Długośćfali [nm]

(1)

Biosensoryczne w

Biosensoryczne w ł ł a a ś ś ciwo ciwo ś ś ci ci nanocz

nanocz ą ą stek p stek p ó ó ł ł przewodnikowych przewodnikowych

Bo Bo ż ż ena Sikora ena Sikora

Promotor: prof. Danek Elbaum Promotor: prof. Danek Elbaum

Zesp Zesp ó ó ł ł Fizyki Biologicznej Fizyki Biologicznej

Instytut Fizyki Polskiej Akademii Nauk Instytut Fizyki Polskiej Akademii Nauk

1 1

(2)

Cel bada Cel bada ń ń

Wczesne wykrywanie chorób neurodegeneracyjnych (choroba Alzheimera, choroba Parkinsona)

Choroby neurodegeneracyjne

grupa wrodzonych lub nabytych postępujących chorób układu nerwowego, w których podstawowym zjawiskiem patologicznym jest utrata komórek nerwowych.

W wyniku procesu chorobowego dochodzi do wystąpienia szeregu uszkodzeń neurologicznych (np. uszkodzenia związane z funkcją motoryczną, uszkodzenia związane z pamięcią).

Proces prowadzący do wystąpienia objawów choroby neurodegeneracyjnej rozpoczyna się znacznie wcześniej i przebiega przez długi czas (często latami) bezobjawowo. Pierwsze objawy pojawiają się kiedy znacząca ilość neuronów ulegnie uszkodzeniu lub uszkodzenie dotyczy określonej części ośrodkowego układu nerwowego.

2 2

Brak diagnostyki na wczesnym etapie rozwoju choroby, dlatego brak jest

skutecznych leków

Neurony – komórki nie dzielące się

(3)

3 3

Koloidalne nanocz

Koloidalne nanocz ą ą stki p stki p ó ó ł ł przewodnikowe przewodnikowe (nanokryszta

(nanokryszta ł ł y, kropki kwantowe) y, kropki kwantowe)

• •

kryształkryształy o rozmiarach nanometrowychy o rozmiarach nanometrowych

• •

ograniczenia kwantowe (quantum confinement effect)ograniczenia kwantowe (quantum confinement effect)

Rysunek: W. H.

Rysunek: W. H. SuhSuh, K. S. , K. S. SuslickSuslick, G. D. , G. D. StuckyStucky, Y. H. , Y. H. SuhSuh, , Progress inProgress in NeurobiologyNeurobiology, 2009, 87, 133, 2009, 87, 133--170.170.

• •

interesująinteresujące wce włłaaśściwociwości optyczne ści optyczne

¾¾ możmożliwoliwośćść regulowania dłregulowania długougośści fali ci fali luminescencji poprzez rozmiar

luminescencji poprzez rozmiar

¾¾ dużduży wspy współółczynnik ekstynkcjiczynnik ekstynkcji

¾¾ wysoka wydajnośćwysoka wydajność kwantowakwantowa

¾¾ dużduży stosunek powierzchni do objy stosunek powierzchni do objęętotośścici

¾¾ brak fotowybielania (utrata zdolnośbrak fotowybielania (utrata zdolności do ci do luminescencji po wyemitowaniu okre

luminescencji po wyemitowaniu okreśślonej lonej liczby foton

liczby fotonóów)w) Rysunek: W. H. SuhRysunek: W. H. Suh, K. S. , K. S. SuslickSuslick, G. D. , G. D. StuckyStucky, Y. H. , Y. H. SuhSuh, , Progress

Progress inin NeurobiologyNeurobiology, 2009, 87, 133-, 2009, 87, 133-170.170.

Wady: brak specyficzności w systemach biologicznych, niska czułość na środowisko

= brak „inteligencji” biologicznej

(4)

„ „ Inteligencja Inteligencja ” ” koloidalnych nanocz koloidalnych nanocz ą ą stek stek pó p ół łprzewodnikowych przewodnikowych

Pokrywanie nanocząstek związkami organicznymi

• stabilizacja przeciw agregacji

• modyfikacja właściwości powierzchni (hydrofobowe, hydrofilowe, amfifilowe)

• Grupy funkcyjne wykorzystywane do przyłączania innych molekuł (np. molekuł biologicznie aktywnych)

Nanocząstka (5 nm) pokryta różnymi hydrofilowymi ligandami: MAA (kwas merkaptooctowy), MPA (kwas merkaptopropionowy), MUA (kwas

merkaptoundekanowy), MSA (kwas

merkaptobursztynowy) DHLA (kwas dihydroliponowy), bis-sulfonowana trifenylofosfina, mPEG₅-SH, mPEG45- SH (2000 g/mol), krótki peptyd (CALNN)

Nanocząstka (5 nm) pokryta różnymi hydrofobowymi ligandami: TOPO (tlenek trioktylofosfiny),TPP (trifenylofosfina), DDT (dodekanotiol), TOAB (bromek tetrabutyloamoniowy)

4 R. A. Sperling, Surface Modification and Functionalization of Colloidal Nanoparticles, 2008, Marburg 4

(5)

„ „ Inteligencja Inteligencja ” ” koloidalnych nanocz koloidalnych nanocz ą ą stek stek pó p ół łprzewodnikowych przewodnikowych

Przyłączanie biologicznie aktywnych molekuł nadaje biologiczną „inteligencję”

• lipidy (składniki błon komórkowych)

• witaminy

• peptydy

• cukry

• białka (np. przeciwciała)

• enzymy

• DNA i RNA

Nanocząstka (5 nm) pokryta warstwą organiczną (10 nm) z aktywnymi grupami, do których mogą być przyłączone:

molekuły poliglikolu etylenowego PEG (2000 g/mol), PEG (5000 g/mol), streptoawidyna, transferyna, przeciwciało (IgG), albumina, pojedyncza nić DNA

5 R. A. Sperling, Surface Modification and Functionalization of Colloidal Nanoparticles, 2008, Marburg 5

(6)

Toksyczno

Toksyczno ść ść koloidalnych nanocz koloidalnych nanocz ą ą stek stek pó p ół łprzewodnikowych przewodnikowych

6 6

Nanocząstki CdSe z przyłączoną molekułą

biologiczną, specyficzną dla danego receptora:

• mogą być rozłożone do nanocząstek i biomolekuł przed przyłączeniem się receptora. Takie CdSe mogą uwalniać jony Cd²⁺, które są pochłaniane przez komórkę.

• rozkład kompleksu może zachodzić wewnątrz komórki, gdzie są uwalniane jony Cd²⁺

• jony Cd²⁺ i biologiczne cząsteczki mogą wchodzić do jądra komórkowego ^[6]

•jony Cd²⁺ wiążą się z atomami siarki, tlenu i wodoru zmieniając strukturę elementów komórki

• jony Cd²⁺ zaburzają obieg mikroelementów: Fe, Cu, Mg, Ca, Se, Zn

[1] E. Chang, E. Thekkek, W. W. Yu, V. L. Colvin, R. Drezek, Small, 2006, 2, 1412–1417, [2] A. M. Derfus, W. C. W. Chan, S.N. Bhatia, Nano Lett.

2004, 4, 11–18, [3] M. Tsoli, H. Kuhn, W. Brandau, H. Esche, G. Schmid, Small, 2005, 1(8-9), 841-844, [4] R. Weissleder, D. Stark, B. L. Engelstad, B. R. Bacon, C. C. Compton, D. L. White, P. Jacobs, J. Lewis, American Journal of Roentgenology, 1989, 152, 167-173, [5] E. I. Altinoglu, T. J.

Russin, J. M. Kaiser, B. M. Barth, B. C. Eklund, M. Kester, J. H. Adair, ACS Nano, 2008, [6] D. R. Cooper, J. L. Nadeau, Nanoscale, 2009

Toksyczność nanocząstek

półprzewodnikowych CdSe/ZnS:

¾ wysoka toksyczność spowodowana

dysocjacją metali ciężkich^[1],[2] powodujących śmierć komórek

Toksyczność nanocząstek metali (Ag, Au)

¾ średnia toksyczność spowodowana przyłączaniem się do nici DNA^[3]

Toksyczność nanocząstek tlenków i nanocząstek polimerowych

¾ najmniejsza → rozpadają się całkowicie w ciele, sugerując, że są one najbardziej

biokompatybilne ^[4],[5]

(7)

Dlaczego nanocz

Dlaczego nanocz ą ą stki ZnO i Fe stki ZnO i Fe

₂₂

O O

₃₃

? ?

1. Niska toksyczność

2. Ciekawe właściwości optyczne nanocząstek ZnO i magnetyczne nanocząstek Fe

₂

O

₃

3. Bardzo wydajna, niedroga, „łatwa” i bezpieczna procedura otrzymywania w koloidach

Zaleznosc smiertelnosci myszy od

dawki jonów Cd²⁺ Zaleznosc smiertelnosci myszy od dawki jonów Zn²⁺

Jung D. Park et.al., Toxicology,2001, 163, 93–100

33,6 mg/kg

Cd²⁺/mysz 1,9 g/kg

Zn²⁺/mysz

7 7

(8)

Wł W ła a ś ś ciwo ciwo ś ś ci luminescencyjne ci luminescencyjne

Pasmo przewodnictwa

Pasmo walencyjne h e

Pasmo wzbronione

Trap State

D ługo ść fali [n m]

Nanocząstki ZnO mają dwa pasma emisyjne:

- Wąskie pasmo emisji ekscytonowej przy długości fali około 380 nm,

- Szerokie , intensywne pasmo przy długości fali około 535 nm przypisane stanom defektowym (trap state) np. luki tlenowe.

8 N. S. Norberg, D. R. Gamelin, J. Phys. Chem. B, 109, 2005, 20810-20816. 8

(9)

Dalszy wzrost nanocz

Dalszy wzrost nanocz ą ą stek ZnO w roztworach stek ZnO w roztworach

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

300 350 400 450 500

Długość fali [nm]

Absorbancja

po syntezie po 21 h po 45h po 672 h

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10

0 10000 20000 30000 40000 50000

czas [min]

2R [nm]

0,0E+00 1,0E+05 2,0E+05 3,0E+05 4,0E+05 5,0E+05 6,0E+05 7,0E+05

375 425 475 525 575

długość fali [nm]

Emisja

po 100 min po 21h po 45h

Widma absorbancji i luminescencji nanocząstek ZnO otrzymanych z octanu cynku (1 mM) oraz wody (407 mM) w temperaturze 35 °C w izopropanolu w zależności od czasu

przechowywania.

Wykres zależności promienia nanocząstek ZnO od czasu ich przechowywania w temperaturze pokojowej.

(10)

Synteza nanocz

Synteza nanocz ą ą stek ZnO/MgO rdze stek ZnO/MgO rdze ń ń /pow /pow ł ł oka oka

ZnO/MgO rdzeń/powłoka (CH₃COO)₂Zn → 2CH₃COO^- + Zn²⁺

H₂O ↔ H⁺ + OH^- or NaOH → Na⁺ + OH^- Zn²⁺ + 2OH^- ↔ Zn(OH)₂ ↔ ZnO + H₂O

ZnO Zn(OAc)₂*2H₂O

w alkoholu

Dodanie H₂O lub NaOH w alkoholu

Dodanie Mg(OAc)₂*4H₂O

w alkoholu i NaOH ZnO

(CH₃COO)₂Mg → 2CH₃COO^- + Mg²⁺

NaOH → Na⁺ + OH^-

Mg²⁺ + 2OH^- ↔ Mg(OH)₂ ↔ MgO + H₂O

10 10

(11)

Dlaczego pow

Dlaczego pow ł ł oka MgO? oka MgO?

1. Doświadczalnie wykazano zapobieganie dalszego wzrostu nanocząstek ZnO [1] – potwierdzenie B. Sikora

2. Jest nietoksyczna i biokompatybilna

3. Powoduje znaczny wzrost luminescencji pochodzącej od defektów rdzenia ZnO [1][2] i wzrost luminescencji ekscytonowej rdzenia ZnO [2]

Heterozłącze I rodzaju systemu rdzeń/powłoka:

1). Minimum poziomu przewodnictwa powłoki ma energię wyższą niż energia poziomu przewodnictwa rdzenia

2). Maksimum poziomu walencyjnego powłoki ma energię niższą niż energia poziomu walencyjnego rdzenia

3). W tym systemie ekscyton jest ograniczony do materiału rdzenia, powłoka pasywuje defekty odpowiadające za przejścia niepromieniste na

powierzchni ZnO i przeciwdziała narażeniu ekscytonu na środowisko zewnętrzne

MgO

ZnO ^{2,56 eV}

-1,74 eV

E_v E_C

E_gZnO = 3,44 eV

E_gMgO = 7,8 eV

11 [1] J. Lee, J. Bang, H. Yang,J. Phys. D: Appl. Phys. 2009, 42, 1-6, [2] X. Q. Meng, H. Peng, Y. Q. Gai, J. Li J. Phys. Chem. C11, 2010, 114 (3), 1467–1471

(12)

Charakteryzacja nanocz

Charakteryzacja nanocz ą ą stek ZnO/MgO stek ZnO/MgO rdze rdze ń ń /pow /pow ł ł oka oka

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

300 350 400 450 500 550 600

ZnO/MgO in H2O ZnO/MgO 21 days in H2O ZnO/MgO 42 days in H2O

długość fali [nm]

Absorbancja

Wykresy zależności absorbancji i emisji nanocząstek ZnO/MgO w wodzie w zależności od czasu przechowywania (stosunek Mg/Zn wynosi 37 %).

Średnia średnica nanocząstek ZnO/MgO core/shell wyznaczona z początku widm absorbancji korzystając z przybliżenia masy efektywnej.

0,E+00 4,E+05 8,E+05 1,E+06 2,E+06

366 416 466 516 566

ZnOMgO in H2O ZnOMgO 21 days in H2O ZnOMgO 42 days in H2O

Luminescencja

długość fali [nm]

t [dni]

t [dni] 2R [nm]2R [nm]

rozpuszczone w rozpuszczone w

wodzie

wodzie 6,26,2 2121 5,95,9 4242 5,95,9

12 12

(13)

Pomiar AFM Pomiar TEM

Histogram

0 20 40 60 80 100

1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 2R [nm]

Counts

Pomiar X-Ray

t – średnica cząstki (Å) λ – długość fali (1,54 Å) B – szerokość połówkowa (radiany)

0 20 40 60 80 100 120

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000

Intensity (arb. units)

2θ (^o)

ZnO /M gO

100 002101

102110 103200

θ λ cos

9 . 0 t = B

2R2R_X-_X_-ray_ray [nm][nm]

2R2R_opt_opt [nm][nm]

2R2R_TEM_TEM [nm][nm]

2R2R_AFM_AFM [nm][nm]

~7.9~7.9 ~6.0~6.0 ~5,5~5,5 ~5,4~5,4

13 13

(14)

Ale po co to wszystko?

Trzy strategie budowania biosensorów:

1. Fluorescencyjny Rezonansowy Transfer Energii (FRET) między nanocząstką ZnO a barwnikiem organicznym czułym na środowisko zewnętrzne

2. Biosensor optyczno – magnetyczny do wykrywania krótkich oligomerów β-amyloidu (wczesne wykrywanie choroby Alzheimera)

3. FRET między nanocząstką ZnO pokrytą przeciwciałem a białkiem do którego zostaje przyłączona

14 14

(15)

Ale po co to wszystko?

15 15

(16)

Pierwsza strategia budowania biosensor

Pierwsza strategia budowania biosensoró ów w

Fluorescencyjny Rezonansowy Transfer Energii (FRET) między nanocząstką ZnO a barwnikiem organicznym czułym na środowisko zewnętrzne

FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer

mechanizm przenoszenia energii między dwoma chromoforami na drodze innej niż promieniowanie.

Donor w stanie wzbudzonym może

przekazywać energię wzbudzenia akceptorowi znajdującemu się w odległości nie większej niż 10 nm.

Obraz TEM i histogram wielkości ZnO/MgO

16 16

4 6 8 10

0 10 20 30 40

Data: Count1_Count Model: Gauss

Equation: y=y0 + (A/(w*sqrt(PI/2)))*exp(-2*((x-xc)/w)^2) Weighting:

y No weighting Chi^2/DoF = 22.43883 R^2 = 0.94944

y0 0.27333 ±2.61713

xc 5.26222 ±0.11411

w 2.63185 ±0.29893

A 150.47841 ±20.78988

liczba czastek

rozmiar czastek [nm]

S. Rakshit et al., ACS Nano, vol. 2, no. 7, 2008, 1473-1479

(17)

FRET:

FRET: nanoczą nanocz ą stka stka ZnO/MgO rdze ZnO/MgO rdze ń ń /pow /pow łoka ł oka pokryta CMCD (donor) i Czerwie

pokryta CMCD (donor) i Czerwień ń Nilu (akceptor) Nilu (akceptor)

Schemat syntezy nanocząstek ZnO/MgO pokrytych karboksymetylo-

beta-cyklodekstryną.

β – cyklodekstryna - składa się z 7 merów glukozowych tworzących strukturę cykliczną

- wnętrze otworu – hydrofobowe - całość cząsteczki - hydrofilowa

- tworzy kompleksy inkluzyjne typu „gość – gospodarz” (funkcja gospodarza)

1). Zmiana rozpuszczalności

nanocząstek w wodzie (zwiększenie hydrofilowości)

2). Nie zmienia absorpcji i emisji nanocząstek ZnO/MgO

17 S. Rakshit et al., ACS Nano, vol. 2, no. 7, 2008, 1473-1479 17

(18)

18 18

0,060 g/l ZnO/MgO + Nile Red ex: 356 nm

0,0E+00 2,0E+05 4,0E+05 6,0E+05 8,0E+05 1,0E+06 1,2E+06 1,4E+06

420 470 520 570 620 670

dlugosc fali [nm]

luminescencja

ZnO/MgO/CMCD 3,2 uM NR 6,4 uM NR 9,7 uM NR 13 uM NR 16 uM NR 19 uM NR 23 uM NR 26 uM NR 29 uM NR 32 uM NR 35 uM NR 39 uM NR 42 uM NR 45 uM NR 48 uM NR

4 g/l ZnO/MgO/CMCD + Nile Red ex: 356 nm

0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06 7,0E+06 8,0E+06 9,0E+06 1,0E+07

420 470 520 570 620 670

luminescencja

ZnO/MgO/CMCD 0,16uM NR 0,40 uM N R 0,81 uM NR 1,6 uM NR 3,2 uM NR 6,4 uM NR 9,7 uM NR 13 uM NR 16 uM NR 19 uM NR 23 uM NR 26 uM NR 29 uM NR 32 uM NR 35 uM NR 39 uM NR 42 uM NR 45 uM NR 48 uM NR

Tło FRET:

ZnO/MgO/CMCD Æ Czerwień Nilu

(19)

FRET: ZnO/MgO/CMCD i Czerwie

FRET: ZnO/MgO/CMCD i Czerwień ń Nilu Nilu

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

Nile Red / ZnO/MgO

Wydajnosc RET

exp teor ZnO

NR ZnO ZnO

I I

Q I −

⁻

=

6 6

0 6 0

r nR

Q nR

= +

r = 3,4 nm.

I_ZnO – intensywność luminescencji donora ZnO/MgO/CMCD w wodzie w przypadku braku Czerwieni Nilowej

I_ZnO-NR - intensywność luminescencji donora ZnO/MgO/CMCD w wodzie w obecności różnych stężeń Czerwieni Nilowej (stężenie donora jest stałe)

r – odległość między donorem a akceptorem

R₀– krytyczna odległość (promień Forster’a), przy której transfer i spontaniczny zanik ekscytowanego donora są równie prawdopodobne, k_ZnO-NR = τ_ZnO^-1.

19 19

(20)

Wpł Wp ływ temperatury na wydajno yw temperatury na wydajno ść ść FRET FRET

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

temperatura [0C]

Wydajnosć RET

20

45 45 45

45

ZnO

NR ZnO ZnO

I I

Q I −

⁻

=

Q – efektywność FRET

I_ZnO – intensywność ZnO/MgO/CMCD w danej temperaturze I_ZnO-NR – intensywność ZnO w układzie ZnO/MgO/CMCD/NR

20 20

(21)

Wp Wp ł ł yw temperatury na po yw temperatury na po ł ł o o ż ż enie piku enie piku luminescencji Czerwieni Nilu

luminescencji Czerwieni Nilu

79 mg/l ZnO/MgO 20 g/l ZnO/MgO/CMCD

13uM Nile Red

644 645 646 647 648 649 650 651 652 653

15 20 25 30 35 40 45 50 55

temperatura [0C]

λ max [nm]

21 21

(22)

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie ń ń Nilu w kom Nilu w kom ó ó rkach rkach HeLa HeLa

Pobudzenie 560 nm Emisja 450 – 700 nm

Pobudzenie 488 nm Autofluorescencja Emisja 520 – 560 nm

Nalożenie

Skład:

20 g/l ZnO/MgO/CMCD (w tym 79 mg/l ZnO/MgO) i

13 umol/l Czerwieni Nilowej w wodzie Do komórek HeLa zostało

dodane 20 ul roztworu kompleksu

Inkubacja 48 h z lipofektaminą 2222

(23)

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie ń ń Nilu w kom Nilu w kom ó ó rkach rkach HeLa HeLa

xz

yz

23 23

(24)

24 24

poza komórkami HeLa

0 20 40 60 80 100 120 140

500 550 600 650 700 750 800

luminescencja

na komórkach HeLa

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

500 550 600 650 700 750 800

luminescencja

w komórkach HeLa

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

500 550 600 650 700 750 800

luminescencja

komórki HeLa bez ZnO/MgO/CMCD/NR

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045

500 550 600 650 700 750 800

luminescencja

Widma luminescencji Widma luminescencji pobudzenie 560 nm w

pobudzenie 560 nm w zale zale ż ż nosci nosci od miejsca na/w od miejsca na/w

komó kom órce HeLa rce HeLa

(25)

Zestawienie Zestawienie

λ λ

_max_max

± ± SD SD poza kom

poza komó órk rk ą ą

λ λ

_max_max

± ± SD SD na kom

na kom órce ó rce

λ λ

_max_max

± ± SD SD w kom

w kom órce ó rce 600 ± 600 ± 3 nm 3 nm 597 ± 597 ± 9 nm 9 nm 619 ± 619 ± 3 nm 3 nm

I I

_max_max

poza kom

poza komó órk rką ą

I I

_max_max

na kom

na komó órce rce

I I

_max_max

w kom

w kom órce ó rce 23 – 23 – 120 arb. units 120 arb. units 0,47 – 0,47 – 0,87 arb. units 0,87 arb. units 54 – 54 – 167 arb. units 167 arb. units

25 25

(26)

Widma luminescencji Widma luminescencji

pobudzenie 560 nm pobudzenie 560 nm

Kom Kom ó ó rki bez ZnO/MgO/CMCD/NR rki bez ZnO/MgO/CMCD/NR

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045

500 550 600 650 700 750 800

luminescencja

Autofluorescencja komórek Pobudzenie 405 nm

26 26

(27)

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie ń ń Nilu w kom Nilu w kom ó ó rkach rkach HeLa HeLa

Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm Filtr emisyjny: 593 ± 20 nm

Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm Filtr emisyjny: red

FRET FRET

ZnO + autofluorescencja

autofluorescencja

27 27

(28)

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie ń ń Nilu w kom Nilu w kom ó ó rkach rkach HeLa HeLa

28 28

(29)

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie

ZnO/MgO/CMCD/Czerwie ń ń Nilu w kom Nilu w kom ó ó rkach rkach HeLa HeLa

29 29

(30)

K K om om ó ó rk rk i i HeLa HeLa - - kontrola kontrola

Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm

Filtr emisyjny: 536 ± 20 nm Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm Filtr emisyjny: 692 ± 20 nm

30 30

(31)

Kolejny etap:

Zmiana sondy (Czerwień Nilu) na sondę czułą na rodniki Æ znaczenie w chorobach

neurodegeneracyjnych

31 31

(32)

Ale po co to wszystko?

32 32

(33)

Druga strategia budowania biosensor

Druga strategia budowania biosensor ó ó w w

Biosensor optyczno – magnetyczny do wykrywania krótkich oligomerów β-amyloidu (wczesne wykrywanie choroby Alzheimera)

Cząsteczki Analit

Przeciwciało do analitu

Nanocząstka ZnO (właściwości emisyjne)

Nanocząstka Fe₂O₃(właściwości magnetyczne)

33 33

(34)

Druga strategia budowania biosensor

Druga strategia budowania biosensor ó ó w w

Nanocząstki ZnO/MgO

Cząsteczki Analit

34 34

(35)

Druga strategia budowania biosensor

Druga strategia budowania biosensor ó ó w w

Cząsteczki Analit

35 35

(36)

Druga strategia budowania biosensor

Druga strategia budowania biosensor ó ó w w

Nanocząstki Fe

₂

O

₃

Cząsteczki Analit

36 36

(37)

Druga strategia budowania biosensor

Druga strategia budowania biosensor ó ó w w

Cząsteczki Analit

37 37

(38)

Druga strategia budowania biosensor

Druga strategia budowania biosensor ó ó w w

Magnes

Cząsteczki Analit

38 38

(39)

Druga strategia budowania biosensor

Druga strategia budowania biosensor ó ó w w

Detekcja luminescencji nanocząstek ZnO/MgO

Magnes

Cząsteczki Analit

39 39

Zalety:

-) możliwość wykonywania testów w warunkach polowych -) nie potrzebny jest

wysublimowany sprzęt laboratoryjny

(40)

Nanocząstki Fe

₂

O

₃

Właściwości strukturalne

Potwierdzenie romboedrycznej struktury Fe₂O₃ (hematyt)

Pomiar X-Ray

Pomiar TEM

0 20 40 60 80 100 120 140

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

214300 122 024116 113 110 104

przed wygrzewaniem

Fe₂O₃ (po wygrzaniu w 400^oC)

Intensity [a.u.]

2θ[o_]

012

2R TEM [nm] 2R x-Ray [nm]

(przed wypaleniem)

2R x-Ray [nm]

(po wypaleniu)

~2,8 ~ 2,5 ~ 37,5

40 40

(41)

Nanocząstki Fe

₂

O

₃

Właściwości magnetyczne

Nadprzewodnikowy interferometr kwantowy (SQUID)

0 50 100 150

0,0 1,0x10^-4 2,0x10^-4 3,0x10^-4 4,0x10^-4 5,0x10^-4 6,0x10^-4 7,0x10^-4 8,0x10^-4 9,0x10^-4 1,0x10^-3

ZFC FC

Μ(emu/g)

T (K )

Temperaturowa zależność magnetyzacji ZFC-FC

zmierzona dla kropek

kwantowych Fe₂O₃ w polu magnetycznym o wartości 10 Oe

.

ZFC – schładzanie próbki w zerowym polu magnetycznym

FC – schładzanie próbki w polu magnetycznym

Powyżej T

_B^max

(temperatura blokowania) cząstki wykazują zachowanie

superparamagnetyczne, czego przejawem jest superpozycja krzywych ZFC i FC oraz spadek wartości magnetyzacji w miarę wzrostu temperatury

41 41

(42)

Nanocząstki Fe

₂

O

₃

Właściwości magnetyczne

Nanocząstki przed wygrzaniem (2R = 2,5 nm)

Nanocząstki Fe₂O₃ po wygrzaniu (2R = 37,5 nm)

Kolejny etap: Pokrywanie nanocząstek ZnO/MgO i Fe

₂

O

₃

związkami organicznymi w celu przyłączenia przeciwciał do oligomerów β-amyloidu

42 42

(43)

Ale po co to wszystko?

• pokrycie nanocząstek ZnO/MgO związkami organicznymi zakończonymi grupami karboksylowymi (-COOH), np. kwas oleinowy

• przyłączenie przeciwciała specyficznego do danego miejsca w komórce bez denaturacji białka

43 43

(44)

Ale po co to wszystko?

4. FRET między nanocząstką NaYF₄: Er, Yb wykazującą właściwości „upconvertujące” pokrytą przeciwciałem a białkiem do którego zostaje przyłączona lub barwnikiem przyczepionym do

jej powierzchni

44 44

(45)

Upkonwersja Upkonwersja

1. Upkonwersja opisuje konwersję promieniowania o niskiej energii (bliska podczerwień) do wyższego energetycznie promieniowania (widzialnego Er oraz ultrafioletu Gd) przez

multifotonową absorpcję i późniejszą luminescencję.

2. Większość biologicznych struktur absorbuje światło w paśmie widzialnym i ultrafioletowym.

Bliska podczerwień (długość fali 700 – 1000 nm) jest mało absorbowana przez molekuły biologiczne.

3. Układy biologiczne pobudzane bliską podczerwienią wykazują także mniej autofluorescencji niż pobudzane promieniowaniem ultrafioletowym.

4. Emisja w świetle widzialnym pozwala obserwować procesy życiowe wewnątrz komórek, a emisja w świetle UV pozwala na selektywne uśmiercanie komórek rakowych.

45 45

(46)

Mechanizm upkonwersji z transferem energii Mechanizm upkonwersji z transferem energii

(ang. Energy transfer upconversion ETU) (ang. Energy transfer upconversion ETU)

Mechanizm jest oparty na sekwencyjnej absorpcji dwóch fotonów powodującej obsadzenie wyższego poziomu.

Pobudzenie odbywa się przez transfer energii między dwoma sąsiadującymi jonami ziem rzadkich (między iterbem a erbem). Jeden jon działa jako absorber (donor energii) - iterb a drugi jako

aktywator (akceptor energii) – erb.

Aktywator jest pobudzany do stanu wyższego przez pierwszy

niepromienisty transfer energii podczas gdy absorber relaksuje do stanu podstawowego. Drugie

pobudzenie aktywatora i kolejny transfer energii umożliwia

powstanie stanu emitującego.

Yb

³⁺

2F_7/2

980 nm

2F_5/2

520 nm 540 nm 655 nm

4I_15/2

4I_13/2

4I_11/2

4I_9/2

4F_9/2

4S_3/2

2H_11/2

2H_7/2

Er

³⁺

46 F. Wang, X. Liu, Chem. Soc. Rev, 2009, 38, 976-989 46

(47)

Mechanizm upkonwersji z transferem energii Mechanizm upkonwersji z transferem energii

(ang. Energy transfer upconversion ETU) (ang. Energy transfer upconversion ETU)

ET – Energy Transfer EBT – Energy Back Transfer

Mechanizm:

-) Transfer energii między erbem (aktywator) a gadolinem (aktywator) (ET1 i ET2) -) Transfer energii między iterbem (absorber) a gadolinem (aktywator)

-) Obserwujemy luminescencję przy dlugosci fali 246 nm, 252 nm, 276 nm, 311 nm

47 G. Chen, H. Liang, H. Liu, G. Somesfalean, Z. Zhang, Optics Express, 2009, vol. 17, No. 19, 16366-16371. 47

(48)

Dlaczego NaYF Dlaczego NaYF

₄₄

? ?

Wydajność upkonwersji zależy od:

-) stężenia absorbera i aktywatora (stężenia domieszek, co determinuje odległość między sąsiadującymi jonami domieszkowymi)

-) struktury krystalicznej kryształu matrycowego

-) wielkości nanocząstek (im większa średnica tym większa intensywność emisji) – ze względu na mniejszy stosunek powierzchni do objętości. Na powierzchni nanocząstki atomy metali

ziem rzadkich nie wykazują właściwości upkonwertujących.

Kryształ matrycowy powinien mieć sieć krystaliczną dopasowaną do jonów domieszkowych i niską energię fononową, aby zminimalizować niepromieniste procesy relaksacji. Te

wymagania spełniają fluorki.

48 48

(49)

Synteza nanocz

Synteza nanoczą ą stek NaYF stek NaYF

₄₄

: Er, Yb, Gd : Er, Yb, Gd

(1-0,02-x) mmol Y₂O₃ x mmol Yb₂O₃ 0,02 mmol Er₂O₃

+ 10 ml 10 % HNO₃

(ogrzewanie w celu usunięcia wody) Y₂O₃ + 6HNO₃ → 2Y(NO₃)₃ + 3H₂O

Yb₂O₃ + 6HNO₃ → 2Yb(NO₃)₃ + 3H₂O Er₂O₃ + 6HNO₃ → 2Er(NO₃)₃ + 3H₂O

Y(NO₃)₃, Yb(NO₃)₃, Er(NO₃)₃

+ 10 ml glikolu etylenowego + 0,5560 g PVP + 1mmol NaCl, ogrzewanie 80 °C

4 mmol NH₄F

w glikolu etylenowym 80 °C

Reakcja: 2 h, 160 °C NaYF₄: xYb, 0,02Er / PVP

Na

⁺

+ (1 – 0,02 – x)Y

³⁺

+ xYb

³⁺

+ 0,02Er

³⁺

+ 4F

^-

→ NaYF

₄

: xYb, 0,02 Er

49 X. Li, Y. Zhang, Angew. Chem. Int. Ed, 2006, 45, 7732-7735 49

(50)

Pokrywanie nanocz

Pokrywanie nanocz ą ą stek NaYF stek NaYF

₄₄

: Er, Yb, Gd warstw : Er, Yb, Gd warstw ą ą SiO SiO

₂₂

Do 20 ml etanolowego roztworu

nanocząstek (0,05 mmol) dodano 4 ml H₂O i 0,5 ml 30 % amoniaku

0,06 ml tetraetoksysilan (TEOS) w 10 ml etanolu

NaYF₄: xYb, 0,02Er / PVP

Reakcja: ~ 15h, 25 °C NaYF₄: xYb, 0,02Er / SiO₂

Hydroliza TEOS w obecności wodorotlenku amonu jako katalizatora

Si OEt

OEt OEt

EtO NH₄OH

-EtOH Si

OH OH OH O

H -H₂O

Si OH

O OH O

H Si

OH OH OH

Si O

O Si O Si O Si O O

SiO₂ Kwas disilanowy

TEOS Kwas monosilanowy ₅₀₅₀

X. Li, Y. Zhang, Angew. Chem. Int. Ed, 2006, 45, 7732-7735

(51)

0,0E+00 1,0E+03 2,0E+03 3,0E+03 4,0E+03 5,0E+03 6,0E+03 7,0E+03

500 550 600 650 700

luminescencja

10,9 g/l NaYF4/PVP

10,8 g/l NaYF4: 10% Yb, 2 % Er /PVP 10,1 g/l NaYF4: 18% Yb, 2 % Er /PVP 10,8 g/l NaYF4: 30% Yb, 2 % Er /PVP

11,4 g/l NaYF4: 20% Yb, 2 % Er, 5 % Gd /PVP

Próbka Stosunek powierzchni pod pikiem 660 nm do 540 nm

(średnia 3 pomiarów)

2 % Er, 10 % Yb 6,4

2 % Er, 18 % Yb 5,9

2 % Er, 30 % Yb 11,4

20 % Yb, 2% Er, 5 % Gd 7,4

Luminescencja nanocz

Luminescencja nanoczą ą stek NaYF stek NaYF

₄₄

: Er, Yb, Gd : Er, Yb, Gd

Długość fali pobudzania: 980 nm

(52)

Dyfrakcja rentgenowska – potwierdzenie kubicznej struktury

0,0E+00 2,0E+04 4,0E+04 6,0E+04 8,0E+04 1,0E+05 1,2E+05 1,4E+05

10 30 50 70 90 110 130 150

2 theta [^o]

Intensywność

NaYF4: 2 % Er, 30 % Yb / PVP NaYF4: 2 % Er, 20 % Yb / PVP NaYF4: 2 % Er, 18 % Yb / PVP NaYF4: 2 % Er, 10 % Yb / PVP NaYF4 / PVP

111

200

220

31 1

222 400 311 420

511 531

422 440 600

Próbka NaYF₄ Średnica [nm]

0 % Er, 0 % Yb ~30

2 % Er, 20 % Yb ~36

2 % Er, 10 % Yb ~30

2 % Er, 18 % Yb ~30

2 % Er, 30 % Yb ~28

20 % Yb, 2 % Er, 5 % Gd ~32

Wielko

Wielko ść ść i struktura nanocz i struktura nanocz ą ą stek NaYF stek NaYF

₄₄

: Er, Yb, Gd : Er, Yb, Gd

(53)

Próbka NaYF₄ Średnica [nm]

0 % Er, 0 % Yb ~35

2 % Er, 20 % Yb ~55

2 % Er, 10 % Yb ~45

2 % Er, 18 % Yb ~45

2 % Er, 30 % Yb ~35

20 % Yb, 2 % Er, 5 % Gd ~50 Transmisyjny Mikroskop Elektronowy

Obraz nanocząstek NaYF₄: 30 % Yb, 2 % Er / PVP Potwierdzenie kubicznej struktury

Wielko

Wielko ść ść i struktura nanocz i struktura nanocz ą ą stek NaYF stek NaYF

₄₄

: Er, Yb, Gd : Er, Yb, Gd

Otoczka SiO₂

(54)

Nanocz

Nanoczą ą stki NaYF stki NaYF

₄₄

: Er, Yb, Gd wewną : Er, Yb, Gd wewn ą trz kom trz kom órek ó rek HeLa HeLa

Kolor zielony: autofluorescencja (pobudzenie 488 nm), Kolor czerwony: nanocząstki (pobudzenie 960 nm)

1 2 6

5 4 3 7

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

480 530 580 630 680

luminescencja

1 2 3 4 5 6 7

54 54

(55)

Nanocz

Nanoczą ą stki NaYF stki NaYF

₄₄

: Er, Yb, Gd wewną : Er, Yb, Gd wewn ą trz kom trz kom órek ó rek HeLa HeLa

xz

Kolor zielony: autofluorescencja (pobudzenie 488 nm),

yz

Kolor czerwony: nanocząstki (pobudzenie 960 nm)

55 55

(56)

Kolejny etap:

Pokrycie nanocząstek NaYF

₄

warstwą organiczną w celu przyłączenia białka lub barwnika organicznego

czułego na środowisko

56 56

(57)

Podsumowanie Podsumowanie

1. Nanocząstki ZnO/MgO/CMCD użyto do zbudowania biosensora czułego na środowisko zewnętrzne dzięki fluorescencyjnemu rezonansowemu transferowi energii między nanocząstkami ZnO/MgO (donor) a Czerwienią Nilu (akceptor) ulokowaną wewnątrz cyklodekstryny

2. Nanocząstki ZnO/MgO/CMCD/Czerwień Nilu zostały wprowadzone do komórek nowotworowych HeLa i zaobserwowano zmianę luminescencji Czerwieni Nilu w zależności od miejsca ulokowania w/na/obok komórkach HeLa.

3. Prawdopodobnie zaobserwowano FRET wewnątrz komórek HeLa.

4. Utworzono nanocząstki Fe₂O₃ wykazujące właściwości superparamegnetyczne w temperaturze pokojowej w celu użycia ich razem z nanocząstkami ZnO/MgO do budowy biosensora do wykrywania krótkich oligomerów β - amyloidu (znaczenie w chorobie Alzheimera)

5. Zsyntetyzowano i scharakteryzowano nanocząstki NaYF₄: Er, Yb, Gd

wykazujące właściwości upkonwertujące i wprowadzono je do wnętrza komórek HeLa.

57 57

(58)

Podzi

Podzi ę ę kowanie kowanie

Zespól Fizyki Biologicznej

Mgr Anna

Baranowska - Korczyc

Mgr Izabela Kamińska Dr Krzysztof Fronc

Prof. Danek Elbaum

Instytut Fizyki PAN Instytut Biochemii i Biofizyki PAN

Mgr Kamil Sobczak – pomiary TEM Mgr Piotr Dziawa – pomiary SQUID Dr Roman Minikayev – pomiary X-ray Prof. Wojciech Paszkowicz – pomiary X-ray

Kamil Koper – wprowadzanie cząstek do komórek Prof. Piotr Stępień

Instytut Podstawowych Problemów Techniki PAN

58 58 Instytut Biologii Doświadczalnej PAN

Prof. Grzegorz Wilczyński – mikroskop konfokalny Dr Jakub Wlodarczyk – mikroskop konfokalny

Dr Piotr Krakowian – mikroskop konfokalny Prof. Tomasz Kowalewski

Dr Sławek Błoński, Mgr Krzysztof Zembrzycki – pomoc

Wydział Fizyki UAM

Sebastian Szewczyk – synteza NaYF₄: Er, Yb

(59)

Wp Wp ł ł yw temperatury na intensywno yw temperatury na intensywno ść ść luminescencji w uk

luminescencji w ukł ładzie ZnO/MgO/CMCD i adzie ZnO/MgO/CMCD i Czerwie

Czerwie ń ń Nilu Nilu

0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06

temperatura [⁰C]

Intensywność

Nile Red w FRET ZnO w FRET ZnO/MgO/CMCD ZnO/MgO

45 20

20 20 20

20

45 45 45 45 45

∆intNRwFRET∆intNRwFRET ∆intZnOwFRET∆intZnOwFRET ∆intZnO/MgO/CMCD∆intZnO/MgO/CMCD ∆intZnO/MgO/CMCD∆intZnO/MgO/CMCD 2,3*10

2,3*10^-6^-⁶ 1,0*101,0*10^-6^-⁶ 1,3*101,3*10^-^-6⁶ 1,4*101,4*10^-^-6⁶

59 59

(60)

FRET: ZnO/MgO/CMCD i Czerwie

FRET: ZnO/MgO/CMCD i Czerwień ń Nilu Nilu

Równanie Fostera pozwala na określanie odległości między donorem a akceptorem, dlatego też jest używane przez chemików jako „elektroniczna suwmiarka”

Przyjmując założenia:

1). Donor oddziałuje z wieloma akceptorami

2). Transfer energii do każdego z akceptorów można rozważać jako niezależne zdarzenie to wydajność transferu energii może być wyrażona równaniem:

6 6

0 6 0

r nR

Q nR

= +

n – liczba molekuł akceptora

Dla układu ZnO/MgO/CMCD Æ Czerwień Nilowa R₀ = 3,4 nm [1]

Wartość r, odległość donora od akceptora w układzie ZnO/MgO/CMCD Æ Czerwień Nilowa, może być wyznaczona przez dopasowanie powyższego równania do

eksperymentalnie obserwowanych zależności między wydajnością rezonansowego transferu energii a stężeniem akceptora

60 60 [1] S. Raksshit, S. Vasudevan, ACS Nano,

2008, 2(7), 1473 – 1479

(61)

FRET: ZnO/MgO/CMCD i Czerwie

FRET: ZnO/MgO/CMCD i Czerwień ń Nilu Nilu

Wydajność rezonansowego transferu energii:

ZnO NR ZnO ZnO

I I

Q I −

⁻

=

6 6

0 6 0

1

R r

R k

Q k

ZnO NR

ZnO

NR ZnO

= +

₋

−

τ

τ_ZnO – czas zaniku emisji donora ZnO/MgO w nieobecności Czerwieni Nilowej

k_ZNO-NR – stała szybkości emisji donora

ZnO/MgO/CMCD w obecności akceptora Czerwieni Nilowej

r – odległość między donorem a akceptorem

R₀ – krytyczna odległość (promień Forster’a), przy której transfer i spontaniczny zanik ekscytowanego donora są równie prawdopodobne, k_ZnO-NR = τ_ZnO^-1. I_ZnO – intensywność luminescencji donora

ZnO/MgO/CMCD w wodzie w przypadku braku Czerwieni Nilowej

I_ZnO-NR - intensywność luminescencji donora ZnO/MgO/CMCD w wodzie w obecności różnych stężeń Czerwieni Nilowej (stężenie donora jest stałe)

) 128 (

) 10 (ln 9000

4 5

0 2

0

λ

η π

γ

κ J

R N

A

=

D

κ² – czynnik orientacyjny, który wynosi 2/3 dla losowo zorientowanych dipoli donor – akceptor, γ_D⁰ – wydajność kwantowa donora w

nieobecności akceptora N_A – liczba Avogadro

η - współczynnik załamania światła J(λ) – spektralne nałożenie emisji donora i absorpcji akceptora:

λ λ λ ε λ

λ I d

J _D _A ⁴

0

) ( ) ( )

( ⁼

∫

^∞

S. Rakshit et al., ACS Nano, vol. 2, no. 7, 2008,

1473-1479 6161

(62)

Toksyczno

Toksyczno ść ść kr kr ó ó tkich oligomer tkich oligomer ó ó w w β- β - amyloidu amyloidu

Zaobserwowano, po przebadaniu surowicy 20 pacjentów z Chorobą Alzheimera (AD) i 18 pacjentów zdrowych, zwiększoną ilość oligomerów i krótkich włókien amyloidowych w obecności surowicy z AD w porównaniu do populacji kontrolnej. Ma to potencjalna wartość diagnostyczną.

Nowicka, et.al., JAD, 2010

62 62

(63)

Struktura Czerwieni Nilu Struktura Czerwieni Nilu

63 63