B O C Z N I K I G L E B O Z N A W C Z E T . X X X V I I , N R 2— 3 , S . 3 7 & — 3 8 2 , W A R S Z A W A 1 9 8 6
BARBARA KOSINKIEWICZ
KOLA M IKROORGANIZM ÓW GLEBOW YCH W PROCESIE
W BUDOW YW ANIA SU BSTA N C JI KSENOBIOTYCZNYCH DO
PRÓ CH N ICY
Katedra M ikrobiologii Rolniczej A kadem ii Rolniczej w e W rocławiu
WSTĘP
S u b stan cjam i ksenobiotycznym i p rz y ję to określać związki, k tó re do
s ta ją się do gleby w w y n ik u celow ej działalności człowieka.
D rogi ich ro zkład u w glebie m ogą być bardzo różne. Podczas tw orze
n ia się próch n icy glebow ej w szystkie te zw iązki m ogą być w łączone do
gleby zarów no w w y n ik u jej enzym atycznej aktyw ności, jak i w sk u tek
abiotyczn y ch re a k c ji chem icznych tw orząc kom pleksy spolim eryzow a-
ny ch cząstek. O lbrzym ią rolę w ty ch rea k c ja c h odgryw ają m ikro organ iz
m y glebow e, zarów no grzyby, ja k R hizoctonia praticola, S ta ch y b o trys a t-
ra, S ta ch y b o trys chartarum , Epicoccum n ig ru m , A sperg illus niger [18],
prom ieniow ce (S trep to m yces) [16] i liczne b ak terie, przede w szystkim z
ro d za ju Pseudom onas [
8
, 9]. Je d n ą z najczęściej w y stęp u jący ch re a k c ji
w łączan ia się pesty cydó w i in n y ch zw iązków cfo próchnicy jest re a k c ja
sp rzęgan ia z rów noczesnym utlenian iem . J e st to proces, w k tó ry m fen o
le obecne w glebie łączą się z iinnymi zw iązkam i i są u tle n ia n e tw orząc
ligniny, m elaniny, czy alkaloidy [
2
]. R eakcje tego ty p u są katalizow an e
przez fenoloksydazy [17] lub zw iązki nieorganiczne, pn. przez chlorek
żelazowy, tle n e k m iedziow y [
2 1
], gleby ilaste [
22
], a ta k ż e przez e k stra k
ty z gleby [
20
] lub zachodzą w procesach sam outlen ian ia [
6
].
REAKCJE OLIGOMERYZACJI ZWIĄZKÓW KSENOBIOTYCZNYCH I WYSTĘPUJĄCYCH NATURALNIE FENOLI
W reak cjach u tle n ia n ia fenoli rdzenie aryloksy lub g ru p y OH tw orzą
się przez oderw anie e le k tro n u i jo nu wodorow ego w edług rea k c ji przed
staw io n ej n a ryc. [
1
].
3 7 e в . Kosinkiew icz О
Rye. 1. Sprzęganie z równoczesnym utlenianiem 2,6-dwum etoksyfenolu do 3,5-czte-ro-m etoksy-dwuchinonu
Fig. 1. Coupling w ith sim ultaneaus oxidation of 2.6_dimethoxyphenol to 3.5-tetra--m ethoxy-diquinone
W w y n ik u działania enzym ów glebow ych, n a p rzy k ła d lakazy, a ta k
że ek stra k tó w z gleby [4, 19] tw o rzy się wi^ele polim erów (tab. 1).
W yizolow ana fenoloksydaza z g rzyba Rhizoctonia praticola [4] pow o
dow ała u tlen ian ie k w asu w anilinow ego i syryngow ego, w an ilin y i orcy-
nolu tw orząc w iele oligom erów . P rzez polim eryzajcę gw ajakolu, jednego
ze składników ligniny, m ożna otrzym ać dużo oligom erów , począw szy od
dim erów do p en tam eró w (tab. 2). R eakcja p olim ery zacji g w ajak olu nie
zachodziła w ste ry ln y m ekstrak cie z gleby. Św iadczy to o olbrzym iej
roli m ikroorganizm ów glebow ych w tego ty p u reak cjach .
Podobne w y nik i jak Bollag, uzyskali także i inni [5], badając k a ta
lityczną oksydację gw ajakolu przez lakazę o trzym aną z k u ltu r N eu ro s-
pora crassa i z handlow ego p re p a ra tu peroksydazy.
R eakcje u tleniająceg o sprzęgania są także bardzo istotn e w procesie
w łączania się pestycydów i p ro d u k tó w ich p rzem ian do próchnicy
glebo-T a b e l a
1
r
Oligomery powstałe ze składników próchnicy po inkubacji z lakazą otrzymaną z kultur grzyba Rhizoctonia solani
Oligomers developed from humus compounds after incubation with lacase obtained from cultures of the Rhizoctonia solani fungus
Ciężar cząsteczkowy oligomerów Molecular mass of oligomers
dimer trimer tetramer i pentamer j hexamer Kwas wanilinowy Vanillic acid 290 ! ! 412 1 1 534 636 304 — — — — 334 456 578 700 — Wanilina — Vanillin 302 — — — — Orcynol — Orcinol 246 368 — — —
Kwas syryngowy — Syryngic acid 306 458 610 762 914
334 486 638 j 790 942
350 1 502 654 1 806 958
Drobnoustroje a substancje ksenobiotyczne 377 T a b e l a 2
Oligomery otrzymane po inkubacji gwajakolu i ekstraktu z gleby
Oligomers obtained after incubation of guajacol and extract from soil
Ciężary cząsteczkowe acetylowanych polimerów j
Molecular mass of acetylenated polymers
monomer dimer ! trimer i tetramer pentamer
166 i 288 j j ! 410 532 654 — 330 1 452 574 696 — — 1 494 616 738 — —
I
_
658 780w ej, na co w sk azu je bardzo bogata lite ra tu ra dotycząca tego problem u,
W ykazano [23], że znaczony w ęgiel w kw asie 2,4-dw uchlorofenoksy-octo-
w ym i w izo prop y lo-3-chlorofenylo-karbam inianie lub p ro d u k ty ich p rze
m ian, były w łączane do polim erów hum inopodobnych p ro duk ow any ch
przez grzyby. Stw ierdzono także [15], że in sek ty cy d m eto ksych lo r był
w łączany do m odelow ego kw asu hum inöw ego otrzym yw anego na drodze
sy ntety czn ej. Z badań w łasnych wiadom o, że h erb icy d venzar, pochodna
uracy lu , był w łączany do polim erów hum inopodobnych w y tw a rz an y c h
przez Pseudom onas acidovorans [11]. Także h erb icy d R oneet z karbom i-
nianów łączył się m ostkiem w odorow ym z kw asem p-h ydroksybenzoeso-
w ym [
12
].
REAKCJE SPRZĘGANIA POMIĘDZY FENOLAMI
J a k ustalono [3], dw a zw iązki fenolow e, a m ianow icie 2,4-dw uchloro-
fenol i 4-brom o-2-chlorofenol uleg ały h y b ry d y za c ji w obecności lakazy,
w yizolow anej z k u ltu r grzyb a Rhizoctonia praticola tw orząc p o lim er
Ryc. 2. Schemat reakcji sprzęgania 2,4-dwuchlorofenolu i 4-brom o-2-chlorofenolu z lakazą w ydzieloną z kultury R. praticola
Fig. 2. Schem e of the reaction of coupling 2.4-dichloxophenol and 4-brom o-2-chlo- rophenol w ith laccase secreted from the R. praticola culture
378
B. K osinkiew iczRyc. 3. Polim ery powstające w w yniku inkubacji kwasu syryngowego i 2,4-dwu- chlorofenolu w obecności lakazy w ydzielonej z kultury R : praticola
Fig. 3. Polym ers form ing in consequence of incubation of syryngic acid and 2.4-di- chlorophenol in presence of laccase secreted from the R. praticola culture
Rye. 4. Produkty kondensacji 3-chloroaniliny i 3,4-dwuchloraam liny Fig. 4. Products of condensation of 3-chloroaniline and 3.4-dichloroaniiline
Ryc. 5. Produkty hybrydyzacji 2,4-dwuchloroaniliny i dwóch chlorowanych chinonów
Fig. 5. Products of hybridization of 2.4-diohloroaniline and two chlorinated quinones
Drobnoustroje a substancje ksenobiotyczne 37 9
(ryc. 2). G dy do m ieszaniny rea g u jąc e j dodaw ano, oprócz 2,4-dw uchloro-
fenolu orcynol, k w as sy ry n go w y i w anilinow y lub w anilinę oraz lakazę,
w ydzieloną z k u ltu r grzyba, to następow ało tw orzenie się p o lim eru o
w yższym sto pniu polim eryzacji (ryc. 3).
REAKCJE SPRZĘGANIA ANILIN
J a k w ykazano w w ielu pracach, sprzęganie an ilin zachodzące w gle
bie prow adzi do po w stania pochodnych azobenzenu, szczególnie groźnych
zw iązków rakotw órczych [2]. W iadomo, że m ogą one p ow staw ać z 3,34-
-tró jchloro-4 -m ety lo-azo benzenu ,
uw anianego
z h e rb ic y d u p ro p an ilu
(am id kw asu propionow ego) oraz z k o nd en sacji dw uchloroanaliny, w edług
p rzed staw io n ej rea k c ji (ryc. 4). M echanizm tej re a k c ji nie został dotąd
w yjaśn ion y.
REAKICJE SPRZĘGANIA FENOLI I ANILIN
W edług w ielu p rac 2-4-dw uchlorofenol i in n e chlorow ane an ilin y
tw o rzą oligom ery (ryc. 5). Tw orzą się tu dw a ty p y polim erów : trim e r
złożony z fenoksychinonu sprzężonego
3
aniliną i trim e r złożony z jed n ej
cząsteczki chinonu i dw óch pierścieni aniliny. Stw ierdzono, że zw iązki te
p o w sta ją jedynie na drodze re a k c ji chem icznej, bez u d ziału enzym ów .
Je d n ak ż e 2,4-dw uchloroanilina in k u b o w an a w obecności lak azy i kw asu
w anilino wego d aje dużo trim e r ów i tetram e ró w . K w asy: ferulow y, sy ry n
gow y lu b p rotokatechow y, kom binow ane w obecności enzym u lakazy,
tw orzą rów nież w iele polim erów [
2
].
SPRZĘGANIE FENOLI Z INNYMI ZWIĄZKAMI CHEMICZNYMI
Tw orzenie się zw iązków hum inopodobnych przez kondensację aro m a
ty czn ych polifenoli z am inokw asam i i p e p ty d a m i w ykazano w w ielu p r a
cach. Stw ierdzono [7], że łączenie się am inokw asów z p e p ty d a m i i fe n o
lam i m a m iejsce podczas enzym atycznych procesów u tlen ian ia. Z syn te-
tyzow ano po lim ery z k atech olu i p-benzochinonu [13] w obecności tle n k u
sre b ra jako k ata liz a to ra w w y n ik u re a k c ji z am inokw asam i, p ep ty dam i
lu b pro teinam i. W tym p rzy p ad k u b y ły to reak cje abiotyczne [2].
ZNACZENIE REAKCJI SPRZĘGANIA ZWIĄZKÓW AROMATYCZNYCH WYSTĘPUJĄCYCH W GLEBIE
J a k wiadom o, zw iązki próchniczne gleby tw o rzą się w w y n ik u poli
m eryzacji fenoli reag u jący ch ze zw iązkam i azotow ym i pochodzącym i z
ro zk ład u białek. Z d rug iej stro n y zw iązki arom atyczne i ich pochodne w
380 B. K osinkiew icz
w y n ik u re a k c ji sprzęgania m ogą być także w budow yw ane do próchn icy
glebow ej. W praw dzie rozkład pró ch n icy zachodzi bardzo powoli, jed n a k
w w y nik u działalności m ikroorganizm ów u w alniane z niego zw iązki m o
gą być bardzo toksyczne i stanow ią pow ażne zagrożenie środow iska gle
bowego. D otyczy to zwłaszcza zw iązków aro m atycznych, pochodnych fe
noli, a także chinonów p o w stający ch w om ów ionych już procesach. Chi
nony m ogą pow odow ać pow ażne zakłócenia w m etabolizm ie am inokw a
sów u ludzi i zw ierząt, a także zm ieniają rozpuszczalność białek.
W prow adzane do gleby pestycy d y , a także gnojowice, zw iększają za
w artość kw asów fenolow ych w glebie [1, 10]. Jednakże biorąc pod u w a
gę olbrzym ie m ożliw ości ad ap tacji m ikroorganizm ów do środow iska i ich
znaczną liczebność, m ożem y m ieć nadzieję, że w prow adzane do gleby
p estycy d y i in ne zw iązki ksenobiotyczne ulegną rozłożeniu i pow olnej
d eto k sy k acji [14].
LITERATURA
[1] B a l i c k a N., K o s i n k i e w i c z B.: W pływ gnojow icy na drobnoustroje w glebie. Zesz. Nauk. AR 138, 1982, 201—21|1.
[2] B o 11 a g J. М.: Cross-coupling of humus cinstituents and xenobiotic substan ces. In: Aquatic and terrestial humic m aterials. Ed. by Russel F. Christoman Egil. T. Gjessing, Ann Arbor Sei. Publ. 1983> 12?—141.
[3] B o 1 l a g J. M., L i u S. Y., M i n a r d R. D.: Asym etrie, diphenol form ation by a fungal laccase. Appl. Envirom. Microb. 38, 1979, 90—92.
[4] B o l i a g J. M., S j o b l a d R. D., L i u S. Y.: Characterization of an enzym e from Rhizoctonia praticola w hich polymerizes phenolic compounds:. Can. Mi crob. 25, 1979, 229—233.
[5] G i e r i e r J. f O p a r a A. E.: Studies on the enzym atic degradation of lignin. The action of peroxidase and laccase on monomqtric and dimeric model com pounds. Acta Microb. Scand. 27, 1973, 2909—2922.
[6] H a i d e r K., M a r t i n J. P,'., F i l i p Z.: Soil Biochem istry. Vol. 4, Eds. E. A. Paul, A. D. Me Laren, New York, Marcel Dekker Inc., 1975, 195—244.
[71 H a i d e r K., F r e d e r i c k L. R.f F 1 a i g W.: R eactions between aminoacid compounds and phenols during oxidation. Plant and Soil 22, 1965, 49—64. [8] K o s i n k i e w i c z S.: H um ic-like substances of bacterial origin. I. Som e as
pects of the formationi and nature of hum ic-like substances produced by Pseu domonas. Acta Microb. Polon. 26, 1977, 4, 377—386.
[9] K o s i n k i e w i c z B.: A bility of Pseudomonas Sp. No. 26 and No. 4 to form humus like polymers. Rapport du 1er Colloque International: “Biodégradation et hum ification” 1974, 379—382.
[10] K o s i n k i e w i c z В.: Occurrence of phenolic acids in soil fertilized w ith li quid manure. In: Soil Biology and Conservation of Biosphere. Ed. J. Szegi, Akademiai Kiado, Hungary, 1981, 145—149.
[11] K o s i n k i e w i c z B.: Interaction of the phenolic m etabolites of the bacteria and som e pesticides^ I. Interaction betw een the phenolic compounds produced by Pseudomonas acjodovorans and the herbicide venzar. Acta Microb. Polon.
Drobnoustroje a substancje ksenobiotyczne 381 [12] K o s i n k i e w i c z B., W ę g r z y n T., P i e t r S.: The change of phytotoxicity
of the herbicide Roneet by the phenolic m etabolites of A rth robacter Sp. Acta Microb. Polon. 2, 1984.
£13] L a d d J. N., B u t l e r J. H. A.: Comparison of siome properties of soil humic acids and synthetic phenolic polymers incorporating amino derivatives. Aust. J. S. Soil Res. 4, 1966, 41—54.
[14] L u b c z y ń s k a J., K o s i n k i e w i c z B.: W pływ fluorantemu na niektóre procesy m ikrobiologiczne w glebie. M ateriały z Ogólnopolskiego Sympozjum: Wzajemne oddziaływ anie czynników fizycznych oraz chem icznych na drobno ustroje glebow e”. Lublin 1984, 13.
£15] M a r t h u r S. P., M o r 1 e y H. V.: Incerporation of m ethoxychlor Cu in model humic acids prepared from hydroquinone. Bull. Environ. Contam. Toxicol, 20) 1978, 268—274.
[16] M a t s c h k e J.: Ein Beitrag zur M um instoffsynthese durch S îrep to m yces aureus. Mitt. 1. Stroffw echselvorgange von S :reptom yces aureus. Ztrbl. Bakt.
Parasit. Infekt. Higiena, 1970, 85—125.
.[17] S j o b l a d R. D., B o l l a g J. M.: O xidative coupling of aromatic compounds by enzym esfrom soil microor.ganicmc. In: Soil Biochemistry, vol. 5, Eds. E. A. Paul and Ladd, NejW York, Marcel Dekker Inc., 1981, 113—152.
[18] S j o b 1 a d R. D.^ B o l l a g J. M.: O xidativ^ coupling of aromatic coumpounds by enzym es from soil microorganisms. In: Eoil Biochem istry. Vol. 5, Eds. E. A. Paul, J. N. Ladd, Marcel Dekker Inc. N ew York, Basel, 1981, 113— 152. [19] S u l f i t a J. M.: Oxidative coupling activity in soil extracts. Soil Biol.
Biochem. 12, 1980, 177^183.
[20] S u l f i t a J. M., B o l l a g J. M.: O xidative coupling activity in soil extracts: Soil Biol. Biochem. 12, 1980, 17?—183.
[21] T a y l o r W. J. In: O xidative coupling of phenols. Ed. by Brattersby E.f N aw York, Marcel Dekker Inc. 1967, 80—90.
[22] W a n g T. S. C., Li S. W., F e r n g Y. ,L.: Catalytic polim erizaticn of prenolic compounds by clay minerals. Soil Sei, 126, 1978, 15—21.
123] W o l f D. C., M a r t i n J. P.: D ecomposition of fungal m ycelina and humic type polymers containing carbon-14 from ring and side chain labelled 2, 4 D and chlorpropham. Soil Sei. Soc. Am. Proc. 40, 1976, 700—704.
Б. КОСИНКЕВИЧ РОЛЬ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПРОЦЕССЕ ВКЛЮЧЕНИЯ КСЕНОБИОТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ В ГУМУС Кафедра сельскохозяйственной микробиологии Сельскохозяйственной академии во Вроцлаве Р езю м е В ходе образования гумуса вносимые человеком ксенобиотические вещества могут включаться в почву в результате как энзиматической деятельности микроорганизмов, так и абиотических химических реакций, образуя комплексы полимеризованных частиц. Одним из наиболее часто встречаемых механизмов включения ксенобиотических веществ в гумус по выявляется реакция сопряжения в сочетании с одновременным окислением, ка тализованная фенолоксидазой бактерийного и растительного происхождения, а также не органическими соединениями, такими как феррохлорид или илистые минералы. Соединения особенно легко подвергающиеся реакции окисления с одновременным сопряжением явля
3 8 2 B. K osinkiew icz ются феноловые кислоты, такие как ванилиновая и сиринговая кислоты, а также ванилин, орциноль и гваяколь. Полимеризация указанных соединений происходящая при участии производимых микроорганизмами энзимов ведет к образованию многих олигомеров. По добно как природные феноли, также пестициды или продукты их распада могут включаться в почвенный гумус. Это касается особенно производных феноксиуксусной кислоты, карба- минатов, метаксихлора и хлористых анилинов. Сопряжение анилинов входящих в почву в результате разложения гербицида пропанила ведет к образованию производных азобен- зена, трудно разложимых, известных карциногенных соединений. К соединениям создавать серьезную угоозу для природной среды, образующимся путем реакции сопряжения в со четании с окислением принадлежит также полимеры со структурой хинонов. Они могут вызывать значительные нарушения в метаболизме аминокислот у людей и животных. Учитывая громадные возможности приспособления микроорганизмов к среде и их разрушительную деятельность по отношению к многочисленным химическим соединениям с соединениями ароматической структуры ввлючительно, можно надеяться, что ксенобио- тические соединения включаемые в почвенный гумус будет подвергаться постепенной де токсикации. В. KOSINKIEWICZ
ROLE OF SOIL MICROORGANISMS IN THE PROCESS OF INCORPORATION OF XENOBIOTIC SUBSTANCES INTO HUMUS
Departm ent of A gricultural M icrobiology, Agricultural U niversity of W roclaw
S u m m a r y ;
Xenobiotic substances can be incorporated during the humus form ation into soil, in consequence of both enzym atic activity of m icroorganism s and abiotic che m ical reactions, form ing the com plexes of polym erized particles.
One of the m echanism s of incorporation of xenobiotic compounds into soil hu mus, occurring most often, is the reaction of coupling connected w ith sim ultaneous oxidation, catalyzed by phenolooxidases of bacterial and vegetal origin as w ell as by inorgnic compounds, such s ferrum chloride or clay minerals. Phenolic acids, such as vanillic, syryngic acids^ as w ell as vanillin, orcinol and guajacol w ere found to react through oxid tive coupling particularly easily. Polym erization of the above compounds occurring at participation of enzym es produced by microorga nism s leads to the formation of m any oligomers. Also products of their decom po sition can be, like natural phenols, incorparated into soil humus. This concerns especially dervatives of phenoxyacetic acid, carbamates, m etoxychlor anod chrori- nated anilines. Coupling of aninilines released into soil during decomposition of the propany 1 herbicide leads to the form ation of hardly decomposable derivatives of azobenzene, known as carcinogenic substances. To the compounds constituting a danger for the natural envircm ent, form ing by the oxidative reaction, belong also polymers w ith the structure of quiinones. They can disturb the m etabolism of ami no acids in men and animals.
With regard to a considerable adaptation ab ility of microorganisms to the g i ven medium and their destructive activity in relation to m any chem icals, also tho se of aromatic structure, it could be expected that xenobiotic compounds incorpo rated into soil humus would undergo a gradual detoxication process.
Doc. dr hab. Barbara K osin kiew icz K atedra M ikrobiologii R oln iczej AR W roclaw, ul. G runw aldzka 53
