odmiany, w której
za-wartoœæ morfiny w torebce (makówce) bez nasion, wraz z przylegaj¹c¹ do niej ³odyg¹ o d³ugoœci do 7 cm, wynosi poni¿ej 0,06% w przeliczeniu na zasadê morfi-ny i na such¹ masê wymieniomorfi-nych czêœci roœlimorfi-ny.
Istnieje ogólne przekonanie, ¿e dojrza³e nasiona maku przeznaczone do celów spo¿ywczych nie powin-ny zawieraæ morfipowin-ny. W ramach pracy wykonano bada-nia na obecnoœæ morfiny trzech próbek maku spo¿yw-czego, kupionych w ró¿nych miejscach handlowych. Próbki te wykaza³y obecnoœæ morfiny w iloœci od 5 ng do 178 ng w przeliczeniu na 1 gram nasion.
Mo¿na przypuszczaæ, ¿e morfina jest obecna w dro-binach pochodz¹cych z torebek makowych (elementy s³omy makowej), które znajduj¹ siê miêdzy nasionami maku, a które wykazano na zamieszczonych w pracy zdjêciach z oglêdzin mikroskopowych. W zale¿noœci od iloœci tych drobin mo¿e jej byæ wiêcej lub mniej.
Wnioski
1. Wykrycie morfiny w p³ynach ustrojowych mo¿e wskazywaæ nie tylko na spo¿ycie narkotyków opiato-wych, lecz tak¿e na konsumpcjê cukierniczych produk-tów spo¿ywczych zawieraj¹cych mak.
2. Problem wykrywania morfiny w moczu po spo¿y-ciu ciastka z makiem, poruszony w raporcie opracowa-nym przez Instytut Psychiatrii i Neurologii w biuletynie „Alkoholizm i Narkomania” (2006), potwierdzi³ siê w wynikach badañ powy¿szej pracy i wymaga udoku-mentowania po przeprowadzeniu dalszych badañ.
3. Problem jest otwarty i stanowi podstawê do dys-kusji.
ryciny: 1, 2, 4 – Internet; 3 [6], 5 [4], 6–19 – autorka; tabele: 1 [1], 2–15 – autorka
BIBLIOGRAFIA
1. Mak, Zd HAr Borowo, IHAR Poznañ 2000.
2. Ustawa z dnia 29 lipca 2005 roku o przeciwdzia³aniu narkomanii (Dz.U. Nr 179, poz. 1485) wraz z nowelizacj¹ z dnia 7 grudnia 2006 r. (Dz.U. Nr 7, poz. 48 i 49).
3. „Alkoholizm i Narkomania” 2006, t. 19, nr 2, s. 207–210. 4. Toksykologia wspó³czesna pod red. Witolda Señczuka, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2006.
5. Ka³a M.: Analiza toksykologiczna œrodków uzale¿niaj¹-cych, Wyd. IES, Kraków 2000.
6. Szukalski B.: Metody analizy œrodków uzale¿niaj¹cych, Wyd. Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa 1997.
7. Krawczyk W.: Chromatografia gazowa w kryminalisty-ce, Wydawnictwo CLK KGP, Warszawa 1999.
8. Szukalski B.: Prowadzenie pojazdów pod wp³ywem narkotyków – nowe zagro¿enie, „Problemy Kryminalisty-ki” 2006, nr 252, s. 5.
