WSTÊP
Zmiany œródnab³onkowe ma³ego (LSIL – low grade squamous intra- epithelial lesion) i du¿ego stopnia (HSIL – high grade squamous intra- epithelial lesion), patomorfologicznie klasyfikowane jako zmiany przedno- wotworowe, reprezentuj¹ heterogen- n¹ jednostkê kliniczn¹, posiadaj¹c¹ ró¿norodny biologiczny potencja³ rozwojowy [1]. W przybli¿eniu po³o- wa zmian œródnab³onkowych ma³e- go stopnia zachowuje siê jak zmia- na ³agodna, czêsto ulegaj¹c spon- tanicznej regresji, podczas gdy druga po³owa posiada fenotyp
prawdziwie przednowotworowy, po- zostaj¹c zmian¹ przetrwa³¹, lub ule- gaj¹c¹ progresji do wy¿szych stop- ni patologii morfologicznej [2].
Kolposkopowe obserwacje rysun- ku naczyniowego oraz wczeœniejsze badania wspó³czynnika œredniej gê- stoœci mikronaczyñ w prawid³owym i patologicznym nab³onku szyjki ma- cicy [3] wyraŸnie wskazuj¹ na klu- czow¹ rolê angiogenezy w progre- sji zmian œródnab³onkowych i raka szyjki macicy [4].
Spoœród licznych bia³ek opisywa- nych jako czynniki proangiogenne, które bior¹ udzia³ w procesie two- rzenia nowych naczyñ, tylko VEGF, Badania wskazuj¹ na kluczow¹ rolê
angiogenezy w procesie progresji zmian œródnab³onkowych i raka szyj- ki macicy. Najwiêksze dzia³anie an- giogenne wykazuje VEGF. Znanych jest 6 izoform, które powstaj¹ na dro- dze alternatywnego dojrzewania mRNA: VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189oraz VEGF206. 119 bioptatów (43 wycinki nab³onka pra- wid³owego, 38 LSIL, 17 HSIL, 21 wy- cinki stanowi³ rak p³askonab³onkowy w stopniu zaawansowania kliniczne- go IB – IIB) szyjki macicy po ocenie patomorfologicznej poddano anali- zie molekularnej aktywnoœci trans- krypcyjnej VEGF (oznaczaj¹c iloœæ kopii mRNA/1 µg ca³kowitego RNA w badanej tkance) i wystêpowania typów alternatywnego sk³adania mRNA. Oceniano wzglêdne ryzyko progresji zmian nowotworowych w zale¿noœci od wystêpowania form alternatywnego sk³adania mRNA.
Aktywnoœæ transkrypcyjna VEGF w grupie HSIL by³a znamiennie wy¿- sza ni¿ w grupach LSIL i prawid³o- wych tkanek nab³onka, aktywnoœæ transkrypcyjna VEGF w grupie LSIL by³a znamiennie wy¿sza ni¿ w pra- wid³owych tkankach nab³onka. Nie zaobserwowano wzrostu aktywnoœci transkrypcyjnej VEGF w badanych wycinkach tkankowych raka szyjki macicy w porównaniu z grup¹ HSIL.
W zale¿noœci od stwierdzania izofor- my VEGF ryzyko progresji LSIL wy- nosi odpowiednio: dla VEGF121– 2,28, dla VEGF145 – 1,32, dla VEGF165– 1,53, dla VEGF183– 1,73, dla VEGF189 – 2,02, dla VEGF206– 1,45. W zale¿noœci od stwierdzania izoformy VEGF ryzyko progresji HSIL wynosi odpowiednio: dla VEGF121 – 8,94, dla VEGF189 – 12,95, dla VEGF206– 9,81. W zale¿- noœci od stwierdzania izoformy VEGF ryzyko progresji raka wynosi odpowiednio: dla VEGF121– 9,35, dla VEGF165 – 5,49, dla VEGF183– 4,46, dla VEGF189 – 3,58, dla VEGF206 – 21,29.
S³owa kluczowe: angiogeneza, rak szyjki macicy, SIL, VEGF121, VEGF145, VEGF156, VEGF183, VEGF189, VEGF206.
W
Wssppóó³³cczzeessnnaa OOnnkkoollooggiiaa ((22000033)) vvooll.. 77;; 44 ((228866––229933))
Ocena ryzyka progresji zmian œródnab³onkowych
i raka szyjki macicy w aspekcie wystêpowania typów
alternatywnego sk³adania mRNA VEGF – VEGF 121 , VEGF 145 , VEGF 165 , VEGF 183 , VEGF 189 , VEGF 206
Prognostic significance of occurrence of alternative splice mRNA VEGF forms – VEGF
121, VEGF
145, VEGF
165, VEGF
183, VEGF
189, VEGF
206in squamous intraepithelial lesions and cervical cancer
Bogdan Michalski
1, Urszula Mazurek
2, Adrian £ukasik
1, Anna Fila
2, Tadeusz Wilczok
2, Piotr Pordzik
1,
Ryszard Porêba
11 Katedra i Oddzia³ Kliniczny Ginekologii i Po³o¿nictwa w Tychach,
2Katedra Biologii Molekularnej, Biochemii i Biofarmacji w Sosnowcu, Œl¹ska Akademia Medyczna w Katowicach
obecny tylko w czasie trwania procesu angiogenezy,
nie wystêpuje, je¿eli w organizmie doros³ym aktualnie nie s¹ tworzo- ne nowe naczynia,
jego dzia³anie jest ograniczone œciœle do komórek œródb³onka na- czyniowego i bezpoœrednio wp³y- wa na ekspresjê jego receptorów,
jego nadekspresja zawsze wi¹¿e siê z powstaniem nowych na- czyñ,
neutralizowanie jego dzia³ania (przez naturalne lub syntetyczne inhibitory) lub poprzez zabloko- wanie funkcji przenoszenia sygna-
³u przez receptor zawsze hamuje powstawanie nowych naczyñ.
Gen VEGF, sk³adaj¹cy siê z 8 egzonów, zlokalizowano w pr¹¿ku 21.3 chromosomu 6, a jego region koduj¹cy zajmuje ob- szar ok. 14 kb [6]. Na drodze al- ternatywnego dojrzewania mRNA, doœæ powszechnie spotykanego zjawiska, polegaj¹cego na ró¿nico- wym wycinaniu intronów z cz¹- steczki premRNA, z pojedynczego genu powstaj¹ wszystkie izoformy bia³ka VEGF [7].
Znanych jest obecnie szeœæ izo- form tego bia³ka: VEGF121 [7], VEGF145 [8], VEGF165 [9], VEGF183 [10], VEGF189 [11], oraz VEGF206 [11] (liczby oznaczaj¹ iloœæ amino- kwasów tworz¹cych dane bia³ko).
Cz¹steczka mRNA wszystkich izo- form posiada eksony 1–5, zawiera- j¹ce informacjê wymagan¹ do roz- poznania specyficznych receptorów – VEGFR-1 (Flt-1) i VEGFR-2 (KDR/Flk-1), a ró¿nice dotycz¹ obec- noœci lub braku eksonów 6, 6’, 7 lub 8. Ekson 6 mo¿e wystêpowaæ w for- mie skróconej, jak to siê zdarza w izoformie VEGF183. Cz¹steczka mRNA izoformy VEGF206 zawiera wszystkie eksony i jako jedyna za- wiera ekson 6’. Pozosta³e izoformy VEGF s¹ pozbawione eksonu 6’, po- niewa¿ w trakcie obróbki pre-mRNA wykorzystywane jest alternatywne miejsce sk³adania eksonów w miej-
par zasad (co jest równowa¿ne 17 aminokwasom bia³ka), a VEGF183 powstaje na skutek odciêcia kolej- nych 18 par zasad z koñca 3’ eks- onu 6 licz¹cego 72 pary zasad.
Transkrypt VEGF165 nie ma w ogóle eksonu 6, transkrypt VEGF145 ekso- nu 7, a VEGF121 jednoczeœnie eks- onu 6 i 7 [12] (ryc. 1.).
W rodzinie izoform naczyniowo- -œródb³onkowego czynnika wzrostu VEGF121 jest najmniejszym, ca³kowi- cie rozpuszczalnym, s³abo kwaœnym bia³kiem, nie wi¹¿¹cym siê z hepa- ryn¹, o silnych w³aœciwoœciach mi- togennych i zwiêkszaj¹cych prze- puszczalnoœæ naczyñ [13].
W przeciwieñstwie do VEGF121 i VEGF165, VEGF145 wi¹¿e siê z b³on¹ podstawn¹, dlatego przed- stawia formê posiadaj¹cego odrêb- n¹ charakterystykê biologiczn¹.
Izoforma ta zawiera ekson 6, wa- runkuj¹cy mo¿liwoœæ wi¹zania siê z heparyn¹ podobnie, jak VEGF165, lecz biologicznie zachowuje siê jak VEGF121 [14].
VEGF165, podobnie jak VEGF121 jest zaliczana do czynników roz- puszczalnych. Niemniej poprzez fakt posiadania w swojej budowie domeny, kodowanej przez ekson 7, umo¿liwiaj¹cej wi¹zanie siê z hepa- ryn¹, nabywa ona nowych, specy- ficznych w³aœciwoœci [9].
mRNA VEGF183 ró¿ni siê od wiêkszej izoformy VEGF189 brakiem tylko 18 bp, a utrata tego fragment genomu ma wp³yw na ruchliwoœæ bia³ka w komórce i macierzy poza- komórkowej, przenoszenie sygna³u, zdolnoœæ wi¹zania heparyny, inte- rakcjê z innymi czynnikami wzrostu, aktywnoœæ mitotyczn¹ i wi¹zanie re- ceptorów [15].
W pe³nej d³ugoœci genu ekson 6 i 7 koduj¹ domeny kationowe, któ- ra nadaje izoformie VEGF189 aktyw- noœæ wi¹zania heparyny [6], radykal- nie kszta³tuj¹c kierunek dzia³ania, wy- raŸnie skierowany na elementy przestrzeni miêdzykomórkowej (ECM) stymuluj¹c w niej podzia³y komórek, cess of progression of cervical can-
cer. Largest proangiogenic working shows VEGF. Well-known is six iso- forms, which come into being mRNA: VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 as well as VEGF206on road of alternative ma- turation. 119 segments (43 seg- ments of proper epithelium, 38 LSIL, 17 HSIL, cervical cancer ma- de up 21 segments in degree of cli- nical advancement IB – IIB) were pathomorfological estimated and molecular analysis was surrende- red. Degree of expression VEGF was estimated (marking quantity of copy mRNA/1 µg RNA in studied tissue). Risk of cancer progression in aspect of occurrence of alterna- tive splice mRNA VEGF forms we- re estimated. VEGF transcriptive activity in HSIL group was ignifican- tly higher in comparison with group LSIL and proper tissues of epithe- lium groups, VEGF transcriptive ac- tivity in LSIL group was significan- tly higher in comparison with pro- per tissues of epithelium group.
Height of VEGF transcriptive activi- ty in studied tissues segments of cervical cancer were not observed.
In dependence from affirming iso- forms VEGF risk of progression LSIL carries out suitably: for VEGF121– 2.28, for VEGF145– 1.32, for VEGF165– 1.53, for VEGF183– 1.73, for VEGF189 – 2.02, for VEGF206 – 1.45. In dependence from affirming isoforms VEGF risk of progression HSIL carries out su- itably: for VEGF121 – 8.94, for VEGF189 – 12.95, for VEGF206 – 9.81. In dependence from affirming izoformy VEGF risk of progression of cervical cancer carries out suita- bly: for VEGF121– 9.35, for VEGF165
– 5.49, for VEGF183 – 4.46, for VEGF189 – 3.58, for VEGF206 – 21.29.
Key words: angiogenesis, cervical cancer, squamous intraepithelial le- sion, VEGF121, VEGF145, VEGF156, VEGF183, VEGF189, VEGF206.
fosforylacjê receptorów dla VEGF, wzrost wewn¹trzkomórkowego Ca2+, ekspresjê genów, migracjê ró¿nych elementów ECM [16].
VEGF206 jest jedyn¹ izoform¹ posiadaj¹c¹ w swoim sk³adzie wszystkie, kodowane przez gen VEGF eksony [7] i podobnie jak VEGF189 posiada miejsce silnie wi¹¿¹ce heparynê i w wyniku te- go jest izoform¹ zwi¹zan¹ z po- wierzchni¹ komórek [11]. Niewiele doniesieñ mówi o wystêpowaniu tej izoformy, a jeszcze mniej o ro- li, jak¹ spe³nia w procesie angio- genezy.
Celem przedstawionej pracy jest ocena wartoœci diagnostycznej wystê- powania poszczególnych typów alter- natywnego sk³adania mRNA VEGF – VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189, VEGF206 w prognozowaniu ryzyka progresji zmian œródnab³onko- wych i raka szyjki macicy.
MATERIA£ I METODY
Materia³ badawczy stanowi³o 119 wycinków tkankowych szyjki maci- cy zakwalifikowanych do nastêpu- j¹cych grup morfologicznych,:
I. grupa kontrolna (K) – 43 wycin- ki tkankowe pochodz¹ce z pra- wid³owej szyjki macicy,
II. grupa LSIL (LSIL) – 38 wycin- ków,
III. grupa HSIL (HSIL) – 17 wycin- ków,
IV. grupa raka p³askonab³onkowe- go w stopniu klinicznego za- awansowania IB – IIB (RAK) – 21 wycinków.
Materia³ tkankowy bezpoœrednio po pobraniu zamra¿ano do –70oC.
EKSTRAKCJA RNA
Po wstêpnym kruszeniu komórek w ciek³ym azocie z homogenatu ekstrahowano DNA i RNA przy za- stosowaniu zmodyfikowanej meto- dy wg Chomczyñskiego i Sachi [17], a nastêpnie wyznaczano stê-
¿enie kwasu nukleinowego w eks- trakcie technik¹ spektrofotometrycz- n¹ z zastosowaniem RNA/DNA kal- kulator Gene Quant LKB – Pharmacia Biotech.
ANALIZA AKTYWNOŒCI TRANSKRYPCYJNEJ GENU VEGF
Aktywnoœæ transkrypcyjn¹ bada- nych genów wyznaczano na pod- stawie analizy kinetyki reakcji QRT- PCR, w której matryc¹ by³y ekstrak- ty ca³kowitego RNA otrzymywane z wycinków tkanek. W pierwszej czêœci badañ projektowano reakcjê QRT-PCR dla badanych transkryp-
tów i produktów ich modyfikacji po- transkrypcyjnej. Sprawdzano empi- rycznie i optymalizowano zaprojek- towane reakcje oraz potwierdzano specyficznoœæ amplimerów technik¹ elektroforezy w ¿elu polakrylamido- wym, barwionym srebrem i metod¹ sekwencjonowania enzymatycznego.
Dla wszystkich zaprojektowanych re- akcji QRT-PCR przyjêto identyczne warunki termiczne oraz mieszaninê reakcyjn¹ ró¿ni¹c¹ siê tylko zesta- wem oligonukleotydów – starterów i sond wyznakowanych fluorochro- mami FAM i TAMRA. W drugim eta- pie wyznaczono liczby kopii mRNA badanych traskryptów w 1 µg ca³- kowitego mRNA badanego wycinka.
PROJEKTOWANIE SPECYFICZNYCH STARTERÓW I SOND
STOSOWANYCH W REAKCJI QRT-PCR DLA MRNA VEGF
Sekwencjê nukleotydów starte- rów oraz sond dla reakcji RT- QPCR zaprojektowano na podsta- wie programu komputerowego Pri- mer ExpressTM Version 1.0 ABI PRISM, na podstawie sekwencji badanych genów pochodz¹cych z bazy danych Gen Bank (http://www.ncbi,nlm.nih.gov/irx/gen- bank). Korzystaj¹c z bazy danych
Ryc. 1. Struktura bia³ka VEGF206powstaj¹cego w wyniku po³¹czenia wszystkich eksonów mRNA VEGF z zaznaczeniem miejsc aktywnych, wi¹¿¹cych receptory i inne czynniki wp³ywaj¹ce na specyficznoœæ biologiczn¹ bia³ka w œrodowisku wewn¹trz- i zewn¹trzkomórkowym (AK – liczba aminokwa- sów kodowanych przez dany ekson)
e ekkssoonnyy
2 266 AAKK
1 1
1
1.. 22.. 33.. 44.. 55.. 66.. 77.. 88.. 99..
2
2 33 44 55 66 77 88 99
2
244 AAKK 1177 AAKK 4444 AAKK 66 AAKK 1
11155 AAKK
1. sekwencja sygna³owa 2. n-koniec bia³ka 3. miejsce dimeryzacji
4. miejsce wi¹zania vegfr-1 5. n-glikozylacja 6. miejsce wi¹zania VEGFR-2 7. aktywacja plazminogenu 8. miejsce wi¹zania heparyny 9.miejsce wi¹zania neuropliliny
Wspó³czesna Onkologia
288
VERSION BLASTN 2.0.11 porówna- no kolejnoœæ nukleotydów genu VEGF, znalezione pod numerem dostêpu – accession – NM_003376 (266), M63978.
SEKWENCJONOWANIE AMPLIMERÓW
Ostatnim etapem sprawdzenia specyficznoœci zaprojektowanych re- akcji QRT-PCR, umo¿liwiaj¹cych de- tekcjê produktów modyfikacji po- transkrypcyjnej mRNA VEGF, by³o sekwencjonowanie produktów am- plifikacji prowadzone metod¹ San- gera [18]. Amplifikacjê sekwencyj- n¹ prowadzono z zastosowaniem dideoksynukleotydów wyznakowa- nych odpowiednio: ddATP barwni- kiem dichloro[R6G], ddCTP barwni- kiem dichloro[ROX], ddGTP barwni- kiem dichloro[R110] i ddTTP barwnikiem dichloro[TAMRA] w ter- mocyklerze GeneAmp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer. Nastêpnie otrzymane produkty rozdzielono przy u¿yciu automatycznego analizatora sekwencji ABI PRISMTM 310. i zanali- zowano stosuj¹c program DNA Se- quencing Analysis SoftwareTM Version 3.7. Kolejne etapy sekwencjonowa- nia przeprowadzano zgodnie z zale- ceniem protoko³u do³¹czonego do zestawu odczynników sekwencyjnych zalecanych przez firmê Perkin Elmer.
mRNA TECHNIK¥ QRT – PCR Otrzymany w ekstrakcji RNA sta- nowi³ matrycê w reakcji Q-RT-PCR prowadzonej jednostopniowo z za- stosowaniem termostabilnego enzy- mu Tth. Wprowadzenie jonów Mg2+
i Mn2+ do mieszaniny reakcyjnej w odpowiednich proporcjach umo¿- liwi³o wykonanie reakcji QRT-PCR w jednej probówce, w mieszaninie reakcyjnej zawieraj¹cej 1x Tth PCR Buffor zawieraj¹cy fluorochrom za- pewniaj¹cy odpowiednie t³o dla po- miaru fluorescencji po ka¿dym cyklu termicznym QRT-PCR, 3mM MgCl2, 400 µM. dATP, 400 µM. dTTP. 400 µM. dGTP, 400 µM. dCTP, 1 x wzmacniacz reakcji PCR, 0,5 µM MnSO4, 0,3 µM starter 1 i starter 2, 0,2 µM sondy wyznakowanej flu- orochromami FAM i TAMRA, 1–10 µg ca³kowitego RNA, 2.5 U polimerazy DNA Tth. Reakcjê Q-RT-PCR wyko- nywano z zastosowaniem detektora sekwencji ABI PRISMTM 7700.
WYNIKI
Zaobserwowane wielkoœci maksy- malne VEGF121, VEGF145, VEGF165 i VEGF183 w prawid³owej strefie re- generacji nie przekracza³y wartoœci 1 x 103 kopii mRNA/1 µg ca³kowite- go RNA. Jedynie VEGF189 i VEGF206 charakteryzowa³y siê podwy¿szony- mi wartoœciami w granicach nawet
Najczêœciej wystêpuj¹c¹ izoform¹ by³a VEGF145, któr¹ zarejestrowano w 53,49 proc. wszystkich wycinków pochodz¹cych z prawid³owej szyjki macicy (ryc. 2A.). W 1/4 wszystkich przypadków grupy kontrolnej stwier- dzono wystêpowanie VEGF165 (25,58 proc.) (ryc. 2A.) i VEGF206 (25,58 proc.) (ryc. 2B.).
Aktywnoœæ transkrypcyjna VEGF w grupie LSIL by³a znamiennie wy¿- sza od grupy kontrolnej (p <0,05), a jedynie iloœæ kopii mRNA VEGF206 nie ró¿ni³a siê znamiennie w porów- naniu do grupy kontrolnej (ryc. 2B.).
W grupie LSIL znamiennie czêœciej zaobserwowano obecnoœæ VEGF121 (p <0,001; Chi2Pearsona = 12,3) (ryc.
2A.) oraz VEGF189 (p <0,05;
Chi2Pearsona = 9,14) w porównaniu do grupy kontrolnej, a w przypadku po- zosta³ych izoform nie potwierdzono statystycznie istotnych ró¿nic w czê- stoœci wystêpowania (ryc. 2B.).
Grupa HSIL charakteryzowa³a siê najwy¿sz¹ aktywnoœci¹ transkryp- cyjn¹ genu VEGF i jakkolwiek zare- jestrowane niektóre wartoœci mak- symalne by³y porównywalne z gru- p¹ LSIL, to niemniej liczba kopii mRNA poszczególnych izoform VEGF w wiêkszoœci badanych przy- padków mieœci³a siê w zakresie wartoœci maksymalnych ró¿ni¹c siê znamiennie od zaobserwowanych w grupie kontrolnej (p <0,001)
Tab. Ryzyko wzglêdne progresji zmiany œródnab³onkowej ma³ego stopnia (LSIL), du¿ego stopnia (HSIL) i raka szyjki macicy w stopniu klinicznego zaawansowania IB – IIB w zale¿noœci od pojawienia siê formy alternatywnego sk³adania mRNA VEGF – VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189, VEGF206
L
LSSIILL HHSSIILL rraakk ggrruuppaa kkoonnttrroollnnaa ((NN == 3388)) ((NN == 1177)) ((NN == 2211)) ((NN== 4433)) n
n ((pprroocc..)) RRWW nn ((pprroocc..)) RRWW nn ((pprroocc..)) RRWW nn ((pprroocc..)) V
VEEGGFF112211 15 (39) 2,28 13 (76) 8,94 17 (81) 9,35 3 (7)
V
VEEGGFF114455 25 (66) 1,32 17 (100) – 21 (100) – 23 (53,5)
V
VEEGGFF116655 17 (45) 1,53 17 (100) – 17 (81) 5,49 11 (25,6)
V
VEEGGFF118833 16 (42) 1,73 17 (100) – 15 (71) 4,46 8 (18,6)
V
VEEGGFF118899 18 (47) 2,02 15 (88) 12,95 13 (62) 3,58 7 (16,3)
V
VEEGGFF220066 16 (42) 1,45 15 (88) 9,81 20 (95) 21,29 11 (25,6)
N РliczebnoϾ grupy,
n – liczba przypadków z badanym czynnikiem ryzyka, RW – ryzyko wzglêdne
Wspó³czesna Onkologia
290
Ryc. 2A. i B. Porównanie procentowego rozk³adu aktywnoœci transkrypcyjnej genu VEGF w przedzia³ach do 1 000, 1 000 – 10 000 i powy¿ej 10 000 kopii mRNA VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189, VEGF206 w 1 µµg ca³kowitego RNA w grupie kontrolnej (K), LSIL, HSIL i raka szyjki macicy
100 proc.
90 proc.
80 proc.
70 proc.
60 proc.
50 proc.
40 proc.
30 proc.
20 proc.
10 proc.
0 proc.
brak ekspresji
<1 000 1 000–10 000
>10 000
K LSIL HSIL RAK K LSIL HSIL RAK K LSIL HSIL RAK
VEGF-121 VEGF-121 VEGF-121 VEGF-121 VEGF-145 VEGF-145 VEGF-145 VEGF-145 VEGF-165 VEGF-165 VEGF-165 VEGF-165
40 23 4 4 20 13 32 21 4
2 8 4 5 14 10 1 10 9 9 8 11
1 3 6 8 9 9 2 4 3 1 2
4 3 4 6 14 7 2 5 8 4
100 proc.
90 proc.
80 proc.
70 proc.
60 proc.
50 proc.
40 proc.
30 proc.
20 proc.
10 proc.
0 proc.
brak ekspresji
<1 000 1 000–10 000
>10 000
A
B
K LSIL HSIL RAK K LSIL HSIL RAK K LSIL HSIL RAK
VEGF-183 VEGF-183 VEGF-183 VEGF-183 VEGF-189 VEGF-189 VEGF-189 VEGF-189 VEGF-206 VEGF-206 VEGF-206 VEGF-206
35 22 6 36 20 2 8 32 22 2 1
5 9 3 9 3 9 6 5 6 7 6 10
1 1 2 1 1 1 2 5 3
3 6 13 4 3 8 9 7 3 4 9 7
HSIL zaobserwowano czêstsze wy- stêpowanie mRNA VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189, VEGF206, w porównaniu z grup¹ kontroln¹ (p <0,001) i LSIL (p <0,05) (ryc. 2A. i B.).
Wbrew oczekiwaniom, nie zaob- serwowano wzrostu aktywnoœci transkrypcyjnej VEGF w wycinkach tkankowych raka szyjki macicy, a w niektórych przypadkach by³a ni¿sza od grupy HSIL (ryc. 2A. i B.).
Obserwacja zakresu wartoœci mi- nimalnych i maksymalnych wykaza-
³a podobieñstwo do grupy HSIL, aczkolwiek wykazano statystycznie znamienne ró¿nice w porównaniu z grup¹ kontroln¹ i LSIL (p <0,001).
Czêstoœæ wystêpowania poszczegól- nych izoform VEGF by³a identyczna jak w grupie HSIL, a jedynie mRNA VEGF183by³o znamiennie czêœciej re- jestrowane ni¿ w grupie HSIL (p < 0,05; Chi2Pearsona = 5,8) (ryc.
2B.).
W sposób bezpoœredni w bada- niu prospektywnym oceniono ryzy- ko wzglêdne progresji zmian mor- fologicznych w zale¿noœci od wy- stêpowania formy alternatywnego sk³adania mRNA VEGF (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189, VEGF206). W przypadku stwierdzenia mRNA VEGF121 w sto- sunku do grupy kontrolnej ryzyko progresji LSIL bêdzie 2,28 razy wy¿sze (RW = 2,28±1,56; 95 proc.
= 0,78 – 5,34) i podobnie w przy- padku VEGF189 (RW = 2,02±1,06;
95 proc. = 0,06 – 4,09), podczas gdy dla VEGF145, VEGF165, VEGF183 i VEGF206 ryzyko to wzrasta niewie- le i mieœci siê w zakresie – RW = 1,32 – 1,73 (tabela).
W przypadku stwierdzenia wystê- powania mRNA izoformy VEGF121 w wycinku z cechami morfologicz- nymi zmiany œródnab³onkowej du-
¿ego stopnia (HSIL), wzglêdne ry- zyko progresji do form bardziej za- awansowanych bêdzie 10-krotnie wy¿sze ni¿ w przypadku niewystê- powania tej izoformy w badanym materiale tkankowym (RW =
Podobnie w przypadku VEGF189 (12,95±11,12 (95 proc. = 8,85 – 34,76), oraz VEGF206 ryzyko wzra- sta 9,81±8,14 (95 proc. = 6,15 – 25,76) (tabela).
W raku p³askonab³onkowym szyjki macicy najwy¿sz¹ wartoœæ ryzyka wzglêdnego progresji w za- le¿noœci od wystêpowania form al- ternatywnego sk³adnia mRNA VEGF stwierdzono w przypadku VEGF206, który powoduje wzrost ry- zyka 21-krotnie (RW = 21,29±23,05;
95 proc. = 23,89 – 66,47) w sto- sunku do przypadku braku obecno- œci mRNA tej izoformy w badanej tkance (tabela). W przypadku stwierdzenia obecnoœci mRNA VEGF121 w stosunku do grupy po- równawczej ryzyko progresji jest 9- krotnie wy¿sze (RW = 9,35±7,64;
95 proc. = 5,62 – 24,32) i podob- nie w przypadku VEGF145 (RW = 9,77±10,45), VEGF165 (RW = 5,45), VEGF183 (RW = 4,46) i VEGF189 (RW = 3,58).
OMÓWIENIE
Wzrastaj¹ca liczba publikacji do- wodzi, ¿e raczej wzajemny stosunek izoform VEGF, a nie ca³kowity VEGF jest odpowiedzialny za angiogene- zê, tak w procesach fizjologicznych, jak i stanach patologicznych [19–22]. Niedosyt z fragmentarycz- nej wiedzy na temat roli tych izo- form w strefie regeneracji pog³êbia fakt niezwykle wa¿nego znaczenia tego miejsca, charakteryzuj¹cego siê podwy¿szonym potencja³em pro- liferancyjnym komórek znajduj¹cych siê w tej strefie [24] w inicjacji raka szyjki macicy [23], charakteryzuj¹- cego siê podwy¿szonym potencja-
³em proliferacyjnnym komórek znaj- duj¹cych siê w tej strefie [24].
W prawid³owej szyjce macicy stwierdzono w tej pracy wystêpo- wanie wszystkich szeœciu typów mRNA (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 i VEGF206), któ- rych ró¿nice w ekspresji, oraz cha- rakterystycznych uk³adów jednocze- œnie wystêpuj¹cych ró¿nych form
doczne, zw³aszcza wy¿sze wartoœci w aktywnoœci izoform VEGF145, VEGF189 i VEGF206, co mo¿e mieæ zwi¹zek z wczeœniejszymi obserwa- cjami zwiêkszonego potencja³u pro- liferacyjnego nab³onka metapla- stycznego w strefie regeneracji szyj- ki macicy i prawdopodobnym wp³ywem na intensyfikacjê angioge- nezy w³aœnie w tym miejscu.
Zaobserwowana w tym ekspery- mencie ekspresja izoformy VEGF145, która zachowuje siê podobnie jak VEGF121 i VEGF165, wi¹¿¹c siê z b³on¹ podstawn¹ wskazuje na ro- lê tej izoformy w fizjologicznych procesach modelowania podnab³on- kowej sieci naczyniowej w struktu- rach l¹cznotkankowych.
Fakt ten, wraz z zaobserwowan¹ dominuj¹c¹ ekspresj¹ izoformy VEGF206, która w swoich w³aœciwo- œciach charakteryzuje siê aktywnym dzia³aniem w przestrzeni miêdzyko- mórkowej, mo¿e sugerowaæ, ¿e za- obserwowana aktywnoœæ transkryp- cyjna i charakterystyczny uk³ad form alternatywnego sk³adania mRNA VEGF moduluje w podœcie- lisku nab³onkowym ju¿ istniej¹c¹ prawid³ow¹ sieæ naczyniow¹, która w ten sposób dostosowuje siê do formuj¹cego siê nab³onka wielowar- stwowego p³askiego z jednowar- stwowego gruczo³owego w proce- sie metaplazji. Te 2 fakty mog¹ tak-
¿e stanowiæ hipotezê wystêpowania fizjologicznego zjawiska autokrynnej stymulacji proliferacji komórek œród- b³onka naczyñ podœcieliska [25].
Spoœród nielicznych prac badaw- czych, przedstawiaj¹cych wystêpo- wanie poszczególnych form alter- natywnego sk³adania VEGF zwraca uwagê wynik analizy Fujimoto i wsp. w raku szyjki macicy, którzy w badanych wycinkach kontrolnych (prawid³owa szyjka macicy) nie stwierdzili obecnoœci VEGF189 i VEGF206, a ekspresjê wykaza³a izoforma VEGF121 i VEGF165 [26].
Niemniej wyniki te s¹ trudne w po- równaniu ze wzglêdu na ró¿nice metodologiczne i zakres badanych izoform jednoczeœnie.
292
Wspó³czesna OnkologiaW przeprowadzonym badaniu stwierdzono wy¿sze wartoœci aktyw- noœci transkrypcyjnej VEGF w bada- nych wycinkach zmian œródnab³on- kowych ma³ego stopnia w porówna- niu z grup¹ kontroln¹ i jedynie liczba kopii mRNA VEGF206 by³a ta- ka sama w obu porównywanych grupach, co mo¿e sugerowaæ pro- sty wniosek o znacz¹cym wp³ywie wzrostu aktywnoœci pozosta³ych izo- form VEGF na proces progresji LSIL.
Dalsza obserwacja wzajemnych za- le¿noœci aktywnoœci transkrypcyjnej i czêstoœci wystêpowania form alter- natywnego sk³adania mRNA VEGF nie potwierdzaj¹ tej hipotezy i ocena wzglêdnego ryzyka progresji LSIL dla VEGF145, VEGF165, VEGF183 i VEGF206 wskaza³a brak wp³ywu podwy¿szonych wartoœci iloœci mRNA tych izoform na wzrost stop- nia patologii morfologicznej. Jedynie dwie izoformy VEGF121 i VEGF189 znamiennie czêœciej pojawia³y siê w badanej patologii morfologicznej w porównaniu ze zdrow¹ szyjk¹ ma- cicy i wykazywa³y niewielki wzrost wzglêdnego ryzyka progresji tych zmian.
Interesuj¹cym faktem jest poja- wienie siê wiêkszej liczby kopii mRNA tak odmiennych we w³aœci- woœciach i miejscach dzia³ania izo- form jakimi s¹ VEGF121, uwa¿anej za g³ówny czynnik mitogenny ko- mórek œródb³onka [27] i VEGF145 maj¹cej g³ówne dzia³anie skierowa- ne na macierz œródkomórkow¹ [11].
Obserwacja ta wskazuje na istot- ny fakt ma³ego potencja³u angio- gennego oraz proliferacyjnego LSIL i jest zgodna z obserwowanymi ce- chami samoistnej regresji tych przy- padków [1, 2, 28, 29].
Ocena ryzyka wzglêdnego pro- gresji zmiany œródnab³onkowej du-
¿ego stopnia wskaza³a na 3 izofor- my – VEGF121, VEGF189 i VEGF206 podwy¿szaj¹ce znacz¹co to ryzyko, jakkolwiek wszystkie izoformy cha- rakteryzowa³y siê wy¿sz¹ aktywno- œci¹ i czêstszym wystêpowaniem w porównaniu z LSIL i grup¹ kon- troln¹. Dominacja izoformy krótkiej VEGF121 przyczyniaj¹cej siê do roz-
woju angiogenezy poprzez wzrost przepuszczalnoœci naczyñ krwiono- œnych i wzrost proliferacji komórek œródb³onka, oraz jednoczesna obec- noœæ izoform d³ugich, takich jak VEGF189 i VEGF206 wskazuje na pe³- ne zaanga¿owanie genów w induko- wanie procesu angiogenezy, które- go fenotyp wyra¿ony jest morfolo- gicznym obrazem zwiêkszonej liczby mikronaczyñ w podœcielisku zmiany.
Dobbs i wsp. zaobserwowali wy- raŸn¹ korelacjê pomiêdzy wspó³- czynnikiem œredniej gêstoœci mikro- naczyñ podœcieliska, a ekspresj¹ VEGF w badaniu immunohistoche- micznym 70 wycinków prawid³owej szyjki macicy, zmian œródnab³onko- wych (LSIL, HSIL) i raka inwazyjne- go [30]. Równie¿ badania Oberma- ira i wsp. w grupie 83 przypadków CIN I – CIN III [3], jak i Guidiego i wsp. 66 kobiet w grupach prawi- d³owej szyjki macicy, LSIL, HSIL i raka inwazyjnego [4] wskazuj¹ zgodnie, ¿e najwiêksze nasilenie procesu angiogenezy (maksymalne wartoœci wspó³czynnika œredniej gê- stoœci mikronaczyñ i ekspresji VEGF) wystêpuje w grupie patolo- gii œródnab³onkowej du¿ego stop- nia. Tym samym stawia hipotezê,
¿e analiza ekspresji genu VEGF, oraz wystêpowanie form alternatyw- nego sk³adania mRNA powinno po- zwoliæ na okreœlenie fenotypu an- giogennego – z³oœliwego – komó- rek, pozwalaj¹cego na ocenê ryzyka progresji zmian œródnab³on- kowych i raka szyjki macicy.
Porównanie wyników aktywnoœci transkrypcyjnej genów VEGF grupy kobiet choruj¹cych na raka szyjki macicy w stopniu klinicznego za- awansowania IB-IIB z grup¹ kontro- ln¹ oraz zmian œródnab³onkowych ma³ego i du¿ego stopnia, zwraca uwagê podobieñstwo ekspresji ge- nu VEGF w grupach kobiet z roz- poznanym rakiem p³askonab³onko- wym szyjki macicy i zmian¹ œródna- b³onkow¹ du¿ego stopnia, które mo¿e wskazywaæ na pewne grani- ce ekspresji tego genu w zmianie patologicznej i prawdopodobny fakt udzia³u poszczególnych izoform ra-
czej w procesie przygotowania pod- œcieliska do procesu powstawania przerzutów odleg³ych, a nie w sa- mym procesie proliferacji i wzroœcie masy guza. Obserwacja ta ma pew- ne potwierdzenie w pracach badaw- czych porównuj¹cych wspó³czynnik gêstoœci mikronaczyñ w podœcieli- sku guza a stanem klinicznym ba- danych chorych [31, 32].
Wszystkie warianty alternatywne- go sk³adania VEGF indukuj¹ angio- genezê i pytanie – dlaczego a¿
szeœæ izoform VEGF jest wytwarza- nych – w aspekcie przeprowadzo- nego badania znajduje czêœciowe wyt³umaczenie i jednoczeœnie wyty- cza dalsze kierunki badawcze w po- znaniu angiogenezy nowotworów.
PIŒMIENNICTWO
1. Östör AG. Natural history of cervical intraepithelial neoplasia: a critical re- view. Int J Gynecol Pathol 1993; 12:
186-92.
2. Mitchell MF, Hittelman WN, Hong WK, Lotan R, Schottenfeld D. The natural history of cervical intraepithelial neopla- sia: an argument for intermediate end- point biomarkers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1994; 3: 619-26.
3. Obermair A, Bancher-Todesca, Bilgi S, Kaider A, Kohlberger P, Müllauer- Ertl S, Leodolter S, Gitsch G. Corre- lation of vascular endothelial growth factor expression and microvessel den- sity in cervical intraepithelial neoplasia.
J Natl Cancer Inst 1997; 89: 1212-7.
4. Guidi AJ, Abu-Jawdeh G, Berse B, Jackman RW, Tognazzi K, Dvorak HF, Brown LF. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) expression and angiogenesis in cervi- cal neoplasia. J Natl Cancer Inst 1995; 87: 1237-45.
5. Risau W. What, if anything, is an an- giogenic factor? Cancer Metastasis Rev 1996; 15: 149-51.
6. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angio- genesis. Kidney Int 2001; 56: 794- 814.
7. Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. J Mol Med. 1999; 77:
527-43.
8. Poltorak Z, Cohen T, Sivan R, Kande- lis Y, Spira G, Vlodavsky I, Keshet E, Neufeld G. VEGF145 a secreted va- scular endothelial growth factor iso- form that binds to extracellular matrix.
J Biol Chem 1997; 272: 7151-8.
Claesson-Welsh L, Janjiæ N. 2'-fluoro- pirimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endo- thelial growth factor (VEGF165). Inhibi- tion of receptor binding and VEGF-ind- uced vascular permeability through in- teractions requiring the exon
7-encoded domain. J Biol Chem 1998; 273: 20556-67.
10. Lei J, Jiang, Pei D. Identification and characterization of a new splicing va- riant of vascular endothelial growth factor: VEGF183. Biochim Biophys Acta 1998; 1443: 400-6.
11. Grützkau A, Krüger-Krasagakes S, Baumeister H, et al. Synthesis, stora- ge and release of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF) by human mast cells: implications for biological signifi- cance of VEGF206. Mol Biol Cell 1998;
9: 875-84.
12. Loch T, Michalski B, Mazurek U, Gra- niczka M. Naczyniowo-œródb³onkowy czynnik wzrostu (VEGF) i jego rola w procesie nowotworowym. Post Hig Med Doœw 2001; 55: 257-74.
13. Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor.
Endocrin Rev 1997; 18: 4-25.
14. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S, Poltorak Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors.
FASEB J 1999; 13: 9-22.
15. Jingjing L, Xue Y, Agarwal N, Roque RS. Human Müller cells express VEGF183, a novel spliced variant of va- scular endothelial growth factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 752-9.
16. Claffey KP, Robinson GS. Regulation of VEGF/VPF expression in tumor cells:
Consequences for tumor growth and metastasis. Cancer Metastasis Rev 1996; 15: 165-76.
17. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guani- dinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987; 162:
156-9.
18. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR.
DNA sequencing with chain-termina- ting inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5463-7.
19. Tokunaga T, Oshika Y, Abe Y, et al.
Vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA isoform expression pat- tern is correlated with liver metastasisn and poor prognosis in colon cancer.
Brit J Cancer 1998; 77: 998-1002.
expression pattern of vascular endo- thelial growth factor isoforms in the ma- lignant transformation of lung and co- lon. Hum Pathol 1998; 29: 910-4.
21. Tomisawa M, Tokunaga T, Oshika Y, et al. Expression pattern of vascular endothelial growth factor isoform is clo- sely correlated with tumour stage and vasularisation in renal cell carcinoma.
Eur J Cancer 1999; 35: 133-7.
22. Lee YH, Tokunaga T, Oshika Y, et al.
Cell-retained isoforms of vascular en- dothelial growth factor (VEGF) are cor- related with poor prognosis in oste- osarcoma. Eur J Cancer 35, 1089-93.
23. Elson DA, Riley RR, Lacey A, Thor- darson G, Talamantes FJ, Arbeit JM.
Sensitivity of the cervical transforma- tion zone to estrogen-induced squamo- us cercinogenesis. Cancer Res 2000;
60: 1267-75.
24. Soini Y, Pöllänen R, Kemppainen S, Pääkö P, Lehto V-P. The association of vascular proliferation with HPV status and epithelial PCNA positivity in cervi- cal intraepithelial lesions. APMIS 1996; 104: 183-90.
25. Folberg R, Hendrix MJC, Maniotis AJ. Vascular mimicry and tumor an- giogenesis. Am J Pathol 2000; 156:
361-81.
26. Fujimoto J, Sakaguchi H, Hirose R, Ichigo S, Tamaya T. Expression of va- scular endothelial growth factor (VEGF) and its mRNA in uterine cervical can- cer. Brit J Cancer 1999; 80: 827-33.
27. Zhang H-T, Scott PAE, Morbidelli L, et al. The 121 amino acid isoform of vascular endothelial growth factor is more strongly tumorigenic than other splice variants in vivo. Brit J Cancer 2000; 83: 63-8.
28. Hellberg D, Nilsson S, Valentin J. Po- sitive cervical smear with subsequent normal colposcopy and histology-fre- quency of CIN in a long-term follow-up.
Gynecol Oncol 1994; 53: 148-51.
29. Kataja V, Syrjänen SM, Mäntyjärvi R, Yliskoski M, Saarikoski S, Syrjänen K.
Prognostic factor in cervical human pa- pillomavirus infections. Sex Transm Dis 1992; 19: 154-60.
30. Dobbs SP, Hewett PW, Johnson IR, Carmichael J, Murray JC. Angiogene- sis is associated with vascular endo- thelial growth factor expression in ce- rvical intraepithelial neoplasia. Brit J Cancer 1997; 76: 1410-5.
31. Tjalma W, Van Marck E, Weyler J, et al. Quantification and prognostic rele-
1998; 78: 170-4.
32. Kainz C, Speiser P, Wanner C, et al.
Prognostic value of tumour microvessel density in cancer of the uterine cervix stage IB to IIB. Anticancer Res 1995;
15: 1549-52.
ADRES DO KORESPONDENCJI dr n. med. BBooggddaann MMiicchhaallsskkii ul. Graniczna 63/36
40-018 Katowice
e-mail: bogdan@proloc.com.pl
