Novel methods in diagnostic and therapy<br>Cardiac navigation system NOGA

(1)

System do nawigacji wewn¹trzsercowej NOGA

Cardiac navigation system NOGA

£ukasz A. Ma³ek, Maciej D¹browski, Krzysztof Kuku³a, Zbigniew Chmielak, Adam Witkowski, Lidia Chojnowska, Witold Ru¿y³³o

I Klinika Choroby Wieñcowej, Instytut Kardiologii, Warszawa

Postêpy w Kardiologii Interwencyjnej 2007; 3, 1 (7): 29-37

AAddrreess ddoo kkoorreessppoonnddeennccjjii//CCoorrrreessppoonnddiinngg aauutthhoorr:: lek. £ukasz A. Ma³ek, I Klinika Choroby Wieñcowej, Instytut Kardiologii, ul. Alpejska 42, 04-628 Warszawa, tel. +48 22 343 42 67, faks +48 22 613 38 19, e-mail: lmalek@ikard.pl

S

S³³oowwaa kklluucczzoowwee:: choroba wieñcowa, diagnostyka inwazyjna, badania obrazowe, terapia genowa, komórki macierzyste

K

Keeyy wwoorrddss:: coronary artery disease, invasive diagnostics, image studies, gene therapy, stem cells

W Wssttêêpp

System NOGA jest narzêdziem wykorzystywanym do mapowania wewn¹trzsercowego w czasie rzeczywistym. Uzyskane informacje umo¿liwiaj¹ ocenê ¿ywotno- œci poszczególnych obszarów miêœnia sercowego oraz s¹ przydatne w procesie terapeutycznym ukierunkowa- nym na poprawê perfuzji niedokrwionych obszarów. Sys- tem NOGA jest stosowany w nowych formach leczenia, jakimi s¹ terapia genowa i implantacja komórek macierzystych. Szczególn¹ grup¹ chorych, którzy mog¹ od- nieœæ korzyœci z tych form terapii, jest rosn¹ca populacja pacjentów niekwalifikuj¹cych siê do klasycznych zabie- gów rewaskularyzacji przezskórnej lub kardiochirurgicz- nej ze wzglêdu na rozleg³oœæ choroby wieñcowej (tzw.

pacjenci no-option). W niniejszym artykule przedstawio- no podstawowe zasady dzia³ania systemu NOGA oraz jego nowej wersji – NOGA XP. Omówione zostan¹ tak-

¿e badania poœwiêcone zagadnieniu angio- i miogenezy wykorzystuj¹ce system NOGA oraz perspektywy zastosowania urz¹dzenia w przysz³oœci.

ZZaassaaddaa ddzziiaa³³aanniiaa ssyysstteem muu N NO OG GAA

System do elektromechanicznego, trójwymiarowego mapowania serca NOGA zosta³ stworzony równolegle z elektrofizjologicznym systemem CARTO (Biosense Webster, Diamond Bar, CA), z za³o¿eniem wykorzystania go w kardiologii inwazyjnej w celach diagnostycznych i te- rapeutycznych w obrêbie lewej komory (ang. left ventricle

– LV) [1]. Zasada dzia³ania urz¹dzenia opiera siê na wpro- wadzeniu do LV, drog¹ nak³ucia têtnicy obwodowej, cewnika diagnostycznego lub terapeutycznego. Precyzyjna lokalizacja przestrzenna koñcówki cewnika (elektrody) w komorze jest mo¿liwa dziêki wykorzystaniu ultraniskie- go pola magnetycznego (10^–5–10^–6T) i trzech punktów odniesienia, w stosunku do których odbywaj¹ siê ruchy elektrody. System umo¿liwia tworzenie map elektrome- chanicznych LV, dostarczaj¹cych informacji o miejscowej wewn¹trzsercowej aktywnoœci elektrycznej rejestrowanej w uk³adzie jedno- lub dwubiegunowym (ang. unipolar vol- tage – UV, bipolar voltage – BV), miejscowej kurczliwoœci liniowej miêœnia sercowego (ang. local linear shortening – LLS) oraz miejscowym czasie aktywacji elektrycznej (ang. local activation time – LAT). Powy¿sze parametry pozwalaj¹ na okreœlenie ¿ywotnoœci danego obszaru miêœnia sercowego oraz jego kurczliwoœci, a tak¿e se- kwencji aktywacji poszczególnych segmentów. W trakcie tworzenia mapy poszczególne wartoœci (UV, LLS, LAT) kodowane s¹ za pomoc¹ skali kolorów i nak³adane na trój- wymiarow¹ rekonstrukcjê LV (ryc. 1.).

Dziêki du¿ej dok³adnoœci systemu mo¿liwe jest zbie- ranie danych z punktów oddalonych od siebie o 1 mm w czasie rzeczywistym i bez wykorzystania skopii rentgenowskiej. Podstaw¹ uzyskania wiarygodnej mapy elektroanatomicznej jest zebranie odpowiedniej liczby punk- tów przy prawid³owym ustawieniu cewnika diagnostycznego. Pierwsze punkty nale¿y zarejestrowaæ pod kontro- l¹ skopii rentgenowskiej (z koniuszka, drogi nap³ywu

(2)

oraz z drogi odp³ywu LV). Kolejne punkty uzyskuje siê ju¿

tylko przy u¿yciu systemu NOGA. Prawid³owa mapa powinna zawieraæ minimum 3 punkty zebrane z ka¿dego segmentu miêœniówki LV. Weryfikacjê prawid³owego po³o-

¿enia elektrody zapewnia jednoczesna analiza nastêpuj¹- cych parametrów: stabilnoœci lokalizacji elektrody (ang.

location stability – Loc), stabilnoœci lokalnego czasu akty-

wacji (LAT), który powinien byæ jednakowy w kolejnych cy- klach pracy serca, oraz stabilnoœci d³ugoœci cyklu pracy serca (ang. cycle length stability – CL), który umo¿liwia okreœlenie, czy poprzez z³e przy³o¿enie elektrody nie po- wodujemy zmian w rytmie prowadz¹cym (ryc. 2.) [2].

Dodatkowym parametrem jest stabilnoœæ pêtli (ang.

loop stability – LS), któr¹ elektroda zatacza w czasie trwania RRyycc.. 11.. Mapa lewej komory uzyskana za pomoc¹ systemu NOGA. AA, BB – mapa miejscowej aktywnoœci elektrycznej (ang. unipolar voltage – UV); CC, DD – mapa miejscowej kurczliwoœci liniowej (ang. local linear shortening – LLS); AA, CC – projekcje prawe przednie skoœne (RAO); BB, DD – obraz typu bullseye. Wartoœci dla poszczególnych punktów kodowane kolorem. Przypodstawna czêœæ przegrody miêdzykomorowej ma charakter miêœnia hibernowanego – zachowana UV przy znacznie obni¿onej LLS (szczegó³y w tekœcie)

FFiigg.. 11.. Map of the left ventricle obtained using the NOGA system. AA, BB – map of local electrical activity (unipolar voltage – UV); CC, DD – map of local linear shortening (LLS); AA, CC – right anterior oblique view (RAO); BB, DD – bullseye view. Values of UV and LLS are colour coded. Basal part of the interventricular septum is a hibernated myocardium – maintained UV with markedly reduced LLS (see text for details)

AA CC

BB D D

(3)

jednego cyklu pracy serca. Stabilnoœæ ta pozwala na oce- nê stabilizacji elektrody wzglêdem wsierdzia i jest wa¿nym elementem przy wstrzykniêciach endomiokardialnych.

W warunkach optymalnych koñcówka cewnika, porusza- j¹c siê w przestrzeni wraz z kurcz¹cym siê miêœniem, powinna tworzyæ w czasie trwania jednego cyklu pracy serca pe³n¹, zamkniêt¹ pêtlê. Jeœli droga elektrody nie jest zamkniêta i przybiera kszta³t krzywej, oznacza to, ¿e koñ- cówka cewnika zmienia swoje po³o¿enie w czasie cyklu pracy serca. Po zakoñczeniu akwizycji punktów nale¿y uruchomiæ proces automatycznej filtracji mapy. W procesie tym, przy wykorzystaniu analizy parametrów stabilno- œci, zostaj¹ automatycznie usuniête niew³aœciwie zebrane punkty, takie jak punkty wewnêtrzne (mog¹ce odpowia- daæ miêœniom brodawkowatym, a nie miêœniówce œciany komory), oraz takie, które znacznie zmieniaj¹ kszta³t mapy (np. zebrane na dodatkowym pobudzeniu komoro- wym zamiast na rytmie zatokowym).

ZZaassttoossoow waanniiee ssyysstteem muu N NO OG GAA Zastosowanie diagnostyczne

Zastosowanie systemu NOGA opiera siê na mo¿li- woœci precyzyjnego okreœlenia ¿ywotnoœci miêœniówki LV oraz identyfikacji tak zwanych obszarów hibernowanego miêœnia sercowego. Miêsieñ hibernowany jest form¹ przed³u¿onej w czasie dysfunkcji LV serca wywo³anej przewlek³ym niedokrwieniem. Funkcja takiego obszaru mo¿e powróciæ do normy w wyniku przywrócenia ukrwienia [3]. Miêsieñ hibernowany charakteryzuje siê w mapowaniu elektromechanicznym zachowan¹ miej- scow¹ aktywnoœci¹ elektryczn¹ przy obni¿onej miejscowej kurczliwoœci liniowej. Dane na temat lokalizacji ob- szarów miêœnia hibernowanego mo¿na tak¿e uzyskaæ, wykonuj¹c nieinwazyjne badania obrazowe, takie jak komputerowa emisyjna tomografia pojedynczego fotonu (ang. single proton emission computerized tomography – SPECT) czy pozytronowa tomografia emisyjna (ang.

positron emission tomography – PET). Zalet¹ systemu NOGA jest jednak mo¿liwoœæ jednoczesnego wykonania koronarografii oraz oceny wystêpowania obszarów hibernowanego miêœnia sercowego i przeprowadzenie leczenia inwazyjnego. Istotnymi przeciwwskazaniami do stosowania systemu NOGA s¹: obecnoœæ skrzepliny w sercu, masywne zwapnienia zastawki aortalnej oraz têtniak LV. Wiele publikacji poœwiêcono porównaniu informacji uzyskiwanych ze wspomnianych badañ obrazowych z danymi uzyskanymi za pomoc¹ systemu NOGA.

Zosta³y one podsumowane w tab. 1.

W badaniach tych funkcjê miêœnia sercowego klasy- fikowano jako prawid³ow¹ lub upoœledzon¹, któr¹ dalej dzielono na segmenty miêœniówki ¿ywotnej oraz mar- twej. Nale¿y podkreœliæ, ¿e termin „¿ywotny” nie powinien byæ stosowany wymiennie z okreœleniem „hibernowany”. Miêsieñ hibernowany to obszar ¿ywotny, którego

funkcja ulega poprawie po przywróceniu prawid³owego ukrwienia danego obszaru.

Pierwsze z przeprowadzonych badañ dotyczy³y porów- nania danych z mapowania wewn¹trzsercowego z analiz¹ perfuzji w badaniu SPECT. W tym wypadku za ¿ywotny miê- sieñ uznawano segmenty charakteryzuj¹ce siê odwracalnym ubytkiem perfuzji w badaniu SPECT. Z wyj¹tkiem po- jedynczych doniesieñ okaza³o siê, ¿e obszary miêœnia sercowego o prawid³owej funkcji nie ró¿ni¹ siê istotnie od ob- szarów ¿ywotnych pod wzglêdem uzyskanej w badaniu NOGA miejscowej aktywnoœci elektrycznej (UV) [4–6].

Uda³o siê natomiast dosyæ jednoznacznie ustaliæ punkt od- ciêcia UV dla obszarów martwych, czyli obszarów o trwa-

³ym ubytku perfuzji w badaniu SPECT, który zawiera³ siê w przedziale 5–6 mV. Kolejne badania opiera³y siê ju¿

na ³¹cznym porównaniu danych z badañ SPECT i PET z analiz¹ za pomoc¹ systemu NOGA [7–12]. Takie podej- œcie umo¿liwi³o pe³niejsz¹ analizê funkcji segmentów miê- œnia sercowego. Wœród obszarów o trwa³ym ubytku perfuzji w badaniu SPECT uda³o siê bowiem wyodrêbniæ segmenty o prawid³owym wychwycie znakowanej glukozy.

Za obszary martwe zaczêto uznawaæ segmenty o trwa³ym ubytku perfuzji i upoœledzonym wychwycie znakowanej glukozy. To hybrydowe podejœcie do sposobu okreœlania ¿y- wotnego miêœnia sercowego zosta³o potwierdzone mapo- waniem wewn¹trzsercowym i umo¿liwi³o jednoznaczne od- ró¿nienie segmentów o prawid³owej funkcji od segmentów

¿ywotnych i martwych za pomoc¹ pomiarów UV systemem NOGA. Punkt odciêcia dla rozpoznawania ¿ywotnego miêœnia sercowego mieœci³ siê, w zale¿noœci od badania, w przedziale 6,9–7,4 mV.

RRyycc.. 22.. Weryfikacja stabilnoœci koñcówki cewnika. Zielone zabarwienie paska wskazuje na prawid³owe wartoœci poszczególnych parametrów

Location – stabilnoœæ lokalizacji elektrody (ang. location stability), CL – stabilnoœæ d³ugoœci cyklu pracy serca (ang. cycle length stability), LAT – stabilnoœæ miejscowego czasu aktywacji elektrycznej (ang. local activation time) FFiigg.. 22.. Electrode tip stability verification. Green colour of the bar signifies correct values of measured parameters

Location – location stability, CL – cycle length stability, LAT – local activation time stability (see text for details)

(4)

Du¿a grupa badañ wykorzystuj¹cych system NOGA dotyczy³a równie¿ monitorowania skutecznoœci rewaskularyzacji. Zagadnienie poprawy funkcjonalnej LV po rewaskularyzacji by³o jednym z za³o¿eñ pracy Kocha i wsp.

[9]. Autorzy pracy wykazali, ¿e poprawa miejscowej kurczliwoœci miêœnia LV po rewaskularyzacji dotyczy jedynie segmentów o wyjœciowej aktywnoœci elektrycznej wy- nosz¹cej >7,5 mV. W innym badaniu Gyöngyösi i wsp.

oceniali funkcjê LV za pomoc¹ SPECT i systemu NOGA przed oraz po œrednio 7 miesi¹cach od rewaskularyzacji w grupie 28 pacjentów ze stabiln¹ chorob¹ wieñcow¹.

Poprawê miejscowej kurczliwoœci œciany LV stwierdzono

u 9 pacjentów z tej grupy [13]. Na podstawie analizy danych z wyjœciowego mapowania elektroanatomicznego okreœlono, ¿e punkt odciêcia dla UV segmentów, których kurczliwoœæ uleg³a istotnej poprawie, wynosi³ 9,0 mV.

Wartoœæ ta wydaje siê potwierdzaæ spostrze¿enia wynika- j¹ce z kolejnej pracy Koch i wsp., w której autorzy zauwa-

¿yli, ¿e istotna poprawa funkcjonalna po rewaskularyzacji dotyczy jedynie obszarów miêœnia, w których zacho- wanej aktywnoœci elektrycznej towarzysz¹ zaburzenia kurczliwoœci (UV >9,0 mV przy LLS <6%) w przeciwieñ- stwie do obszarów, w których obie wartoœci by³y obni¿o- ne (UV <9,0 mV i LLS <6%) [14]. Potwierdza to teoriê TTaabbeellaa 11.. Porównanie systemu NOGA z nieinwazyjnymi badaniami obrazowymi

TTaabbllee 11.. Comparison of the NOGA system with noninvasive image studies B

Baaddaanniiee PPoorróówwnnyywwaannaa BBaaddaannaa ggrruuppaa KKrryytteerriiaa oocceennyy ww³³aaœœcciiwwooœœccii mmiiêêœœnniiaa zzaa ppoommoocc¹¹ ssyysstteemmuu NNOOGGAA m

meettooddaa

p

prraawwiidd³³oowwyy ¿¿yywwoottnnyy** mmaarrttwwyy****

Kornowski i wsp. [4] SPECT 18 pacjentów z CAD UV – 14,0±2,0 mV UV – 12,0±2,8 mV UV – 7,5±3,4 mV

(CCS III/IV) LLS – 12,5±2,8% LLS – 10,3±3,7% LLS – 3,4±3,4%

no-option LVEF ≥40%

Gyöngyösi i wsp. [5] SPECT 32 pacjentów z CAD UV – 12,0 mV UV – 6,4 mV

po przebytym MI (81% czu³oœæ (81% czu³oœæ

LVEF >30% i swoistoœæ) i swoistoœæ)

Fuchs i wsp. [6] SPECT 61 pacjentów z CAD UV – 12,3 mV UV ≥7,4 mV UV – 5,4 mV

(CCS II/IV) (90% czu³oœæ (czu³oœæ – 74%, (90% czu³oœæ

no-option i swoistoœæ) swoistoœæ – 68%) i swoistoœæ)

LVEF ≥30% LLS ≥5,0%

(czu³oœæ – 65%, swoistoœæ – 67%)

Bøtker i wsp. [7] 3D ECHO i PET 31 pacjentów z CAD UV >6,5 mV <68% UV segmentów

i okluzj¹ têtnicy (69% czu³oœæ i swoistoœæ) prawid³owych

LVEF <45% (74% czu³oœæ

i swoistoœæ)

Keck i wsp. [8] SPECT, PET 51 pacjentów z CAD UV – 11,2±5,0 mV UV – 7,25±2,7 mV UV – 5,0±3,1 mV

i 3D ECHO po przebytym MI LLS – 8,2±5,0%

Koch i wsp. [9] SPECT i PET 46 pacjentów z CAD UV – 11,0±3,6 mV UV >7,5 mV UV – 6,5±2,6 mV

po przebytym MI (77% czu³oœæ

i 75% swoistoœæ)

Graf i wsp. [10] SPECT i PET 21 pacjentów z CAD UV – 10,8±4,6 mV UV – 9,3±3,4 mV UV – 6,9±3,1 mV

LVEF ≥30%

Wiggers i wsp. [11] SPECT i PET 20 pacjentów UV >8,4 mV

z LVEF 29±6% (83% swoistoœæ)

Perin i wsp. [12] DE-MRI 15 pacjentów z CAD UV – 11,6±4,5 mV UV >6,9 mV

(93% czu³oœæ i 88% swoistoœæ)

3D ECHO – echokardiografia trójwymiarowa, CAD – choroba wieñcowa, CCS – klasa czynnoœciowa wg Kanadyjskiego Towarzystwa Sercowo-Naczyniowego, DE-MRI – magnetyczny rezonans j¹drowy póŸnego wzmocnienia, LLS – miejscowa kurczliwoœæ liniowa, LVEF – frakcja wyrzutowa lewej komory, MI – zawa³ serca, PET – pozytronowa tomografia emisyjna, SPECT – komputerowa emisyjna tomografia pojedynczego fotonu, UV – miejscowa aktywnoœæ elektryczna

* za ¿ywotny miêsieñ uznaje siê segmenty o odwracalnym ubytku perfuzji, jeœli stosowano jedynie badanie SPECT, lub zachowanym metabolizmie glukozy przy trwa³ym ubytku perfuzji, gdy stosowano jednoczeœnie SPECT i PET

** za martwy miêsieñ uznaje siê segmenty o trwa³ym ubytku perfuzji, jeœli stosowano jedynie badanie SPECT, lub trwa³ym ubytku perfuzji oraz upoœledzeniem wychwytu glukozy, gdy stosowano jednoczeœnie badania SPECT i PET

3D ECHO – three-dimensional echocardiography, CAD – coronary artery disease, CCS – Canadian Cardiovascular Society, DE-MRI – delayed enhancement magnetic resonance imaging, LLS – local linear shortening, LVEF – left ventricular ejection fraction, MI – myocardial infarction, PET – positron emission tomography, SPECT – single photon emission computerized tomography, UV – local electrical activity (unipolar voltage)

* viable segments are characterized by reversible perfusion defects in SPECT or maintained glucose absorption and irreversible perfusion defect when PET and SPECT were used together

** necrotic segments are characterized by irreversible perfusion defects in SPECT or reduced glucose absorption and irreversible perfusion defect when PET and SPECT were used together

(5)

miêœnia hibernowanego. Z kolei w badaniu Wiggersa i wsp. okaza³o siê, ¿e najwiêksz¹ zdolnoœæ w prognozo- waniu skutecznoœci rewaskularyzacji maj¹ dane uzyskane z badañ SPECT i PET jednoczeœnie, a nie system NOGA, co mo¿e mieæ dodatkowe znaczenie przy nieinwazyjnym charakterze tych badañ [11]. Z pewnoœci¹ kwestia przy- datnoœci systemu NOGA jako narzêdzia diagnostycznego bêdzie przedmiotem dalszych badañ i analiz, tak¿e pod k¹tem kosztów i efektywnoœci.

Zastosowanie terapeutyczne

Precyzyjne okreœlenie obszarów miêœnia ¿ywotnego nie tylko u³atwia podjêcie decyzji o klasycznej rewaskularyzacji têtnic zaopatruj¹cych ten obszar, ale pomaga tak-

¿e zlokalizowaæ rejon, który mo¿e byæ celem terapii genowej ukierunkowanej na angiogenezê lub miogenezê.

S³u¿y do tego cewnik do iniekcji transendokardialnych – MYOSTAR^®. Ig³a do iniekcji, w któr¹ cewnik jest wyposa-

¿ony, ma d³ugoœæ do 6 mm i pozwala na podanie 0,1–1,0 ml materia³u. W badaniach eksperymentalnych potwierdzono, ¿e ta droga podawania komórek w po- równaniu z podaniem dowieñcowym wi¹¿e siê z bardziej wydajnym dostarczeniem materia³u do miêœnia sercowego [15]. Poza opisanymi wczeœniej parametrami ocenia- j¹cymi stabilnoœæ elektrody istnieje wiele innych czynni- ków, które pozwalaj¹ na bezpieczne stosowanie tej metody terapeutycznej. Nale¿y do nich wykorzystanie informacji p³yn¹cych z mapy aktywacyjnej w celu unikniêcia podania materia³u do obszaru o najwczeœniejszej aktywacji elektrycznej, czyli do lewej odnogi pêczka Hisa. In- nym wa¿nym elementem jest dobra widocznoœæ koñców-

ki cewnika, która w momencie podania powinna byæ ustawiona prostopadle do œciany komory. Pozwala to na precyzyjne iniekcje, co jest szczególnie wa¿ne przy stosowaniu wektorów wirusowych. Kolejnymi czynni- kami s¹ tak¿e mo¿liwoœæ eliminacji nieadekwatnych punktów mapy oraz unikanie zbyt mocnego nacisku koñ- cówki cewnika na miêsieñ. Jest to weryfikowane stopniem uniesienia odcinka ST w zapisie jednobiegunowym z koñcówki elektrody umieszczonej na koñcu cewnika.

Penetracji ig³y do miêœnia serca powinno towarzyszyæ po- wstanie dodatkowego pobudzenia komorowego. Nie- zwykle wa¿ne wydaje siê tak¿e unikanie iniekcji w seg- mencie koniuszkowym, gdzie gruboœæ œciany jest naj- mniejsza. Na podstawie opublikowanych dotychczas ba- dañ wydaje siê, ¿e najkorzystniejsze jest wykonywanie wiêkszej liczby iniekcji o niewielkiej objêtoœci. Nie okre- œlono jednak odleg³oœci, w jakiej powinny byæ wykony- wane poszczególne wstrzykniêcia.

Technika iniekcji transendokardialnych zosta³a wyko- rzystana w wielu badaniach klinicznych dotycz¹cych angiogenezy oraz miogenezy (tab. 2. i 3.).

W pracach nad stymulacj¹ angiogenezy stosowano domiêœniowe iniekcje plazmidu koduj¹cego naczyniowo- -œródb³onkowy czynnik wzrostu (VEGF) do segmentów miêœnia hibernowanego [16–18]. Badania dotyczy³y pa- cjentów z ciê¿k¹ przewlek³¹ chorob¹ niedokrwienn¹ serca oporn¹ na leczenie zachowawcze i niekwalifikuj¹cych siê do zabiegów rewaskularyzacyjnych metodami trady- cyjnymi (tzw. no-option), z umiarkowanego stopnia nie- wydolnoœci¹ serca. Pierwsze badania kliniczne wykony- wane by³y na niewielkich grupach pacjentów i mia³y

TTaabbeellaa 22.. Badania kliniczne dotycz¹ce angiogenezy z wykorzystaniem systemu NOGA

TTaabbllee 22.. Randomized clinical trials on angiogenesis with the implementation of the NOGA system B

Baaddaanniiee CCzzyynnnniikk wwzzrroossttuu BBaaddaannaa ggrruuppaa CCzzaass oobbsseerrwwaaccjjii WWyynniikkii d

dzziiaa³³aanniiaa nniieeppoo¿¿¹¹ddaannee sskkuutteecczznnooœœææ

Vale i wsp. [16] nagi phVEGF-2 6 pacjentów z CAD 12 miesiêcy brak arytmii zmniejszenie objawów

(CCS III/IV) komorowych, cech i stosowania NTG;

no-option zawa³u oraz perforacji poprawa LLS i SPECT

LVEF >20% po 3 miesi¹cach

Losordo i wsp. [17] nagi phVEGF-2 19 pacjentów z CAD 3 miesi¹ce brak arytmii zmniejszenie objawów

(CCS III/IV) komorowych, cech

no-option zawa³u oraz perforacji

LVEF >20%

Kastrup i wsp. [18] nagi phVEGF-A165 80 pacjentów z CAD 6 miesiêcy 5 powik³añ zwi¹zanych poprawa LLS

(CCS III/IV) z zabiegiem (1 tamponada oraz w wentrykulografii;

no-option serca, 1 przejœciowe brak poprawy

LVEF >40% zaniewidzenie, 1 sepsa, globalnej czynnoœci

1 blok AV III stopnia, skurczowej, objawów,

1 STEMI) perfuzji

AV – przedsionkowo-komorowy, CAD – choroba wieñcowa, CCS – klasa czynnoœciowa wg Kanadyjskiego Towarzystwa Sercowo-Naczyniowego, LLS – miejscowa kurczliwoœæ liniowa, LVEF – frakcja wyrzutowa lewej komory, NTG – nitrogliceryna, phVEGF – plazmid koduj¹cy naczyniowo-œródb³onkowy czynnik wzrostu, SPECT – komputerowa emisyjna tomografia pojedynczego fotonu, STEMI – zawa³ serca z uniesieniem odcinka ST

AV – atrioventricular, CAD – coronary artery disease, CCS – Canadian Cardiovascular Society, LLS – local linear shortening, LVEF – left ventricular ejection fraction, NTG – nitroglycerin, phVEGF – plasmid encoding vascular endothelial growth factor, SPECT – single photon emission computerized tomography, STEMI – ST-elevation myocardial infarction

(6)

na celu g³ównie ocenê bezpieczeñstwa terapii (faza 1/2). W pracach tych udowodniono, ¿e podanie plazmidu do miêœnia LV metod¹ przezskórn¹ nie wi¹¿e siê ze zwiêkszonym ryzykiem wyst¹pienia zaburzeñ hemo- dynamicznych, z³oœliwych arytmii komorowych, wi- docznego w zapisie EKG zawa³u serca lub z perforacj¹ œciany komory w okresie oko³ozabiegowym i w obserwacji odleg³ej. Mimo ¿e badania te nie by³y ukierunko- wane na ocenê skutecznoœci leczenia, wykazano, ¿e terapia genowa prowadzi w obserwacji kilkumiesiêcz- nej do istotnej redukcji objawów d³awicowych mierzo- nych za pomoc¹ klasy czynnoœciowej wed³ug Kanadyj- skiego Towarzystwa Sercowo-Naczyniowego (CCS), czêstoœci wystêpowania epizodów d³awicowych lub ko- niecznoœci podjêzykowego przyjmowania azotanów.

W jednym z tych badañ obserwowano tak¿e istotne zmniejszenie siê powierzchni obszarów niedokrwionych na mapie elektroanatomicznej wykonanej systemem NOGA oraz poprawê perfuzji miêœniowej w badaniu SPECT [16]. Najwiêksze z badañ poœwiêconych temu zagadnieniu – Euroinject One – objê³o 80 pacjentów

z wielu krajów Europy, miêdzy innymi z Polski, których randomizowano do grupy otrzymuj¹cej plazmid lub placebo [18]. Powik³ania zwi¹zane z zabiegiem wyst¹- pi³y u 5 pacjentów, nie odnotowano natomiast zgonów (tab. 2.). W dalszym okresie obserwacji równie¿ nie stwierdzono powik³añ, które mo¿na by wi¹zaæ z podaniem genu. Po 3 miesi¹cach obserwacji nie odnotowano w grupie badanej, w stosunku do grupy kontrolnej, poprawy funkcjonalnej, zwiêkszenia perfuzji ani kurczli- woœci obszarów objêtych iniekcjami w badaniach niein- wazyjnych. Wzros³a natomiast miejscowa kurczliwoœæ liniowa (LLS) oceniana za pomoc¹ sytemu NOGA, a zmniejszy³y siê regionalne zaburzenia funkcji LV oce- niane w wentrykulografii. Kolejne badania dotycz¹ce domiêœniowego podawania plazmidu z wbudowanym genem VEGF s¹ w toku [19].

Podsumowuj¹c, wydaje siê, ¿e system NOGA jest bezpiecznym sposobem dostarczania materia³u gene- tycznego do miêœnia LV oraz monitorowania efektów terapii. Potrzeba jednak wiêkszych badañ klinicznych w celu oceny skutecznoœci terapii genowej.

TTaabbeellaa 33.. Badania kliniczne dotycz¹ce miogenezy z wykorzystaniem systemu NOGA

TTaabbllee 33.. Randomized clinical trials on myogenesis with the implementation of the NOGA system B

Baaddaanniiee RRooddzzaajj kkoommóórreekk BBaaddaannaa ggrruuppaa CCzzaass oobbsseerrwwaaccjjii WWyynniikkii d

dzziiaa³³aanniiaa nniieeppoo¿¿¹¹ddaannee sskkuutteecczznnooœœææ

Tse i wsp. [20] ABMMNSc 8 pacjentów z CAD 3 miesi¹ce brak arytmii po zabiegu zmniejszenie objawów

no-option i w 24-godzinnym EKG d³awicowych

LVEF >30% ambulatoryjnym poprawa kurczliwoœci

po 3 miesi¹cach i perfuzji w MRI

LVEF bez zmian

Fuchs i wsp. [21] ABMDc 10 pacjentów z CAD 3 miesi¹ce brak arytmii, infekcji zmniejszenie objawów

no-option oraz cech zapalenia poprawa perfuzji

miêœnia czy zwiêkszonego w SPECT

bliznowacenia

Perin i wsp. [22] ABMMNCs 21 pacjentów 12 miesiêcy brak poprawa perfuzji

ze schy³kow¹ w SPECT

kardiomiopati¹ poprawa LVEF

niedokrwienn¹ zmniejszenie LVESV

LVEF <40% poprawa LLS

Smith i wsp. [23] ASM 5 pacjentów z HF 6 miesiêcy 1 implantacja ICD poprawa LVEF

po zawale œciany z powodu nsVT poprawa kurczliwoœci

przedniej serca w MRI

LVEF 20–45%

Silva i wsp. [24] ABMMNCs 5 pacjentów 6 miesiêcy brak zgonów, poprawa VO₂max

z zaawansowan¹ CAD groŸnych artymii, oraz wydolnoœci w METS

no-option innych du¿ych zdarzeñ

(kandydaci do OTH) sercowo-naczyniowych

LVEF <40%

ABMMNCs – autologiczne komórki jednoj¹drzaste pochodz¹ce ze szpiku kostnego, ABMDc – autologiczne komórki pochodzenia szpikowego, ASM – autologiczne mioblasty szkieletowe, CAD – choroba wieñcowa, EKG – elektrokardiogram, HF – niewydolnoœæ serca, ICD – kardiowerter-defibrylator, LVEF – frakcja wyrzutowa lewej komory, LVESV – objêtoœæ koñcowoskurczowa lewej komory, OHT – ortotopowy przeszczep serca, METS – jednostka metaboliczna, MRI – rezonans magnetyczny, nsVT – nieutrwalony czêstoskurcz komorowy, SPECT – komputerowa emisyjna tomografia pojedynczego fotonu, VO₂max– maksymalny wychwyt tlenu ABMMNCs – autologous bone marrow derived mononucler cells, ABMDc – autologous bone marrow derived cells (non mononuclear), ASM – autologous skeletal myoblasts, CAD – coronary artery disease, ECG – electrocardiogram, HF – heart failure, ICD – implantable cardioverter-defibrillator, LVEF – left ventricle ejection fraction, LVESV – left ventricle end systolic volume, OHT – orthotopic heart transplant, METS – metabolic unit, MRI – magnetic resonance imaging, nsVT – non-sustained ventricular tachycardia, SPECT – single photon emission computerized tomography, VO₂max – maximal oxygen intake

(7)

Druga grupa zagadnieñ dotycz¹cych terapeutycznego wykorzystania systemu NOGA to iniekcje domiêœnio- we komórek macierzystych w celu stymulacji miogenezy.

Ró¿nicowanie komórek macierzystych oraz ich prze¿y- walnoœæ zale¿¹ od œrodowiska, do którego zostan¹ po- dane, dlatego niezwykle wa¿na jest wiedza na temat ¿y- wotnoœci tkanki (tkanka ¿ywotna lub blizna). System NOGA dostarcza takich informacji. Opublikowane dotychczas prace dotyczy³y, podobnie jak w wypadku angiogenezy, leczenia pacjentów z przewlek³¹ chorob¹ wieñcow¹ typu no-option [20–24]. U wiêkszoœci z nich do iniekcji stosowano autologiczne komórki jednoj¹- drzaste pochodzenia szpikowego (ABMMNCs), czyli mieszankê niewielkich iloœci ró¿nego rodzaju komórek – od limfocytów B i T, po komórki progenitorowe hema- topoezy [20, 22, 24]. Umo¿liwi³o to interakcje miêdzy komórkami oraz ich mikroœrodowiskiem, co mog³o po- prawiæ skutecznoœæ iniekcji. Do wstrzykniêæ wykorzysty- wano tak¿e autologiczne mioblasty szkieletowe (ASM) [23]. W badaniach eksperymentalnych wykazano, ¿e w wypadku ABMMNCs najwiêksz¹ wydajnoœæ uzyskiwa- no przy iniekcjach do miêœnia ¿ywotnego, a w wypadku ASM przy podaniu do blizny [23].

Opublikowane prace dotycz¹ce komórek macierzystych implantowanych z u¿yciem systemu NOGA dotyczy³y g³ównie oceny bezpieczeñstwa terapii i by³y prowadzone na ma³ych grupach pacjentów. O ile prace z wykorzystaniem ABMMNCs okaza³y siê bezpieczne w obserwacji oko³ozabiegowej i odleg³ej i nie prowadzi³y do zwiêkszonej czêstoœci wystêpowania z³oœliwych arytmii, infekcji, zapalenia miêœnia sercowego czy cech zwiêkszonego bliznowacenia, to znacznie wiêcej za- strze¿eñ wi¹za³o siê z podawaniem ASM. Zarówno w badaniu z wykorzystaniem systemu NOGA, jak i w innych publikacjach dotycz¹cych bezpoœredniej iniekcji ASM do miêœnia sercowego obserwowano zwiêkszone ryzyko wyst¹pienia nag³ych zgonów sercowych lub czê- stoskurczów komorowych wymagaj¹cych implantacji kardiowertera-defibrylatora (ang. implanted cardiover- ter defibrillator – ICD) [23]. Obecnie do badañ z u¿y- ciem ASM w³¹czani s¹ jedynie chorzy z ICD, a protokó³ badañ zapewnia bardzo dok³adne monitorowanie pod k¹tem arytmii [25].

Oprócz oceny bezpieczeñstwa terapii we wszystkich omawianych badaniach oceniano tak¿e skutecznoœæ iniekcji komórek. W ka¿dym przypadku opisywano popra- wê czynnoœciow¹ ocenian¹ za pomoc¹ klasy d³awicy piersiowej wed³ug CCS, badañ obrazowych (rezonansu magnetycznego, echokardiografii), izotopowych (SPECT) lub wysi³kowych. Co wa¿ne, skuteczne okaza³o siê tak¿e monitorowanie terapii za pomoc¹ systemu NOGA mie- rzone stopniem poprawy LLS [22]. W najwiêkszej pracy z tej grupy wykazano, ¿e do redukcji objawów, poprawy funkcjonalnej i perfuzji miêœnia sercowego dochodzi w trakcie 2. miesi¹ca od iniekcji [22]. Ciekawych spo-

strze¿eñ dostarczy³a autopsja jednego z pacjentów badania, który zmar³ z powodu incydentu neurologicznego [26]. Analizy histologiczne i immunohistochemiczne pre- paratów miokardium nie wykaza³y nieprawid³owego przy- rostu tkanki lub naczyñ oraz wzmo¿onej reakcji zapalnej.

Obszary poddane iniekcji cechowa³a natomiast wiêksza gêstoœæ kapilar oraz selektywna proliferacja alfa-aktyno- dodatnich pericytów miêœni g³adkich oraz komórek œcien- nych wykazuj¹cych ekspresjê bia³ek specyficznych dla kar- diomiocytów. Komórki te mog³y odpowiadaæ za wzmo¿o- n¹ angiogenezê w obszarach poddanych terapii.

N

Noow waa w weerrssjjaa ssyysstteem muu – – N NO OG GAA XXPP

Nowa wersja systemu do mapowania elektromechanicznego – NOGA XP – powsta³a na bazie wprowadzo- nego wczeœniej systemu CARTO XP. W przeciwieñstwie do poprzedniej wersji, dzia³aj¹cej pod kontrol¹ kompu- terowego systemu operacyjnego Unix, obecna wspó³- pracuje z systemem Windows. Do podstawowych zalet nowego systemu nale¿y szybsza akwizycja danych, ³a- twiejsza i bardziej porêczna obs³uga (ang. user friendly), bardziej precyzyjne okreœlenie obszaru zainteresowania oraz pe³niejsze wykorzystanie zbieranych danych. Jed- noczeœnie mo¿na ogl¹daæ mapê w dwóch projekcjach ustawionych w stosunku do siebie pod k¹tem 90°. Przy- k³adowa mapa stworzona przy wykorzystaniu nowego systemu NOGA XP zosta³a przedstawiona na ryc. 3.

Kolejn¹ zalet¹ nowego sytemu jest mo¿liwoœæ przed- stawiania map w postaci kolorowych obrazów typu bullseye, co powinno u³atwiæ ich porównywanie z wyni- kami innych badañ (np. SPECT). Z nowym systemem wspó³pracuje tak¿e wielopunktowy cewnik diagnostycz- ny – QWIKSTAR^®, który umo¿liwia akwizycjê danych z kilku punktów w tym samym czasie, co pozwala wielo- krotnie skróciæ czas mapowania.

PPooddssuum moow waanniiee ii ppeerrssppeekkttyyw wyy w wyykkoorrzzyyssttaanniiaa ssyysstteem muu N NO OG GAA

System NOGA jest obecnie wykorzystywany g³ównie w badaniach klinicznych do wykonywania iniekcji trans- endomiokardialnych oraz w celu monitorowania czynno- œci LV po zabiegach rewaskularyzacji. Przedstawione w artykule prace udowodni³y i potwierdzi³y skutecznoœæ diagnostyczn¹ metody oraz bezpieczeñstwo i wydajnoœæ iniekcji domiêœniowych. Byæ mo¿e wyniki kolejnych ba- dañ prowadzone na wiêkszych grupach chorych umo¿liwi¹ ustalenie wskazañ do szerszego zastosowania systemu NOGA. Niestety, niebagatelnym czynnikiem limituj¹- cym szerokie zastosowanie cewników do mapowania i terapii wewn¹trzsercowej pozostaje ich wysoka cena.

Z drugiej strony wydaje siê, ¿e przysz³oœæ angiogenezy bêdzie zale¿a³a w du¿ej mierze od postêpu badañ podstawowych poœwiêconych znalezieniu odpowiedniego czynnika stymuluj¹cego ten proces (FGF, VEGF, HGF), wektora przenosz¹cego ten czynnik oraz miejsca

(8)

podania konstruktu genowego. Podobna jest sytuacja badañ dotycz¹cych miogenezy, gdzie g³ównym proble- mem jest dobranie odpowiedniego rodzaju komórek.

Do tej pory badano dosyæ homogenn¹ grupê pa- cjentów typu no-option. Mo¿na sobie jednak wyobraziæ zastosowanie systemu NOGA w celu terapii genowej oraz iniekcji komórkowych w innych sytuacjach klinicznych, np. u pacjentów po niedawno przebytym zawale serca czy chorych po nieskutecznej rewaskularyzacji.

W przysz³oœci mo¿liwoœci diagnostyczne systemu mo- g³oby poprawiæ zestawianie map uzyskanych za jego pomoc¹ z danymi z innych badañ obrazowych. Przyk³adem takiego po³¹czenia jest technologia MERGE wykorzysty- wana w elektrofizjologii i umo¿liwiaj¹ca integracjê obra-

zu lewego przedsionka stworzonego za pomoc¹ kontra- stowej tomografii komputerowej z jego map¹ elektro- anatomiczn¹. Pozwoli³oby to na lepsze okreœlenie wza- jemnych relacji przestrzennych miêdzy obszarami miêœnia hibernowanego i przebiegiem têtnic wieñcowych.

P

Piiœœmmiieennnniiccttwwoo

1. Ben-Haim SA, Osadchy D, Schuster I i wsp. Nonfluoroscopic, in vivo navigation and mapping technology. Nat Med 1996; 2: 1393-1395.

2. Lessick J, Kornowski R, Fuchs S i wsp. Assessment of NOGA catheter stability during the entire cardiac cycle by means of a special needle-tipped catheter. Catheter Cardiovasc Interv 2001;

52: 400-406.

3. Wijns W, Vatner SF, Camici PG. Hibernating myocardium. N Engl J Med 1998; 339:

173-181.

RRyycc.. 33.. Mapa lewej komory uzyskana za pomoc¹ systemu NOGA XP. AA, BB – mapa miejscowej aktywnoœci elektrycznej (ang. unipolar voltage – UV); CC, DD – mapa miejscowej kurczliwoœci liniowej (ang. local linear shortening – LLS); AA, CC – projekcje prawe przednie skoœne (RAO); BB, DD – obraz typu bullseye. Wartoœci dla poszczególnych punktów kodowane kolorem. U do³u ryc. EE parametry stabilnoœci koñcówki cewnika

Loc – stabilnoœæ lokalizacji elektrody (ang. location stability), CL – stabilnoœæ d³ugoœci cyklu pracy serca (ang. cycle length stability), LAT – stabilnoœæ miejscowego czasu aktywacji elektrycznej (ang. local activation time), LS – stabilnoœæ pêtli (ang. loop stability)

Obraz zamieszczony za zgod¹ Departament of Cell Biology, Asklepios Klinik St. George w Hamburgu, Niemcy

FFiigg.. 33.. Map of left ventricle obtained with the NOGA XP system. AA, BB – map of local electrical activity (unipolar voltage – UV) ; CC, DD – map of local linear shortening (LLS) ; AA, CC – right anterior oblique view (RAO); BB, DD – bullseye view. Values of UV and LLS are color coded. Low part of EE – electrode stability criteria

Loc – location stability, CL – cycle length stability, LAT – local activation time stability, LS – loop stability Image with the permission of the Dept. of Cell Biology, Asklepios Klinik St. Georg in Hambug, Germany

AA CC

BB

EE

D

(9)

4. Kornowski R, Hong MK, Leon MB. Comparison between left ventricular electromechanical mapping and radionuclide perfusion imaging for detection of myocardial viability. Circulation 1998; 98: 1837-1841.

5. Gyöngyösi M, Sochor H, Khorsand A i wsp. Online myocardial viability assessment in the catheterization laboratory via NOGA electroanatomic mapping: Quantitative comparison with thallium-201 uptake. Circulation 2001; 104: 1005-1011.

6. Fuchs S, Hendel RC, Baim DS i wsp. Comparison of endocardial electromechanical mapping with radionuclide perfusion imaging to assess myocardial viability and severity of myocardial ischemia in angina pectoris. Am J Cardiol 2001; 87: 874-880.

7. Bøtker HE, Lassen JF, Hermansen F i wsp. Electromechanical mapping for detection of myocardial viability in patients with ischemic cardiomyopathy. Circulation 2001; 103: 1631-1637.

8. Keck A, Hertting K, Schwartz Y i wsp. Electromechanical mapping for determination of myocardial contractility and viability. A comparison with echocardiography, myocardial single-photon emission computed tomography, and positron emission tomography. J Am Coll Cardiol 2002;

40: 1075-1078.

9. Koch KC, vom Dahl J, Wenderdel M i wsp. Myocardial viability assessment by endocardial electroanatomic mapping: comparison with metabolic imaging and functional recovery after coronary revascularization. J Am Coll Cardiol 2001; 38: 91-98.

10. Graf S, Gyöngyösi M, Khorsand A i wsp. Electromechanical properties of perfusion/metabolism mismatch: comparison of nonfluoroscopic electroanatomic mapping with 18F-FDG PET. J Nucl Med 2004; 45: 1611-1618.

11. Wiggers H, Bøtker HE, Søgaard P i wsp. Electromechanical mapping versus positron emission tomography and single photon emission computed tomography for the detection of myocardial viability in patients with ischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol 2003; 41: 843-488.

12. Perin EC, Silva GV, Sarmento-Leite R i wsp. Assessing myocardial viability and infarct transmu- rality with left ventricular electromechanical mapping in patients with stable coronary artery disease: validation by delayed-enhancement magnetic resonance imaging. Circulation 2002;

106: 957-961.

13. Gyöngyösi M, Khorsand A, Sochor H i wsp. Characterization of hibernating myocardium with NOGA electroanatomic endocardial mapping. Am J Cardiol 2005; 95: 722-728.

14. Koch KC, Wenderdel M, Stellbrink C i wsp. Electromechanical assessment of left ventricular function following successful percutaneous coronary revascularization. Catheter Cardiovasc Interv 2001; 54: 466-472.

15. Hou D, Youssef EA, Brinton TJ i wsp. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intra- coronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation 2005; 112 (Suppl 9): I150-I156.

16. Vale PR, Losordo DW, Milliken CE i wsp. Randomized, single-blind, placebo-controlled pilot study of catheter-based myocardial gene transfer for therapeutic angiogenesis using left ventricular electromechanical mapping in patients with chronic myocardial ischemia. Circulation 2001; 103: 2138-2143.

17. Losordo DW, Vale PR, Hendel RC i wsp. Phase 1/2 placebo-controlled, double-blind, dose- -escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer by catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia. Circulation 2002; 105: 2012-2018.

18. Kastrup J, Jørgensen E, Rück A i wsp. Direct intramyocardial plasmid vascular endothelial growth factor-A165 gene therapy in patients with stable severe angina pectoris A randomized double- -blind placebo-controlled study: the Euroinject One trial. J Am Coll Cardiol 2005; 45: 982-988.

19. Kuku³a K, D¹browski M, Chojnowska L i wsp. Podstawy teoretyczne i plan badania VIFCAD – terapii genowej choroby wieñcowej u pacjentów bez mo¿liwoœci zabiegowej rewaskularyzacji z zastosowaniem podawanego transendokardialnie plazmidu bicistronowego VEGF/FGF. Postêpy w Kardiologii Interwencyjnej 2006; 2: 116-123.

20. Tse HF, Kwong YL, Chan JK i wsp. Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation. Lancet 2003; 361: 47-49.

21. Fuchs S, Satler LF, Kornowski R i wsp. Catheter-based autologous bone marrow myocardial injection in no-option patients with advanced coronary artery disease: a feasibility study. J Am Coll Cardiol 2003; 41: 1721-1724.

22. Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R i wsp. Improved exercise capacity and ischemia 6 and 12 months after transendocardial injection of autologous bone marrow mononuclear cells for ischemic cardiomyopathy. Circulation 2004; 110 (11 Suppl 1): II213-218.

23. Smits PC, van Geuns RJ, Poldermans D i wsp. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J Am Coll Cardiol 2003; 42: 2063-2069.

24. Silva GV, Perin EC, Dohmann HF i wsp. Catheter-based transendocardial delivery of autologous bone-marrow-derived mononuclear cells in patients listed for heart transplantation. Tex Heart Inst J 2004; 31: 214-219.

25. Perin EC, Silva GV. Stem cell therapy in end-stage ischaemic heart failure: a catheter-based therapeutic strategy targeting myocardial viability. Eur Hart J 2006; 8 (Suppl H): H46-H51.

26. Dohmann HF, Perin EC, Takiya CM i wsp. Transendocardial autologous bone marrow mononuclear cell injection in ischemic heart failure: postmortem anatomicopathologic and immunohisto- chemical findings. Circulation 2005; 112: 521-526.