ZWIĄZKI BIOLOGICZNIE CZYNNE POCHODZENIA NATURALNEGO

(1)

ZWIĄZKI BIOLOGICZNIE CZYNNE POCHODZENIA NATURALNEGO

DR INŻ. TOMASZ LASKOWSKI KATEDRA TECHNOLOGII LEKÓW I BIOCHEMII WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI GDAŃSKIEJ

WYKŁAD DLA SPECJALIZACJI:

BIOTECHNOLOGIA LEKÓW

(2)

Warunki zaliczenia:

 Egzamin/kolokwium wykładowe na koniec semestru

 Pozytywna ocena z zadania domowego

Konsultacje:

Czwartek, 11⁰⁰-12⁰⁰ Chemia B, pokój nr 1

Dane kontaktowe:

tomasz.laskowski@pg.gda.pl

(3)

CZĘŚĆ I:

PLAN WYKŁADÓW

WPROWADZENIE

(4)

PLAN WYKŁADÓW

 Kawa (co tydzień)

 Klasyfikacja związków naturalnych oraz metod badawczych

 Omówienie poszczególnych grup związków pod względem:

 rangi i występowania

 biogenezy

 pełnionych funkcji

 zastosowania

 Przykłady związków naturalnych:

 historia

 biogeneza

 chemia

 izolacja

 badania spektroskopowe

 Związki naturalne badane w KTLiB Wydziału Chemicznego PG:

 makrolidy polienowe

 dsDNA, telomerowe DNA, RNA

(5)

WPROWADZENIE

Czym są związki naturalne?

 W najszerszym ujęciu: to wszystkie organiczne oraz nieorganiczne związki chemiczne, które mają jakikolwiek związek z organizmami żywymi (tj. są przez nie wytwarzane bądź pobierane z otoczenia i przetwarzane).

 W ujęciu chemii organicznej: to wszystkie metabolity pierwotne (ang. primary metabolites), metabolity wtórne (ang. secondary metabolites) oraz biomakromolekuły występujące w żywych organizmach.

 W ujęciu chemii medycznej oraz farmakognozji: to wszystkie metabolity wtórne występujące w żywych organizmach.

Każdy związek występujący w organizmie żywym ma swoją rangę, szlak biogenezy (bądź pobierania z otoczenia), pełni określone funkcje w organizmie i posiada potencjalne zastosowanie.

(6)

WPROWADZENIE

RANGA/WYSTĘPOWANIE

biomakromolekuły

DNA/RNA białka/enzymy

rybozymy inne (?)

metabolity pierwotne metabolity wtórne

BIOGENEZA/STRUKTURA

mono-/di-/polisacharydy aminokwasy/peptydy/białka

lipidy

kwasy tłuszczowe glicerolipidy glicerofosfolipidy

sfingolipidy steroidy

inne

nukleotydy/RNA/DNA terpeny i terpenoidy

monoterpeny (monoterpenoidy) diterpeny (diterpenoidy) triterpeny (triterpenoidy)

inne

pochodne poliketydów alkaloidy

flawonoidy polifenole

…oraz kombinacje, np. saponiny

…i wiele, wiele innych

PEŁNIONE FUNKCJE

energetyczne strukturalne przekaźnikowe sygnałowe (np. feromony) regulatorowe (np. hormony,

stymulanty)

katalityczne (np. kofaktory enzymów)

gromadzenie informacji genetycznej (kwasy nukleinowe)

zapachowe i smakowe funkcje obronne (np. jady, toksyny,

fitoncydy)

zdobywanie przewagi w środowisku (np. antybiotyki)

barwniki

…oraz wiele, wiele innych

…i sporo nadal nieokreślonych

ZASTOSOWANIE

żywieniowe przemysłowe

przemysł tekstylny przemysł papierniczy

barwniki i tysiąc innych

farmaceutyczne

leki pochodzenia roślinnego antybiotyki

suplementy diety i milion innych

…i wiele (ale nie miliard) innych

Związki naturalne można podzielić ze względu na:

(7)

WPROWADZENIE

UPROSZCZONY SCHEMAT METABOLIZMU LUDZKIEGO TAKŻE TEGO… MIŁEJ NAUKI NA EGZAMIN.

(8)

WPROWADZENIE

(9)

WPROWADZENIE

Uproszczony schemat metabolizmu roślinnego:

metabolity pierwotne metabolity wtórne

(10)

CZĘŚĆ II:

METODY BADAWCZE

(11)

METODY BADAWCZE

IZOLACJA

ekstrakcja

modyfikacje chemiczne metody chromatograficzne

elektroforeza krystalizacja

IDENTYFIKACJA ORAZ BADANIA STRUKTURALNE METODY SPEKTROSKOPOWE METODY CHEMICZNE

MS własności fizykochemiczne

NMR, EPR korelacja chemiczna

IR badania kinetyki reakcji

LD metody sekwencjonowania białek i

kwasów nukleinowych

UV/VIS, ORD, CD metody enzymatyczne

rentgenografia strukturalna …oraz inne, mniej istotne

Idealny schemat badań związków naturalnych:

Najważniejsze metody izolacji, identyfikacji oraz badań strukturalnych związków naturalnych – zarówno te klasyczne, jak i bardziej nowoczesne:

OBSERWACJA

ZJAWISKA IZOLACJA IDENTYFIKACJA/

OKREŚLENIE

STRUKTURY BIOGENEZA EKOLOGIA

CHEMICZNA

(12)

OBSERWACJA ZJAWISKA

Studia nad danym związkiem naturalnym rozpoczynają się od obserwacji zjawiska towarzyszącego spożyciu/zastosowaniu danej substancji.

Na przykład:

 wyciąg z kory wierzby łagodzi gorączkę!

 miażdżenie, a następnie spożycie czosnku przynosi ulgę w przeziębieniu!

 sproszkowana kora chinowca zmieszana z syropem goździkowym stanowi lekarstwo na malarię!

 napar z liści herbaty ma właściwości pobudzające (a napar z owoców kawy pobudza jeszcze bardziej)!

 palenie liści tytoniu uzależnia!

 napar z mięty poprawia trawienie!

Wraz z rozwojem nowoczesnej chemii zauważono, że za aktywnością biologiczną ww. substancji stoją niskocząsteczkowe związki organiczne – związki naturalne: kwas salicylowy, allicyna, chinina, teina i kofeina, nikotyna, mentol, etc.

Obserwacja zjawiska prowadzi do podjęcia wysiłku izolacji związku chemicznego odpowiedzialnego za aktywność biologiczną.

(13)

IZOLACJA

Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

EKSTRAKCJA

I. Wymywanie substancji zawartej w fazie stałej/materiale biologicznym przy pomocy odpowiedniego rozpuszczalnika.

II. Podział substancji między dwie, niemieszające się fazy ciekłe.

III. Ekstrakcja substancji zawartych w materiale biologicznym przy pomocy cieczy w stanie nadkrytycznym (ang. SF – Supercritical Fluid).

Ad. I: Izolacja kwasu ursolowego z liści szałwii n-heptanem przy pomocy aparatu Soxhleta.

Kwas ursolowy – triterpenoid, pochodna ursanu. Metabolit wtórny m.in. mącznicy lekarskiej (Arctostaphylos uva ursi) i szałwii lekarskiej (Salvia officinalis). Liczne własności farmakologiczne, m.in. przeciwbólowe, przeciwwirusowe, przeciwbakteryjne i przeciwpierwotniakowe.

(14)

IZOLACJA

EKSTRAKCJA

Ad. I & II: Izolacja eugenolu z goździków przy pomocy eteru naftowego, stężonego roztoru NaHCO₃ i wodnego roztworu NaOH.

Eugenol – terpenoid, pochodna gwajakolu. Metabolit wtórny m.in. goździków (Syzygium aromaticum) i cynamonu (Cinnamomum verum). Liczne zastosowania w przemyśle perfumeryjnym (m.in. składnik zapachów orientalnych) oraz dentystycznym (własności antyseptyczne, składnik cementu dentystycznego). Może również służyć jak atraktant owadów.

Eter naftowy – mieszanina izomerów pentanu, heksanu i heptanu o różnych proporcjach; zwana niekiedy lekką benzyną.

Strategia postępowania:

1. Ekstrakcja eterem naftowym (aparat Soxhleta).

2. Ekstrakcja mocnych kwasów stężonym roztworem

NaHCO3.

3. Ekstrakcja eugenolu roztworem NaOH.

(15)

IZOLACJA

EKSTRAKCJA

Ad. III: Wydobywanie tiosulfinatów (m.in. allicyny) z czosnku metodą ekstrakcji CO₂ w stanie nadkrytycznym.

Allicyna – tiosulfinat, fitoncyd, pochodna alliiny. Związek powstający w trakcie miażdżenia czosnku (Allium sativum) i cebuli (Allium cepa). Morderca niezliczonych szczepów bakterii, w tym pałeczek cholery, salmonelli, gronkowca złocistego, Helicobacter pylori i pałeczek jadu kiełbasianego.

Stan nadkrytyczny – stan, w którym substancja posiada własności zarówno cieczy, jak i gazu. Dla CO₂: T_C = 304 K;

p_C = 7,38 MPa.

(16)

IZOLACJA

MODYFIKACJE CHEMICZNE

Modyfikacje chemiczne mogą być prowadzone:

 na etapie izolacji w celu zmiany (polepszenia) właściwości fizykochemicznych izolowanego związku, aby ułatwić (czasem: umożliwić) proces jego oczyszczania;

 na etapie biosyntezy w celu wprowadzenia grupy funkcyjnej, umożliwiającej zastosowanie specjalnej metody oczyszczania (np. chromatografii metalopowinowactwa);

 na etapie badań strukturalnych w celu umożliwienia studiów stereochemicznych.

Modyfikacje chemiczne powinny być:

 wydajne;

 proste;

 odwracalne.

(17)

IZOLACJA

MODYFIKACJE CHEMICZNE Na przykład:

Leworyna A1 – składnik kompleksu leworyny, antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, produkowany przez promieniowce Actinomyces levoris. Silne działanie przeciwgrzybicze. Toksyczny dla człowieka.

Strategia modyfikacji:

1. Acetylacja kilkunastoprocentowego kompleksu leworyny bezwodnikiem kwasu octowego (acetylacji ulega wyłącznie grupa aminowa reszty mykozaminy).

2. Tworzenie estru metylowego dzięki reakcji z diazometanem.

Cel: obniżenie polarności, większa podatność na ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi.

(18)

IZOLACJA

MODYFIKACJE CHEMICZNE Na przykład:

Mentol – terpenoid, metabolit wtórny m.in. mięty pieprzowej (Mentha piperita). Niezliczone zastosowania w przemyśle spożywczym, higienie jamy ustnej i wielu innych. Bardzo aktywny biologicznie - wykazuje zdolność m.in. do aktywacji receptorów odpowiedzialnych za uczucie chłodu.

Strategia modyfikacji:

1. Utworzenie trichloroacetoimidanu 2,3,4,6- tetrabenzylomannozy.

2. Reakcja ww. związku z mentolem w obecności katalitycznych ilości NaH (reakcja Schmidta) w celu utworzenia 2,3,4,6-tetrabenzylomannozydu mentylu.

Cel: wprowadzenie sondy chiralnej, możliwość określenia konfiguracji absolutnej aglikonu metodami spektroskopii NMR.

CH₃

CH₃ H₃C

O O

H

BnO

H BnO

OBn

H H OBn

(19)

IZOLACJA

METODY CHROMATOGRAFICZNE

Metody chromatograficzne służą przede wszystkim do rozdziału mieszanin niemożliwych do rozdzielenia innymi metodami (np. ekstrakcja) i są stosowane na końcowym etapie oczyszczania izolowanego związku.

Podstawowe techniki:

 chromatografia cienkowarstwowa (TLC);

 chromatografia cieczowa (kolumnowa);

 wysoko-sprawna/ultra-sprawna chromatografia cieczowa (HPLC/UPLC).

Przykład:

Piperyna – alkaloid, metabolit wtórny pieprzu czarnego (Piper nigrum).

Wykazuje działanie przeciwbakteryjne. Ostry w smaku. Silny stymulant metabolizmu.

Strategia izolacji:

1. Ekstrakcja chloroformem (aparat Soxhleta) – ekstrakt zawiera wszystkie lipofilowe związki zawarte w pieprzu.

2. Saponifikacja trójglicerydów 10% KOH (50% EtOH w H₂O).

3. Krystalizacja surowych kryształów piperyny (niska temp.), oddzielenie kryształów i rekrystalizacja w układzie Cyklohex:Tol 4:1, v/v.

(20)

IZOLACJA

METODY CHROMATOGRAFICZNE

Metody chromatograficzne służą przede wszystkim do rozdziału mieszanin niemożliwych do rozdzielenia innymi metodami (np. ekstrakcja) i są stosowane na końcowym etapie oczyszczania izolowanego związku.

 chromatografia cienkowarstwowa (TLC);

 chromatografia cieczowa (kolumnowa);

 wysoko-sprawna/ultra-sprawna chromatografia cieczowa (HPLC/UPLC).

Przykład:

Analiza TLC kryształów (Tol:AcOEt 1:1, v/v) wskazuje, że produkt wcale nie jest czysty! Stwierdza się obecność drugiego stereoizomeru o wyższej polarności (R_f = 0,26; dla piperyny: R_f = 0,53).

Co zrobić?

1. Dobrać układ na kolumnę (obniżyć R_f pożądanego składnika).

2. Chromatografia kolumnowa, dobrany eluent: Tol:AcOEt 2:1, v/v.

3. Efekt: czysta piperyna w postaci bezbarwnych kryształów, Tt: 127-129 °C.

(21)

IZOLACJA

ELEKTROFOREZA

Metody elektroforetyczne stosowane są przede wszystkim do analiz oraz rozdziału białek i kwasów nukleinowych, tj. dużych cząsteczek obdarzonych ładunkiem elektrycznym i znacznie różniących się masą.

 elektroforeza żelowa (DNA, RNA, białka);

 elektroforeza kapilarna (DNA, peptydy, mniejsze cząsteczki).

Ruchliwość elektroforetyczna – parametr związku poddawanego elektroforezie, zależny od:

 całkowitego ładunku cząsteczki;

 masy cząsteczki;

 kształtu cząsteczki;

 gęstości żelu;

 przyłożonego napięcia.

(22)

IZOLACJA

KRYSTALIZACJA

Krystalizacja stanowi z reguły końcowy etap oczyszczania, poprzedzony licznymi zabiegami ekstrakcji, rozdziału oraz destylacji.

 ochładzanie roztworu;

 reakcja chemiczna;

 zmiana pH roztworu;

 odparowanie rozpuszczalnika.

Przykłady:

 eugenol, po oczyszczeniu i przedestylowaniu, krystalizuje po umieszczeniu w zamrażalniku (T_t = 264 K);

 strychnina krystalizuje z roztworu wodnego po dodaniu H₂SO₄ i węgla aktywnego w postaci siarczanu strychniny (T_t = 277 K); krystalizacja zachodzi w większym stopniu po częściowym odparowaniu rozpuszczalnika pod próżnią;

 siarczan strychniny, rozpuszczony w gorącej wodzie z dodatkiem Na₂CO₃, krystalizuje w postaci czystej strychniny w temperaturze pokojowej.

(23)

IDENTYFIKACJA

Jeżeli oczyszczony związek naturalny jest znany, zostaje poddany identyfikacji.

Podstawowe techniki identyfikacji związków polegają zazwyczaj na porównaniu właściwości fizykochemicznych do wartości referencyjnych, takich jak:

 skręcalność optyczna;

 temperatura topnienia/wrzenia;

 gęstość (w przypadku cieczy);

 masa cząsteczkowa (spektrometria mas);

 czas retencji z kolumny (HPLC) lub współczynnik retencji (TLC).

Obecnie, bardzo często do identyfikacji związków stosuje się „szybkie” techniki spektroskopowe:

 widma 1D NMR (¹H, ¹³C, ³¹P);

 widma w bliskiej podczerwieni (tzw. „fingerprint”);

 widma UV;

 widma CD.

(24)

Jeżeli oczyszczony związek naturalny nie jest znany, kolejny etap badań polega na ustaleniu jego struktury (konstytucji) oraz stereostruktury (stereochemii, struktury wyższych rzędów w przypadku białek, etc.)

WSTĘP: KLASYFIKACJA METOD

Metody badań strukturalnych można z grubsza podzielić na dwa główne rodzaje.

Metody chemiczne:

 badania kinetyki reakcji;

 korelacja chemiczna;

 sekwencjonowanie białek i kwasów nukleinowych.

Metody spektroskopowe:

 spektrometria mas, MS (bombardowanie atomami, jonami, elektronami, fotonami, etc.)

 magnetyczny rezonans jądrowy, NMR (fale radiowe);

 elektronowy rezonans paramagnetyczny, EPR (mikrofale);

 spektroskopia w podczerwieni, IR;

 dichroizm liniowy, LD (podczerwień, ultrafiolet);

 spektroskopia UV/VIS;

 dyspersja skręcalności optycznej, ORD (podczerwień, światło widzialne, ultrafiolet);

 dichroizm kołowy, CD (ultrafiolet);

 rentgenografia strukturalna (promienie X).

BADANIA STRUKTURALNE

(25)

METODY CHEMICZNE: BADANIA KINETYKI REAKCJI

Pewne reakcje chemiczne, np. estryfikacji, mogą zachodzić z różną szybkością w zależności od stereochemii badanego związku.

Przykład z historii:

Struktura mentolu jest znana od roku 1891 (Semmler i wsp.). Olejek z mięty japońskiej (Mentha arvensis) zawiera mieszaninę dwóch diastereoizomerów, znanych dzisiaj jako (-)-mentol i (+)-neomentol. Jak się okazało, różnią się one konfiguracją na węglu 1, zawierającym grupę –OH.

BADANIA STRUKTURALNE

Mentol Mieszanina (-)-mentolu i (+)-neomentolu

CH₃

H₃C CH₃

OH

* *

*

iPr

CH₃ HO

iPr

CH₃

OH

W jaki sposób określić orientację (aksjalną vs. ekwatorialną) grupy hydroksylowej w każdym z tych diastereoizomerów?

(26)

METODY CHEMICZNE: BADANIA KINETYKI REAKCJI

Pewne reakcje chemiczne, np. estryfikacji, mogą zachodzić z różną szybkością w zależności od stereochemii badanego związku.

Przykład z historii:

Grupy hydroksylowe w pozycji aksjalnej oraz ekwatorialnej ulegają reakcji estryfikacji z różną szybkością. Pozycje ekwatorialne są zazwyczaj estryfikowane szybciej, niż analogiczne pozycje aksjalne.

BADANIA STRUKTURALNE

(-)-mentol: szybko!

Wnioski: (-)-mentol ulega estryfikacji szybko → grupa –OH w pozycji ekwatorialnej! (+)-Neomentol ulega reakcji wolno lub wcale → grupa –OH w pozycji aksjalnej!

(+)-neomentol: wolno! (-)-mentol: szybko! (+)-neomentol: brak reakcji!

iPr

CH₃ HO

iPr

CH₃

OH

iPr

CH₃ EtO₂C

iPr

CH₃

OH Cl OEt

O iPr

CH₃ HO

iPr

CH₃

OH

iPr

CH₃ AcO

iPr

CH₃

OAc Cl

O

(27)

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA Metody korelacji chemicznej zakładają dwa, główne podejścia:

1. degradacja badanego związku naturalnego lub utworzenie jego pochodnej w celu otrzymania związku(-ów) o identycznych własnościach fizykochemicznych w porównaniu do już poznanych struktur – analiza organiczna;

2. założenie konstytucji badanego związku naturalnego, a następnie synteza założonej struktury ab initio z dobrze poznanych substratów – synteza totalna.

Jaskrawy przykład analizy organicznej (Haarmann-Tiemann, 1874):

BADANIA STRUKTURALNE

WANILINA domniemana struktura

HCl / H₂O

OH

O OH

O O^-

O^-

O^- NaOH, KOH

463 - 518 K

O H

OH

OCH₃

KWAS PROTOKATECHOWY substancja o znanej strukturze

(28)

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA Synteza totalna:

I. założenie konstytucji i stereostruktury badanego związku naturalnego na podstawie prowadzonych badań, np.:

 skład elementarny, stopień nienasycenia;

 temperatura wrzenia i topnienia;

 czynność optyczna;

 wyniki prostych doświadczeń (np. odbarwianie wody bromowej, kwasowość/zasadowość, świecenie pod lampą UV, etc.);

 degradacja chemiczna (np. ozonoliza) i/lub tworzenie pochodnych.

II. synteza założonej struktury z łatwo dostępnych i dobrze poznanych substratów;

 w przypadku związków optycznie czynnych synteza musi być stereospecyficzna lub otrzymana mieszanina racemiczna musi zostać rozdzielona;

III. porównanie właściwości fizykochemicznych otrzymanego związku z wyizolowanym związkiem naturalnym.

Pełna zgodność własności fizykochemicznych syntetycznej wersji związku i wersji naturalnej stanowi dowód poprawności założonej struktury.

BADANIA STRUKTURALNE

(29)

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA Synteza totalna – przykład (Haarmann-Tiemann, 1874):

BADANIA STRUKTURALNE

WANILINA tą reakcją Harmann i Tiemann potwierdzili

strukturę waniliny KONIFERYNA

glukozyd alkoholu koniferynowego, substrat ligniny, izolowany z roślin

iglastych; znana struktura

H⁺

OH

OCH₃

O H

O

OCH₃ K₂Cr₂O₇

OCH₃ HO

O H

HO

H HO

H

H H OH

O OH

Glu

(30)

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA Synteza totalna – przykład (Reimer, 1876):

BADANIA STRUKTURALNE

OH

OCH₃

O H

CHCl₃

OH

OCH₃

KOH

GWAJAKOL WANILINA

OH

CHCl₃ KOH OH

H O

Fenol Aldehyd salicylowy

Reakcja Reimera-Tiemanna

Aldehyd salicylowy – metabolit wtórny m.in. gryki zwyczajnej (Fagopyrum esculentum) oraz, uwaga, bobra europejskiego. Stanowi jeden ze składników kastoreum, wysoko cenionej wydzieliny bobra z gruczołów wstydliwych, stosowanej w przemyśle perfumeryjnym oraz żywnościowym. Kastoreum miało być również jednym ze składników mitycznego panaceum.

(31)

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA Synteza totalna – przykład (Reimer-Erlenmeyer, 1876):

BADANIA STRUKTURALNE

OH

OCH₃ CH₃

OH

OCH₃

O H

H₃C H O

+ O₃

Mieszanina aldehydu octowego i WANILINY w stosunku 1:1 IZOEUGENOL

izomer eugenolu OH

OCH₃

EUGENOL znany i lubiany

KOH

Ciekawostka! W 2007 roku przyznano Anty-Nobla za otrzymanie waniliny z krowiego łajna.

(32)

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA Synteza totalna – inne przykłady:

BADANIA STRUKTURALNE

Strychnina

Izolacja: Palletier & Caventon, 1818;

Struktura: Robinson; 1946;

Synteza: Woodward; 1954.

Cholesterol

Izolacja: Windaus, 1909;

Struktura: Wielanc; 1932;

Synteza: Robinson, Woodward (doniesienie równoległe);

1952.

(33)

METODY CHEMICZNE: SEKWENCJONOWANIE BIAŁEK I KWASÓW NUKLEINOWYCH Chemiczne metody sekwencjonowania białek i kwasów nukleinowych polegają na degradacji lub syntezie badanej biomakromolekuły.

Dla białek:

 degradacja Edmana – reakcja izotiocyjanianu fenylu (Ph-N=C=S) z N-terminalnym aminokwasem i analiza chromatograficzna produktów rozpadu, wydajność << 100%.

Do ustalania sekwencji aminokwasowej białek i peptydów jest obecnie stosowana przede wszystkim spektrometria mas (nie można odróżnić: leucyny od izoleucyny oraz lizyny od glutaminy).

Dla kwasów nukleinowych:

 sekwencjonowanie Sangera – reakcja syntezy (PCR) DNA/RNA z dodatkiem ddNTP (2’,3’- dideoksynukleotydotrifosforanów); dodatek ten powoduje syntezę nici o wszystkich, możliwych długościach i zakończonych jednym z czterech możliwych ddNTP; analiza – rozdział elektroforetyczny produktów reakcji;

 metoda Maxama-Gilberta – reakcja degradacji DNA znakowanego izotopem ³²P na końcu 5’ przy użyciu czterech, różnych odczynników, modyfikujących zasady azotowe (G, G+A, C, C+T); obecnie rzadko stosowana;

 inne.

BADANIA STRUKTURALNE

(34)

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROMETRIA MAS (MS)

Spektrometria mas jest zaliczana do metod spektroskopowych, ponieważ jako wynik zastosowania tej metody badawczej otrzymuje się widma (ang. spectra).

Podstawowe różnice pomiędzy różnymi odmianami spektrometrii mas pojawiają się na etapie 3 , tj. jonizacji (bombardowanie elektronami, atomami, jonami, fotonami, etc.).

BADANIA STRUKTURALNE

(35)

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROMETRIA MAS (MS)

Niektóre metody jonizacji (np. FAB, EI, LD) powodują fragmentację powstałych jonów molekularnych.

Widma masowe powstałe w wyniku fragmentacji cząsteczek stanowią doskonałe narzędzie do badań strukturalnych.

BADANIA STRUKTURALNE

(36)

METODY SPEKTROSKOPOWE: MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY (NMR)

Spektroskopia NMR opiera się na zjawisku absorpcji promieniowania elektromagnetycznego o częstotliwości radiowej przez jądra atomowe obdarzone momentami magnetycznymi.

I. Badaną próbkę umieszcza się w silnym, zewnętrznym polu magnetycznym, w którym różnicują się energie spinów jądrowych.

II. Dla jąder o spinowej liczbie kwantowej I = ½ (np. ¹H, ¹³C, ¹⁵N, ³¹P, etc.), ilość dozwolonych orientacji w silnym, zewnętrznym polu magnetycznym wynosi 2, zgodnie ze wzorem N = 2I + 1.

III. Wzbudzenie jądra atomowego następuje w wyniku absorpcji kwantu energii E = hν, gdzie ν – kilkadziesiąt lub kilkaset MHz.

BADANIA STRUKTURALNE

(37)

B

₀

Transmiter ^hυ

^L

v [Hz]

BADANIA STRUKTURALNE

METODY SPEKTROSKOPOWE: MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY (NMR) Mechanizm powstawania sygnału rezonansowego:

(38)

METODY SPEKTROSKOPOWE: MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY (NMR) Częstotliwość rezonansowa danego jądra zależy od:

 typu badanego jądra (czyli rodzaju pierwiastka chemicznego);

 mocy aparatu (tj. natężenia pola magnetycznego porządkującego spiny badanych jąder);

 jego otoczenia chemicznego, czyli indukcji lokalnego pola magnetycznego, zależnej od ilości oraz typu atomów sąsiadujących.

Niewielkie różnice w częstotliwościach rezonansowych jąder tego samego pierwiastka sprawiają, że generują one sygnały rezonansowe w różnych miejscach osi częstotliwości, co umożliwia zastosowanie spektroskopii NMR do celów praktycznych.

BADANIA STRUKTURALNE

A

A B

B

C

D C

D E E

(39)

METODY SPEKTROSKOPOWE: MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY (NMR) Najważniejsze dwuwymiarowe eksperymenty NMR:

 GCOSY;

 DQF-COSY;

 TOCSY;

 HSQC;

 HMBC;

 HETCOR;

 NOESY;

 ROESY.

BADANIA STRUKTURALNE

STRYCHNINA GCOSY

(40)

METODY SPEKTROSKOPOWE: ELEKTRONOWY REZONANS PARAMAGNETYCZNY (EPR) Spektroskopia EPR opiera się na tych samych fundamentach teoretycznych, co spektroskopia NMR – z tą różnicą, że wzbudzaniu ulegają spiny elektronów, a nie jąder atomowych.

I. Próbka umieszczana jest w silnym, zewnętrznym polu magnetycznym, którego wymagane natężenie jest dużo niższe, niż dla zjawiska magnetycznego rezonansu jądrowego.

II. Spiny elektronowe wzbudzane są kwantami promieniowania elektromagnetycznego o około 1000- krotnie wyższej energii, niż w przypadku spinów jądrowych, co oznacza, że częstotliwości rezonansowe elektronów odpowiadają promieniowaniu mikrofalowemu, a nie radiowemu.

Zasadniczym ograniczeniem techniki EPR jest fakt, że obserwowalnemu wzbudzeniu mogą ulegać wyłącznie elektrony niesparowane. Oznacza to, że związki badane przy pomocy spektroskopii rezonansu elektronowego muszą być:

 wolnymi rodnikami;

 kompleksami z paramagnetycznymi jonami metali.

BADANIA STRUKTURALNE

(41)

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI (IR)

Spektroskopia IR opiera się na fakcie, iż częstotliwości promieniowania elektromagnetycznego z zakresu podczerwieni odpowiadają częstotliwościom drgań własnych wiązań atomowych (zjawisko rezonansu).

W co najmniej kilkuatomowych cząsteczkach może wystąpić kilka rodzajów drgań:

 rozciągające symetryczne i asymetryczne;

 nożycowe;

 wahadłowe;

 deformacyjne poza płaszczyznę;

 skręcające.

Częstotliwość rezonansowa (liczba falowa) określonego typu drgań danego wiązania chemicznego zależy od typu atomów tworzących wiązanie oraz ich otoczenia chemicznego.

Zakres widma IR poniżej 1000 cm^-1 jest unikalny dla danego związku chemicznego i może służyć do jego szybkiej identyfikacji (tzw. fingerprint).

BADANIA STRUKTURALNE

(42)

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI (IR) Spektroskopia IR; fingerprint – przykład:

BADANIA STRUKTURALNE

IZOEUGENOL EUGENOL

(43)

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI (IR) Spektroskopia IR – przykład:

BADANIA STRUKTURALNE

(44)

METODY SPEKTROSKOPOWE: DICHROIZM LINIOWY (LD)

Technika dichroizmu liniowego polega na pomiarze różnicy absorpcji przez molekułę spolaryzowanego liniowo promieniowania elektromagnetycznego (UV, VIS, IR) w kierunku równoległym (A_║) oraz prostopadłym (A_┴) do orientacji (osi) badanej cząsteczki.

Warunek – makroskopowa orientacja cząsteczek w próbce:

 kryształ;

… a jeżeli nie dysponujemy kryształem, orientację należy wymusić, np. poprzez:

 rozciąganie folii polimerowej;

 naprężenia ścinające w przepływie laminarnym;

 zewnętrze pole elektryczne/magnetyczne, etc.

Należy jednak pamiętać, że wymuszona orientacja cząsteczek nigdy nie jest całkowita, a jej stopień zależy od kształtu badanych molekuł – najłatwiej orientacji ulegają cząsteczki długie i stosunkowo sztywne.

Ogólne równanie dichroizmu liniowego: LD = A_║ - A_┴

BADANIA STRUKTURALNE

(45)

METODY SPEKTROSKOPOWE: DICHROIZM LINIOWY (LD) Dichroizm liniowy – przykład:

BADANIA STRUKTURALNE

Dla DNA: LD = A_║ - A_┴< 0 Zastosowania:

 rozróżnienie form DNA w roztworze (A, B, Z);

 śledzenia zmian strukturalnych w roztworze;

 śledzenie zjawiska kompleksowania z ligandami.

A_║≈ 0 A_┴> 0

(46)

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA ABSORPCJI ELEKTRONOWEJ – UV/VIS, DYSPERSJA SKRĘCALNOŚCI OPTYCZNEJ (ORD), DICHROIZM KOŁOWY (CD)

Jedne z pierwszych metod spektroskopowych, stosowanych w badaniach strukturalnych związków organicznych.

UV/VIS

 Technika służy przede wszystkim stwierdzeniu obecności chromoforów w strukturze, zwłaszcza sprzężonych; np. fragmentów aromatycznych, dienów i polienów, ketonów α,ß-nienasyconych, etc.

 Widmo UV/VIS prezentuje stopień absorpcji izotropowego promieniowania elektromagnetycznego w funkcji długości fali.

 Metoda niewrażliwa na czynność optyczną, tj. widma enancjomerów tego samego związku są identyczne.

 Położenie maksimum/ów absorpcji dla danego chromoforu zależy od jego otoczenia chemicznego.

BADANIA STRUKTURALNE

Chromofor Przykład związku λ_max (nm)

C=C 1-heksen 180

-C≡C- 1-butyn 172

fenyl toluen 261, 206.5

C=O acetaldehyd

aceton kamfora

298, 182 275, 290

295

-COOH kwas octowy 204

(47)

UV/VIS

 Technika służy przede wszystkim stwierdzeniu obecności chromoforów w strukturze, zwłaszcza sprzężonych; np. fragmentów aromatycznych, dienów i polienów, ketonów α,ß-nienasyconych, etc.

 Widmo UV/VIS prezentuje stopień absorpcji izotropowego promieniowania elektromagnetycznego w funkcji długości fali.

 Metoda niewrażliwa na czynność optyczną, tj. widma enancjomerów tego samego związku są identyczne.

 Położenie maksimum/ów absorpcji dla danego chromoforu zależy od jego otoczenia chemicznego.

BADANIA STRUKTURALNE

Leworyna A1; λ_max (nm): 360, 378, 401

(48)

ORD (OPTICAL ROTATORY DISPERSION)

 Technika służy do badań stereostrukturalnych związków optycznie czynnych.

 Podstawą metody jest różnica we współczynnikach załamania światła spolaryzowanego kołowo w lewą i prawą stronę przechodzącego przez układ asymetryczny.

 Widmo ORD prezentuje skręcalność molową danego związku w funkcji długości fali.

BADANIA STRUKTURALNE

(49)

CD (CIRCULAR DICHROISM)

 Technika służy do badań stereostrukturalnych związków optycznie czynnych.

 Podstawą metody jest różnica w absorpcji światła spolaryzowanego kołowo w lewą i prawą stronę przez zaburzony chiralnie chromofor (efekt Cottona; Δε = ε_L - ε_R).

 Widmo CD prezentuje zazwyczaj różnicę molowego współczynnika absorpcji światła spolaryzowanego kołowo w lewo oraz w prawo danego związku w funkcji długości fali.

BADANIA STRUKTURALNE

(50)

BADANIA STRUKTURALNE

(51)

METODY SPEKTROSKOPOWE: RENTGENOGRAFIA STRUKTURALNA

Rentgenografia strukturalna bada zjawisko rozpraszania (ugięcia) promieni Röntgena przez kryształy i służy do ustalania koordynatów atomów należących do badanej struktury w trójwymiarowej przestrzeni.

Kryształ można potraktować jako nieskończony układ powtarzających się, identycznych kopii badanej molekuły, w którym – ze względu na symetrię kryształu oraz jednakową orientację cząsteczek w przestrzeni – występują powtarzające się regularnie płaszczyzny o dużej gęstości elektronowej, na których dochodzi do silnego ugięcia promieniowania X.

BADANIA STRUKTURALNE

(52)

Przy niektórych kątach padania promieniowanie rozproszone na kolejnych płaszczyznach sumuje się, dając tzw.

refleksy. Podczas pomiaru rejestruje się intensywności oraz kierunki refleksów w przestrzeni, przy czym obydwie te wielkości zależą od:

 symetrii i wielkości komórki elementarnej monokryształu;

 rozmieszczenia atomów w komórce elementarnej.

BADANIA STRUKTURALNE

(53)

W efekcie możliwe jest odtworzenie trójwymiarowej mapy gęstości elektronowej, wskazującej pozycje ciężkich atomów (atomy wodoru nie są obserwowane). Przy użyciu technik obliczeniowych, do uzyskanej mapy dopasowywana jest struktura badanej molekuły.

Rentgenografia strukturalna jest jedną z dwóch najważniejszych technik (obok NMR), która pozwala na ustalanie stereostruktur istotnych biologicznie cząsteczek.

BADANIA STRUKTURALNE

(54)

BIOGENEZA

Badanie biogenezy oznacza studia nad ścieżką biosyntezy danego związku przez organizm go produkujący.

Szlak metaboliczny składa się z szeregu reakcji katalizowanych przez enzymy. Są to te same reakcje, które jesteśmy w stanie zaobserwować w laboratorium chemicznym:

 utlenianie;

 redukcja;

 alkilowanie;

 hydroliza;

 addycja;

 eliminacja;

 inne.

Zasadnicza różnica polega na tym, że enzymy przyspieszają te reakcje od miliarda do biliona razy oraz wykazują dużą specyficzność w stosunku do substratu.

W reakcjach tych enzymom towarzyszą kofaktory i koenzymy. Specyficzność działania takiego układu polega na przestrzennym usytuowaniu substratu, kofaktora i koenzymu przy centrym aktywnym enzymu.

(55)

BIOGENEZA

Badania biogenezy – przykład:

Poliketydy to związki naturalne produkowane przede wszystkim przez bakterie, grzyby i porosty. Są prekursorami wielu metabolitów wtórnych i pochodzą od tzw. jednostki octanowej (reszty kwasu octowego, transportowanej przez koenzym A, tj. AcCoA). Biogeneza tych związków nie była znana do roku 1953, kiedy Birch wysunął hipotezę octanową. Później okazało się jednak, że do rozbudowy łańcucha poliketydowego potrzebne są również jednostki malonianowe.

W biosyntezie poliketydów można wyróżnić cztery etapy:

1) Rozbudowa łańcucha poliketydowego.

2) Ewentualne modyfikacje łańcucha – utlenianie, redukcja i alkilowanie.

H₃C

SCoA O

H₂C

SCoA O

CO₂^-

+ _CH

3CCH₂CSCoA

O O

+ CO₂

(56)

BIOGENEZA

Poliketydy to związki naturalne produkowane przede wszystkim przez bakterie, grzyby i porosty. Są prekursorami wielu metabolitów wtórnych i pochodzą od tzw. jednostki octanowej (reszty kwasu octowego, transportowanej przez koenzym A, tj. AcCoA). Biogeneza tych związków nie była znana do roku 1953, kiedy Birch wysunął hipotezę octanową. Później okazało się jednak, że do rozbudowy łańcucha poliketydowego potrzebne są również jednostki malonianowe.

W biosyntezie poliketydów można wyróżnić cztery etapy:

1) Rozbudowa łańcucha poliketydowego.

2) Ewentualne modyfikacje łańcucha – utlenianie, redukcja i alkilowanie.

3) Stabilizacja łańcucha poprzez cyklizację wewnątrzcząsteczkową.

4) Wtórne modyfikacje grup funkcyjnych.

O CH₃

O O

COSE -

H⁺

O O

COSE H₃C OH

- H₂O

O O

COSE CH₃

+ CoASH enolizacja

HO OH

COSCoA CH₃

HO OH

COOH CH₃

hydroliza

KWAS ORSELINOWY

(57)

BIOGENEZA

Skąd wiadomo, że tak to wygląda w rzeczywistości, a hipoteza octanowa nie jest jedynie hipotezą?

Widmo ¹³C NMR kwasu orselinowego:

(58)

BIOGENEZA

Szczep Penicillium, jeden z producentów kwasu orselinowego, został wyhodowany na pożywce wzbogaconej 1-¹³C octanem sodu.

Jeżeli proponowana ścieżka biosyntezy jest poprawna, izotopy węgla ¹³C powinny wbudować się w kwas orselinowy w pozycjach 2, 4, 6 oraz 8.

H₃C

SCoA O

H₂C

SCoA O

CO₂^-

+ _CH

3CCH₂CSCoA O O

+ CO₂

O CH₃

O O

COSE -

H⁺

O O

COSE H₃C OH

- H₂O

O O

COSE CH₃

+ CoASH enolizacja

HO OH

COSCoA CH₃

HO OH

COOH CH₃

hydroliza H₃C

SCoA O

H₂C

SCoA O

CO₂^- + ^-O₂C BCCP

* *

H₂C

SCoA O

CO₂^- +2 *

*

* *

*

* *

*

* *

*

* *

*

* * *

(59)

BIOGENEZA

*

(60)

BIOGENEZA

Obserwacje z widma ¹³C NMR:

 Cztery, dominujące sygnały od wbudowanych izotopów ¹³C. Znakowany był wyłącznie węgiel karbonylowy w octanie sodu.

 Przesunięcia chemiczne sygnałów rezonansowych odpowiadają przesunięciom chemicznym sygnałów węgli 2, 4, 6 oraz 8 w widmie nieznakowanego kwasu orselinowego.

Wnioski:

1. Kwas orselinowy składa się z czterech jednostek octanowych.

2. Wciąż jednak nie wiadomo, czy w biosyntezie może wziąć udział jednostka malonianowa, która została pobrana z otoczenia.

(61)

BIOGENEZA

Szczep Penicillium, jeden z producentów kwasu orselinowego, został wyhodowany na pożywce wzbogaconej 2-¹³C malonianem sodu.

Jeżeli proponowana ścieżka biosyntezy jest poprawna, izotopy węgla ¹³C powinny wbudować się w kwas orselinowy w pozycjach 1, 3 oraz 5.

H₃C

SCoA O

H₂C

SCoA O

CO₂^-

+ _CH

3CCH₂CSCoA O O

+ CO₂

O CH₃

O O

COSE -

H⁺

O O

COSE H₃C OH

- H₂O

O O

COSE CH₃

+ CoASH enolizacja

HO OH

COSCoA CH₃

HO OH

COOH CH₃

hydroliza

*

H₂C

SCoA O

CO₂^- +2 *

* *

*

* *

*

* *

*

* *

*

(62)

BIOGENEZA

*

(63)

BIOGENEZA

Obserwacje z widma ¹³C NMR:

 Trzy, dominujące sygnały od wbudowanych izotopów ¹³C. Znakowany był wyłącznie węgiel metylenowy w malonianie sodu.

 Przesunięcia chemiczne sygnałów rezonansowych odpowiadają przesunięciom chemicznym sygnałów węgli 1, 3 oraz 5 w widmie nieznakowanego kwasu orselinowego.

Wnioski:

1. Kwas orselinowy składa się z jednej jednostki octanowej oraz trzech jednostek malonianowych.

2. Szczep Penicillum syntezuje kwas orselinowy z takich substratów, jakie akurat ma pod nibynóżką.

(64)

DUUUŻO WIEDZY

EKOLOGIA CHEMICZNA

Ekologia chemiczna to stosunkowo młoda dziedzina nauki z pogranicza biologii i chemii, która bada chemiczne oddziaływania między organizmami żywymi oraz między organizmami i ich środowiskiem.

Ekologia chemiczna dotyczy przede wszystkim metabolitów wtórnych.

W idealnym schemacie badania związków naturalnych:

… na etapie badań ekologii chemicznej wracamy tak naprawdę do etapu obserwacji zjawiska, ale wyposażeni w mnóstwo wiedzy, której nie posiadaliśmy na początku.

Wiedza ta pozwala na wytłumaczenie ekologicznego sensu obserwowanego zjawiska; inaczej mówiąc:

poznajemy celowość produkcji danego metabolitu wtórnego.

OBSERWACJA

ZJAWISKA IZOLACJA IDENTYFIKACJA/

OKREŚLENIE

STRUKTURY BIOGENEZA EKOLOGIA

CHEMICZNA

(65)

EKOLOGIA CHEMICZNA

Ekologia chemiczna – przykłady:

Po wyizolowaniu, poznaniu struktury i przestudiowaniu biogenezy allicyny, związku odpowiedzialnego za bakteriobójcze właściwości czosnku, okazało się, że związek ten powstaje podczas miażdżenia ząbków czosnku (więcej informacji podczas kolejnych wykładów).

 Wniosek: allicyna pełni funkcję obronną, uruchamianą w przypadku fizycznego uszkodzenia rośliny.

Po przebadaniu kofeiny okazało się, że związek ten działa paraliżująco, a niekiedy zabójczo na owady żerujące na roślinach liściastych. Bardzo wysokie stężenie kofeiny zaobserwowano w rozwijających się liściach młodych roślin, a niekiedy nawet w glebie otaczającej kiełkującą roślinę.

 Wniosek: kofeina jest naturalnym pestycydem, który osiąga najwyższe stężenia w elementach rośliny pozbawionych ochrony mechanicznej, a także na wczesnym etapie rozwoju, kiedy roślina stanowi łatwy łup dla owadów.

(66)

EKOLOGIA CHEMICZNA

Ekologia chemiczna – przykłady:

Badania biogenezy i mechanizmu działania tetrahydrokannabinolu, substancji psychoaktywnej zawartej w liściach konopii, doprowadziła do odkrycia endokannabinoidów, nowego typu cząsteczek sygnałowych i neuroprzekaźników.

Zauważono ponadto, że THC świetnie absorbuje promieniowanie UV (więcej informacji podczas kolejnych wykładów).

 Wniosek: THC pełni prawdopodobnie funkcję obronną przed roślinożercami, polegającą na

„ogłuszeniu” spożywającego (!), a także – znowuż prawdopodobnie – funkcję ochronną przed nadmiarem promieniowania UV.

ZWIĄZKI BIOLOGICZNIE CZYNNE POCHODZENIA NATURALNEGO