Ćwiczenie 4. Wyznaczanie masy cząsteczkowej białek za pomocą spektrometrii mas.
Spektrometria mas jest narzędziem analitycznym stosowanym między innymi do pomiaru masy cząsteczkowej analitu. Dla dużych cząsteczek (biomolekuł) masy cząsteczkowe mogą być mierzone z dokładnością 0,01% całkowitej masy cząsteczkowej, tj. 4 daltonów (Da) lub mas atomowych (UAM) analitu o Mcz 40000 Da.
Spektrometry mas stosowane są w przemyśle i środowiskach naukowych, do badań zarówno rutynowych i jak i badawczych. Główne zastosowania spektrometrii mas to:
biotechnologia (analiza białek, peptydów, oligonukleotydów, przemysł farmaceutyczny (odkrywanie nowych leków, farmakokinetyka, metabolizm leków), badania kliniczne (badania przesiewowe noworodków, analizy hemoglobiny, testy narkotykowe, ochrona środowiska (WWA, PCB, jakość wody, skażenie żywności), itp.
4.1. Podstawy teoretyczne techniki ESI-MS
Na spektrometr mas składają się następujące elementy: źródło jonizacji, analizator i detektor (Rysunek 1).
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie spektrometru mas
Próbka musi być wprowadzona najpierw do źródła jonizacji. Wewnątrz źródła jonizacji, cząsteczki próbki są podawane jonizacji, ponieważ jonami łatwiej jest
„manipulować” niż cząsteczkami obojętnymi. Jony te są wyodrębniane w regionie analizatora spektrometru masowego gdzie rozdziela się je w zależności od masy (m) i od ładunku (z), czyli od stosunku wielkości (m/z). Rozdzielone jony są wykrywane i ten sygnał wysłany jest do systemu danych, gdzie zebrane informacje są prezentowane w postaci zależności intensywności od wielkości (m/z) czyli widma MS. Analizator i detektor spektrometru mas są utrzymywane w wysokiej próżni aby umożliwić jonom podróż z jednego końca instrumentu do drugiego końca bez przeszkód w postaci kolizji z cząsteczkami powietrza.
4.2. Aparatura pomiarowa
Sposoby jonizacji
Sposób wprowadzenia próbki do źródła jonizacji często zależy od metody jonizacji, a także od rodzaju i złożoności próbki.
Próbkę można wprowadzić do komory, gdzie odbywa się jonizacja bezpośrednio lub za pomocą technik chromatograficznych. Ta ostatnia metoda wprowadzenia próbki zazwyczaj wiąże się z połączeniem spektrometru mas z wysokosprawnym chromatografem cieczowym (HPLC), chromatografem gazowym (GC) lub kapilarną elektroforezą (CE), a więc próbka jest wstępnie rozdzielana, a poszczególne rozdzielone pasma są wprowadzane do spektrometru mas.
Istnieje wiele metod jonizacji cząsteczek w spektrometrach mas. Do metod najczęściej używanych w badaniach nad wielkocząsteczkowymi biopolimerami takimi jak białka i oligonukleotydy należą:
Elektrorozpylanie (Electrospray, ESI), polegające na rozpylaniu cieczy zawierającej badaną substancję z igły, do której przyłożono wysokie napięcie (zwykle 1–5 kV) pod ciśnieniem atmosferycznym. Jest to jedna z łagodnych metod jonizacji – zwykle nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad wielkocząsteczkowymi biopolimerami takimi jak białka i oligonukleotydy.
Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation – MALDI) – w której stosuje się jonizację laserową, ale z tak dobraną energią wiązki, aby nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek (łagodna metoda jonizacji), lecz tylko do ich
"wybijania" ze specjalnie przygotowanej matrycy. Matryca absorbuje energię lasera, która jest później przekazywana do analizowanych cząsteczek.
Analizatory mas
W spektrometrach mas stosowane są różne typy analizatorów masy:
Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF) – charakteryzują się stosunkowo dużymi rozdzielczościami rzędu kilkudziesięciu tysięcy (do 100 000) oraz dosyć dużą czułością. Są najczęściej stosowane razem ze źródłami jonów MALDI.
Kwadrupol (Quadrupole) - jest to popularny analizator zbudowany z czterech symetrycznie ułożonych równoległych prętów. Działa jako filtr masy – w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z).
Pułapka jonowa (Ion trap – IT) jest analizatorem pozwalającym na przetrzymywanie jonów.
Analizator ten działa na zasadzie podobnej do kwadrupola. Charakteryzują się one zwykle dość niewielką rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz bardzo dużą czułością.
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR) Analizator cyklotronowy wykorzystuje zjawisko zakrzywienia toru lotu jonów w polu magnetycznym.
Jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy. Rozdzielczości tych analizatorów szybko zmniejszają się wraz ze wzrostem m/z analizowanej cząsteczki.
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR) Analizator ten działa podobnie jak analizator cyklotronowego rezonansu jonowego. W analizatorze FT-ICR zastosowano bardziej wydajną metodę zbierania danych niż w ICR. Analizatory FT-ICR wyparły obecnie z rynku analizatory ICR.
Orbitrap – zbudowany jest z dwóch elektrod zewnętrznych i jednej elektrody wewnętrznej pomiędzy którymi poruszają się jony. Pomiar częstotliwości oscylacji jonów wzdłuż osi analizatora pozwala na obliczenie stosunku masy do ładunku jonu. Analizatory typu orbitrap charakteryzują się dużą rozdzielczością (do 200 000).
Elektrorozpylanie.
Proces jonizacji z zastosowaniem techniki ESI przedstawiono schematycznie na Rysunku 2.
Azot Komora
aerozol Kapilara
Separator stożkowy
Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie mechanizmu jonizacji poprzez elektrorozpylanie (ESI)
Mechanizm jonizacji poprzez elektrorozpylanie nie jest do końca ustalony, jakkolwiek przyjmuje się, że w zależności od warunków i wielkości jonizowanych cząsteczek proces ten może przebiegać dwiema drogami; zgodnie z modelem naładowanej pozostałości (CRM) bądź też modelem odparowania jonu (IEM).
Roztwór próbki jest wprowadzany przez metalową igłę do komory rozpylania. Gaz rozpylający doprowadzany jest poprzez rurkę, w której umieszczona jest igła. Duże siły ścinające, wytwarzane przez gaz rozpylający, w połączeniu z silnym polem elektrostatycznym (2,5 ÷ 6 kV) w komorze rozpylania porywają roztwór składników próbki w fazie ruchomej i rozbijają go na kropelki. Podczas rozpylania, krople aerozolu zostają naładowane dodatnio bądź ujemnie w zależności od tego jaki potencjał ma igła rozpylacza względem analizatora mas. Na skutek odparowywania rozpuszczalnika, objętość kropli aerozolu zmniejsza się ustawicznie, a tym samym zwiększa się powierzchniowa gęstość ładunku elektrycznego jakim jest ona obdarzona. Proces ten trwa do chwili gdy siły odpychania ładunków zgromadzonych na powierzchni kropli przezwyciężą siłę napięcia powierzchniowego utrzymującą kroplę w jej kształcie. W tym momencie zachodzi zjawisko tak zwanej „eksplozji Coulombowskiej” czyli rozbicia kropli na kilka mniejszych kropelek, których łączna powierzchnia jest większa od powierzchni kropli macierzystej. Powoduje to zmniejszenie gęstości ładunku powierzchniowego przypadającego na każdą powstałą kropelkę. Proces ten ulega powtórzeniu w miarę odparowywania rozpuszczalnika.
Zgodnie z modelem CRM tworzenie coraz mniejszych kropli trwa aż do momentu odparowania ostatniej cząsteczki rozpuszczalnika, podczas gdy model IEM zakłada
możliwość emisji jonów bezpośrednio z powierzchni stosunkowo dużych kropel (o średnicy około 10 nm).
Mechanizm powstawania jonów w ESI w sposób schematyczny pokazano na Rysunku 3.
Rysun ek 3.
Schem atyczn
e przeds tawien ie mecha nizmu niz cji za pomoc
ą techniki ESI jo a
Technika ESI jest szczególnie przydatna do jonizacji cząsteczek o różnej polarności (nawet bardzo polarnych) oraz dużych cząsteczek biologicznych (białek). Technika elektrorozpylania wymaga stosowania rozpuszczalników polarnych. Jednakże, po dodaniu polarnego modyfikatora, rozpuszczalniki niepolarne mogą być również z powodzeniem stosowane, co oznacza, że technika ESI nadaje się do układów faz odwróconych, w których wypełnienie kolumny jest mniej polarne od fazy ruchomej.
Tryb jonizacji
W każdym ze wspomnianych wyżej sposobów jonizacji do wyboru są dwa tryby pracy: tworzenia jonów dodatnich (przyłączanie protonu/protonów do substancji oznaczanej lub wymiana ładunku między nią a składnikami fazy ruchomej) i tworzenia jonów ujemnych (odszczepienie protonu/protonów od substancji badanej lub wymiana ładunków).
Uogólniając, w przypadku analitów o charakterze bardziej zasadowym stosuje się tryb tworzenia jonów naładowanych dodatnio. Cząsteczka próbki (zasada) pobiera proton z bardziej kwaśnego roztworu rozpuszczalnika. Natomiast anality o charakterze bardziej
kwaśnym można oznaczać stosując tryb tworzenia jonów naładowanych ujemnie. Cząsteczka próbki (kwas) oddaje proton do zasady w roztworze i staje się naładowana ujemnie.
Istnieją jednak wyjątki o tak zróżnicowanej budowie chemicznej, dla których można zastosować oba sposoby jonizacji.
Ze względu na fakt, że analizy chromatograficzne mogą być prowadzone przy zastosowaniu dwóch trybów pracy detektora MS, uzyskiwane są dwa rodzaje jonów (pseudo)cząsteczkowy: [M+H]+ oraz [M-H]-, chociaż nie można wykluczyć obecności jonów [M]-. Oprócz jonów (pseudo)cząsteczkowych powstających w wyniku protonowania i deprotonowania cząsteczki w warunkach jonizacji powstawać mogą także jony będące produktami przyłączenia np. jonu amonowego lub jonów metali alkalicznych, np: [M+NH4]+, [M+Na]+, [M+K]+ w warunkach tworzenia jonów dodatnich, zaś w warunkach tworzenia jonów ujemnych powstawać może [M+HCOO]- (np. w obecności kwasu mrówkowego w fazie ruchomej). Te tzw. jony addycyjne, z jednej strony komplikują interpretację widma mas, ale równocześnie mogą pomóc w interpretacji struktury analitu. Wreszcie występowanie jonów klasterowych, takich jak np. [2M+H]+, [3M+H]+ i jonów fragmentacyjnych może także utrudnić interpretację widma albo potwierdzić przypuszczenie co do ewentualnej struktury związku.
Interpretacja widma MS.
Przykładowe widmo MS dla pentapeptydu leucyny enkefaliny (YGGFL) pokazano na Rysunku 4. Wzór cząsteczkowy tego związku jest następujący: C28H37N5O7 . Obliczona masa monoizotopowa wynosi 555.2692 Da.
Rysunek 4. Widmo ESI-MS m/z dla YGGFL.
Na widmie MS widać dominujący jon przy m/z = 556.1, który jest zgodny z oczekiwanym protonowanym jonem (pseudo)molekularnym [M + H] +. Protonowane jony powstają, gdyż próbka została zanalizowana w warunkach tworzenia jonów dodatnio naładowanych (po przyłączeniu protonu). Stąd zmierzona masa cząsteczkowa wynosi:
556.1 – 1 = 555.1 Da
a wynik jest zgodny z masą teoretycznie obliczoną.
Na widmie MS widać również inny jon przy m/z = 557.2 o mniejszym natężeniu (intensywność jego wynosi ok. 25% jonu m/z = 556.1). Stanowi on sygnał od cząsteczki, w której atom 12C został zastąpiony przez atom 13C (istnieją trzy naturalnie występujące izotopy węgla, 12C oraz 13C i izotop 14C ). Intensywność obserwowanych w MS jonów m/z pochodzących od atomów izotopowych jest skorelowana z ilością naturalnie występującego izotopu pomnożoną przez całkowitą liczbę atomów węgla w cząsteczce. Dodatkowo fakt, że widoczny jon pochodzący od izotopu 13C ma masę o jedną jednostkę Da wyższą od jonu m/z pochodzącego od jonów 12C sugeruje, że z = 1 (jon pseudomolekularny jest pojedynczo naładowany). W przypadku, gdyby jon został podwójnie naładowany, a wartości jonów m/z różniłyby się tylko o 0,5 jednostki Da, wówczas oznaczałoby to, że z = 2.
Na widmie MS zauważyć można także jony przy m/z = 578.1. Skoro oczekiwana masa wynosi 555.2, to jest to sygnał pochodzący od jonu o 23 jednostki Da wyższy od
oczekiwanej masy cząsteczkowej. Ten jon można rozpoznać jako addukt sodowy [M + Na] + (dość często spotykany w jonizacji typu elektrorozpylanie). Zamiast jonizacji cząsteczek próbki przez przyłączenie protonu H +, niektóre cząsteczki są zjonizowane przez przyłączenie kationów sodu Na +.
Elektrorozpylanie jest techniką znaną jako "miękki" sposób jonizacji jako że anality ulegają zjonizacji przez przyłączenie lub odszczepienie protonu, z bardzo niewielką dodatkową energią nie powodującą fragmentacji analitu (zachowana zostaje cała struktura analitu).
Analiza MS substancji o masach cząsteczkowych większych niż ok. 1200 Da prowadzi zwykle do powstawania jonów wielokrotnie naładowanych, takich jak [M + nH] n + w trybie jonizacji dodatniej i [M-nH] n- w trybie ujemnej jonizacji. Przykładem takich
analitów są białka.
Białka mają wiele odpowiednich miejsc do protonowania jak wszystkie grupy amidowe, a także niektóre aminokwasy w łańcuchach bocznych, które zawierają podstawowe funkcje aminowe.
Przykładowe widmo MS pokazujące jony wielokrotnie naładowane, uzyskane w trakcie jonizacji za pomocą elektrorozpylania, jest przedstawione na Rysunku 5. Widoczne jony m/z powstały w pozytywnym trybie jonizacji lizozymu 1 z białka jaja kurzego.
Rysunek 5. Widmo ESI-MS lizozymu z białka kurzego
Próbkę poddano analizie w mieszaninie: acetonitryl i 0,1% wodny roztwór kwasu mrówkowego, 1:1 (v / v) i na widmie ESI-MS widoczny jest gaussowski rozkład jonów wielokrotnie naładowanych, począwszy od m/z = 1101.5 do 2044.6.
Wartości poszczególnych jonów m/z można wyrazić za pomocą następującego wzoru:
1 Lizozym jaja kurzego jest zasadowym polipeptydem zawierającym 129 aminokwasów o masie cząsteczkowej 14.4 D.
Jest to naturalny enzym występujący w białku jaja działający przeciwbakteryjnie bezpośrednio na bakterie gram dodatnie. Najbardziej charakterystyczną właściwością lizozymu jest jego zdolność do tworzenia kompleksów z innymi biopolimerami ( kompleks z owomucyną nadający żelową strukturę białka będący wskaźnikiem świeżości jaj ). Lizozym jest białkiem termostabilnym, szczególnie w środowisku kwaśnym i może być ogrzewany nawet do 100ºC. Lizozym ze względu na swoje właściwości znalazł zastosowanie w przemyśle spożywczym jako biokonserwant wielu produktów żywnościowych, w tym m.in. mięsa i produktów mięsnych, ryb i ich przetworów, mleka i produktów mleczarskich, świeżych warzyw, owoców , wina oraz w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym jako naturalny antybiotyk.
Szczególnie duże zastosowanie lizozym ma w technologii serów dojrzewających jako czynnik redukujący bakterie fermentacji kwasu masłowego, głównie bakterie z grupy Clostridia, Clostridium tyrobutyricum obniżających jakość i wartość handlową serów. Zastosowanie lizozymu eliminuje konieczność stosowania azotynów czy nadtlenku wodoru powszechnie stosowanych w serowarstwie, a jedną z jego głównych zalet z punktu widzenia producentów stanowi fakt, że umożliwia późniejsze wykorzystanie serwatki do celów handlowych.
m/z = (MW + nH +) / n (1)
gdzie:
m/z → stosunek masy do ładunku (zaznaczone na odciętej);
MW → masa cząsteczkowa analitu n → całkowita liczba jonów H → masa protonu (1,008 Da).
Jeżeli wielokrotność naładowania cząsteczki jest znana, to jest po prostu kwestia odczytania wartości m/z dla danego widma i rozwiązania powyższego równania w celu określenia masy cząsteczkowej analitu. Zazwyczaj jednak liczba ta nie jest znana. Jednakże, przyjmując założenie, że każde dwa sąsiadujące ze sobą jony w serii wielokrotnie naładowanych jonów różnią się jednym ładunkiem, to równanie (1) można rozwiązać.
Na przykład, jeśli jony m/z = 1431.6 widoczny na widmie ESI-MS lizozymu z białka kurzego (Rysunek 5) ma ładunek "n", to poprzedni jony przy m/z = 1301.4 będzie miał ładunek "n +1" . W związku z tym powyższe równanie (1) można zapisać ponownie na tych dwóch jonów w następujący sposób:
1431.6 = (MW + nH+) / n 1301.4 = [MW + (n +1) H+] / (n +1)
Rozwiązując te dwa równania z dwoma niewiadomymi (n, MW) otrzymujemy:
n (1431.6) - nH+ = (n +1) 1301.4 - (n +1) H+ a następnie:
n (1431.6) = n (1301.4) +1301.4 - H+ Zatem:
. i tak:
n = (1301.4 - H+) / (1431.6 - 1301.4) stąd jon przy m/z = 1431.6 jest dziesięciokrotnie naładowany.
Umieszczenie wartość z powrotem do równania daje:
1431.6 = (MW + nH +) n a w związku z tym:
1431.6 x 10 = MW + (10 x 1.008) i tak otrzymujemy:
MW = 14 316 – 10.08 MW = 14 305.9 Da
Zmierzona masa cząsteczkowa jest w dobrej zgodności z teoretyczną masą cząsteczkową lizozymu z białka kurzego (obliczoną na podstawie średnich mas atomowych)
→ MWteoret = 14305.14 Da.
Obliczenia takie można wykonać automatycznie lub przynajmniej pół-automatycznie.
Technika MALDI
Technika MALDI jest "miękką" metodą jonizacji. Fragmentacja jonów analitu zazwyczaj nie występuje. Technika ta umożliwia szybki i dokładny pomiar masy cząsteczkowej w zakresie 1÷400 000 Da, co jest szczególnie cenne dla biochemii – do pomiaru mas cząsteczkowych peptydów, białek, nukleotydów, a także oligosacharydów i lipidów. Istnieje możliwość prześledzenia procesu fragmentacji jonu molekularnego i odtworzenia na tej podstawie np. sekwencji aminokwasów. Tak więc możliwe się stają badania strukturalne białek (również w poznawaniu kodu DNA). W chemii polimerów technika MALDI pozwoli prześledzić profil rozkładu mas cząsteczkowych.
Technika MALDI wykorzystuje ideę użycia matrycy pośredniczącej w przekazywaniu energii do badanej substancji, ułatwiającej jonizację próbki i umożliwiającej badanie substancji nielotnych, wielkocząsteczkowych, polarnych. Matrycami stosowanymi w technice MALDI są substancje, które:
− dobrze absorbują promieniowanie z zakresu UV
− łatwo sublimują
− po desorpcji dostarczają dużych ilości jonów (protonów) potrzebnych do jonizacji badanej substancji
Najczęściej stosowane matryce przedstawiono na Rysunku 6.
Rysunek 6. Matryce najczęściej stosowane w technice MALDI
Analizowaną substancję rozpuszcza się w dowolnym, lotnym rozpuszczalniku.
Następnie roztwór próbki miesza się z roztworem matrycy (użytym w nadmiarze), ewentualnie dodając niewielkie ilości substancji ułatwiających powstawanie jonów (np. kwas trifluorooctowy, sole litowców i miedziowców). Mieszaninę, w ilości ok. 1 ml, nanosi się na płytkę ze stali nierdzewnej (slider) i pozwala odparować rozpuszczalnikowi w strumieniu powietrza. Celem jest doprowadzenie do wspólnego, jednorodnego wykrystalizowania mieszaniny badanej substancji i matrycy. Ponieważ jakość widma uwarunkowana jest równomiernym rozproszeniem badanej substancji w materiale matrycy, jest to etap niezwykle
istotny dla jakości widma. Po dokładnym wysuszeniu próbkę wprowadza się do komory pomiarowej aparatu i usuwa powietrze (średnia droga swobodna jonów ~1 m wymaga próżni 10–6 ÷ 10–7 Torr). Po uzyskaniu dostatecznej próżni wykonuje się właściwy pomiar. W aparacie wykorzystuje się laser gazowy N2 , pracujący impulsowo w zakresie nadfioletu (l = 337 nm). Skoncentrowany na powierzchni o średnicy 80–100 mm impuls laserowy trwający ok. 3 ns wywołuje ciąg następujących po sobie reakcji:
− Absorpcja promieniowania głównie przez materiał matrycy.
− Odparowanie próbki na głębokość 2–3 l, czyli 0,5–1 mm i wyrzucenie strumienia gazów prostopadle do jej powierzchni.
− Dysocjacja termiczna matrycy.
− Tworzenie jonów (głównie H+, Na+, K+).
− Reakcje jonów z badaną substancją i matrycą (→ dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation–anion, → oderwanie elektronu, → oderwanie bądź przyłączenie protonu,
→ przyłączenie kationu bądź anionu).
Wytworzone w ten sposób jony są przyspieszane w polu elektrycznym i kierowane do detektora.
Schematyczne przedstawienie mechanizmu jonizacji za pomocą techniki MALDI pokazano na Rysunku 7.
Rysunek 7. Schematyczne przedstawienie mechanizmu jonizacji za pomocą techniki MALDI
4.3. Zastosowania pomiarów w badaniach biologicznych/biochemicznych/biofizycznych
Spektrometria mas jest narzędziem analitycznym stosowanym między innymi do pomiaru masy cząsteczkowej analitu. Dla dużych cząsteczek (biomolekuł) masy cząsteczkowe mogą być mierzone z dokładnością 0,01% całkowitej masy cząsteczkowej, tj. 4 daltonów (Da) lub mas atomowych (UAM) analitu o Mcz 40000 Da. Jest to wystarczające, aby zaobserwować (zmierzyć) drobne zmiany w masie cząsteczkowej wynikające na przykład z zamiany jednego aminokwasu na inny, lub post-translacyjnej modyfikacji.
Dla małych cząsteczek organicznych masa cząsteczkowa może być mierzona z dokładnością do 5 ppm lub mniej, co jest często wystarczające, aby potwierdzić wzór sumaryczny związku, a także jest standardowym wymogiem do publikacji w czasopiśmie chemicznym.
Spektrometry mas mogą także dostarczać informacji na temat struktury związku. W tym celu stosuje się tzw tandemowe spektrometry mas. Cząsteczki badanej substancji poddaje się fragmentacji i detekcji podlegają właśnie te fragmenty. Ten sposób jest przydatny do badania sekwencji peptydów lub oligonukleotydów.
Technika MALDI jest szczególnie przydatna do wyznaczania masy cząsteczkowej następujących związków: Peptydy, Białka (M < 200 000 Da), Oligonukleotydy, Oligosacharydy, Polimery polarne zawierające heteroatom: poliwęglany, politlenki olefin i cykloolefin (M < 20 000 Da), Kaliksareny. Zadowalający efekt można uzyskać w przypadku analizy lipidów, związków metaloorganicznych, poliestrów, polimerów słabo polarnych (np.
polistyren). Jednakże technika ta nie nadaje się do badania polisacharydów czy poliolefin (polietylen, polipropylen).
4.4. Eksperymenty
Wersja 1
W celu wyznaczenia masy cząsteczkowej białka za pomocą spektrometru mas należy przygotować (Tabela 1):
Tabela 1. Warunki oznaczania masy cząsteczkowej białka w warunkach denaturujących)
Aparat Spektrometr mas MSD z pojedynczym
kwadrupolem i spektrometr mas QTOF
Źródło jonizacji elektrorozpylanie
Sposób gromadzenia danych z MS SCAN
Tryb jonizacji dodatni
Zakres mas m/z = 100-1500
Fragmentor 50-150 (należy optymalizować dla próbki)
Napięcie na kapilarze 5000V
Przepływ gazu suszącego 12 L/min
Temperatura gazu suszącego 300oC
Pompa do HPLC Umożliwia wprowadzenie roztworu białka do komory jonizacyjnej
Faza ruchoma – warunki denaturujące Mieszanina (50:50) acetonitrylu i wody zawierających 0.1% kwasu mrówkowego Roztwór białka (np. mioglobina) Białko (np. mioglobina) w ilości 0.1 – 0.5 mg
rozpuścić w fazie ruchomej Objętość wprowadzanego roztworu (dla
automatycznego podajnika próbek) 5 µL
Procedura wyznaczania masy cząsteczkowej białka:
1. Włączyć spektrometr mas z pojedynczym kwadrupolem i ustawić parametry zgodnie z zaleceniami przedstawionymi w Tabeli 1.
2. Przygotować 100 mL fazy ruchomej.
3. Przemyć pompę przygotowaną fazą ruchomą.
4. Przygotować 0.5 – 1 mL roztworu białka rozpuszczonego w fazie ruchomej.
5. Przenieść roztwór do naczynia i umieścić w pozycji 1 automatycznego podajnika próbek.
6. Przeprowadzić analizy przygotowanego roztworu białka w warunkach różnego napięcia przyłożonego do kapilary (wartość fragmentora należy zmieniać w zakresie od 50 do 200 jednostek, co 25 jednostek) i wyznaczyć wartość optymalną (rozmieszczenie jonów wielokrotnie naładowanych na widmie MS musi mieć rozkład zbliżony do gaussowskiego).
7. Na podstawie widma MS uzyskanego dla optymalnych parametrów pracy spektrometru mas należy:
◦ wybrać dwa sąsiadujące ze sobą jony (najlepiej te o najwyższej intensywności)
◦ obliczyć wielokrotność naładowania wybranego jonu stosując równanie (1)
◦ znając wielokrotność naładowania jonu, obliczyć masę cząsteczkową białka 8. Powtórzyć analizy MS stosując analizator czasu przelotu mas (QTOF).
9. Wyznaczyć rozdzielczość użytych w trakcie ćwiczenia spektrometrów mas. Miarą rozdzielczości spektrometru jest zdolność do rozróżnienia dwóch jonów o pewnej różnicy stosunku masy do liczby ładunków elementarnych jonów (m/z) → m i m+∆m.
Rozdzielczość można wyliczyć ze wzoru: R = m / ∆m. Spektrometr o rozdzielczości 1000 będzie umożliwiał rozróżnienie dwóch cząsteczek o m/z równym 1000 i 1001.
Najczęściej uznaje się, że jeśli na widmie m/z dolina pomiędzy pikami dwóch jonów jest głębsza niż 50% wysokości pików, to są one rozróżnione.
10. Określić dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej dla obu aparatów stosując roztwór tetracykliny o stężeniu 0.5 mg/mL. Dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej jest zdefiniowana jako różnica pomiędzy zmierzoną i obliczoną masą dla danego jonu. Jest ona podawana w % zmierzonej masy (np. 10 000 ± 0.01%) lub w ppm (np. 10 000 ± 100 ppm).
11. Dokonać interpretacji otrzymanych danych porównując informacje uzyskane podczas ćwiczenia (wyznaczona masa cząsteczkowa białka, dokładność i rozdzielczość) z użyciem różnych spektrometrów mas.
