ACTTGCCCTAATTTTTCC R-CACAACACCCTCTTC

Produkty reakcji amplifikacji rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym i analizowano w świetle UV. Enzymy do analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) wybrano na podstawie literatury. Zastosowano enzymy: BfaI (ekson 1 i 20) oraz AlwNI (ekson 11) (Edwards i wsp. 1997, Wise i wsp. 1997).

W celu poznania dokładnego charakteru mutacji produkty PCR poddano analizie se-kwencyjnej, która została wykonana w Pracowni Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oli-gonukleotydów IBB PAN w Warszawie.

WYNIKI I DYSKUSJA

Po przeprowadzeniu analizy u 20 pacjentów i 100 osób zdrowych – w eksonie 1 nie stwierdzono zmian w rozdziale elektroforetycznym. Analiza sekwencyjna nie wykazała

Mutacje eksonu 1, 11 oraz 20 genu TCOF1 ... 59

obecności mutacji w pozycji c.106 C>T (Q36X) (ryc. 1). Długość produktu PCR wyno-si 220pz; gdyby wystąpiła mutacja, to enzym przeciąłby produkt PCR na 2 fragmenty o długości: 199pz oraz 21pz.

Po przeprowadzeniu analizy u 20 pacjentów i 100 osób zdrowych – w eksonie 11 nie stwierdzono zmian w rozdziale elektroforetycznym. Analiza sekwencyjna również nie wykazała obecności mutacji w pozycji c.1552 G>A (ryc. 2). Długość produktu PCR wynosi 339pz, długość prawidłowych fragmentów po trawieniu enzymem AlwNI – 131pz oraz 208pz. Wskazuje to na brak mutacji w sekwencji tego eksonu.

Po przeprowadzeniu analizy u 20 pacjentów i 100 osób zdrowych – w eksonie 20 nie stwierdzono zmian w rozdziale elektroforetycznym. Analiza sekwencyjna również nie wykazała obecności mutacji w pozycji c.3121C>T (ryc. 3). Długość produktu PCR wy-nosi 317pz, gdyby wystąpiła mutacja, to enzym przeciąłby produkt PCR na 2 fragmenty o długości: 101pz oraz 216pz.

Mutacje w eksonach 1, 11 oraz 20 wybrano na podstawie dostępnej literatury (Edwards i wsp. 1997, Wise i wsp. 1997). Występowanie mutacji w danym eksonie sprawdzane było przy zastosowaniu metody PCR, rozdziału elektroforetycznego, RFLP oraz sekwen-cjonowania.

Mutacja c.106C>T w eksonie 1 opisana przez Edwardsa w 1997 roku to mutacja przekazywana rodzinnie. W eksonie 1, poza poszukiwaną w tej pracy mutacją, odkryto kilka innych: c.28delC, c.41delT (Ellis i wsp. 2002), c.61delG (Dixon i wsp. 2004) oraz c.3G>A (Teber i wsp. 2004). Większość z tych mutacji to mutacje powodujące zmianę ramki odczytu. Rzadką mutacją typu missense jest c.40A>T, powodująca efekt w białku I14F (Dixon i wsp. 2004). Jak do tej pory, nie znaleziono w eksonie 1 polimorfizmów.

Polimorfizm w eksonie 11 c.1552 G>A został opisany przez Wise jako jeden z 5 nowych zmian, odkrytych w 1997 roku. Naukowcy zbadali częstość występowania tego polimorfizmu. Okazało się, że występuje on u 3 osób na 99 badanych, co stano-wi 3%. Polimorfizm c.1552 G>A opisał w swoich pracach także Teber w 2004 roku. W eksonie 11, jak do tej pory, znaleziono jeszcze 2 polimorfizmy: c.1530 G>T (Splen-dore i wsp. 2000, Teber i wsp. 2004) oraz c.1611 G>A (Wise i wsp. 1997, Teber i wsp. 2004, Su i wsp. 2006). Są to polimorfizmy typu cichego. Odkryte zostały także mutacje: c.1552delG; c.1565T>C (Teber i wsp. 2004).

Mutacja c.3121C>T w eksonie 20 opisana przez Edwards’a w 1997 roku to mutacja przekazywana rodzinnie. Spośród analizowanych eksonów, najwięcej, bo aż 7 mutacji odnotowano w eksonie 20. Ponad połowa to delecje, które powodują zmianę ramki od-czytu (np. c.3086_3092delCACTCCC (Splendore i wsp. 2000); c.3102_3142del (Ellis i wsp. 2002). Odkryto także polimorfizm c.3279C>T, typu cichego (Splendore i wsp. 2000).

W badanej grupie 20 osób obciążonych zespołem TCS oraz w 100-osobowej grupie kontrolnej pochodzącej z polskiej populacji nie udało się odnaleźć trzech poszukiwanych zmian: c.106C>T w eksonie 1, c.1552 G>A w eksonie 11 oraz c.3121C>T w eksonie 20 genu TCOF1. Brak występowania mutacji w analizowanych eksonach może świadczyć o tym, że za objawy zespołu TCS w analizowanej grupie osób chorych odpowiadają inne mutacje w ww. eksonach bądź też w innych eksonach.

40% mutacji powodujących TCS jest dziedzicznych, reszta to wynik mutacji de novo (Splendore i wsp. 2000). Warto przeprowadzać więc badania molekularne, ponieważ od-grywają one bardzo ważną rolę w poradnictwie genetycznym dla rodzin, w których jest

60 _{Barbara Wierzbicka i wsp.}

osoba z zespołem Treachera Collinsa. Diagnostyka jest ważna, kiedy to rodzice chorego dziecka chcą planować kolejnego potomka, badania pomogą w podjęciu decyzji. Badania molekularne można przeprowadzić w pierwszym trymestrze ciąży (Dixon i wsp. 2007). Jeśli znaleziona mutacja jest typu de novo, to ryzyko urodzenia drugiego chorego dziecka jest małe i wynosi 2–3%, natomiast gdy jedno z rodziców jest dotknięte TCS, to prawdo-podobieństwo przekazania choroby wynosi 50% (Ellis i wsp. 2002).

Badania prenatalne są tak samo ważne jak postnatalne, ponieważ pozwalają rozznać TCS we wczesnym stadium rozwoju. Jednak analiza DNA ograniczona jest po-przez ryzyko pobrania próbek z kosmówki. Badania prenatalne przeprowadzane są także z użyciem sonografu, fotoskopu i ultradźwięków (Ellis i wsp. 2002). Fotoskop pozwala obejrzeć płód i łożysko w czasie rozwoju wewnątrzmacicznego, dzięki temu lekarz może rozpoznać różne nieprawidłowości. Takie badania można przeprowadzić dopiero w dru-gim trymestrze ciąży (Dixon i wsp. 2007).

Ryc. 1. Analiza sekwencyjna eksonu 1 genu TCOF1. Strzałką ↓ zaznaczono potencjalne miejsce występowania zmiany. A, osoba zdrowa; B, chory

Fig. 1. Sequential analysis of exon 1 of the TCOF1 gene. The arrow ↓ indicates potential mutation sites. A, healthy control; B, patient

Mutacje eksonu 1, 11 oraz 20 genu TCOF1 ... 61

Ryc. 2. Analiza sekwencyjna eksonu 11 genu TCOF1. Strzałką ↓ zaznaczono potencjalne miejsce występowania zmiany. A, osoba zdrowa; B, chory

Fig. 2. Sequential analysis of exon 11 of the TCOF1 gene. The arrow ↓ indicates potential muta-tion sites. A, healthy control; B, patient

62 _{Barbara Wierzbicka i wsp.}

Ryc. 3. Analiza sekwencyjna eksonu 20 genu TCOF1. Strzałką ↓ zaznaczono potencjalne miejsce występowania zmiany. A, osoba zdrowa; B, chory

Fig. 3. Sequential analysis of exon 20 of the TCOF1 gene. The arrow ↓ indicates potential muta-tion sites. A, healthy control; B, patient

WNIOSKI

Po przeprowadzeniu analiz stwierdza się brak mutacji: c.106C>T w eksonie 1, c.3121C>T w eksonie 20 oraz c.1552 G>A w eksonie 11 w genie TCOF1 u 20 osób cho-rych i 100 osób zdrowych. Świadczy to o tym, że zespół Treachera Collinsa w badanej grupie osób chorych może być spowodowany przez inne mutacje.

Mutacje eksonu 1, 11 oraz 20 genu TCOF1 ... 63

PIśMIENNICTWO

Andrade E.C., Junior V.S., Didoni A.L. S., Freitas P.Z., Carneiro A.F., Yoshimoto F.R., 2006. Treacher Collins syndrome with choanal atresia: a case report and review of disease features. Rev. Bras. Otorrinolaringol., 71(1): 107–10.

Dixon J., Ellis I., Bottani A., Temple K., Dixon M.J., 2004. Identification of mutations in TCOF1: use of molecular analysis in the pre- and postnatal diagnosis of Treacher Collins syndrome. Am. J. Me. Genet.,127A: 244–248.

Dixon J., Trainor P., Dixon M.J., 2007. Treacher Collins syndrome. Orthod Craniofac Res., 10

(2): 88–95.

Edwards S.J., Gladwin A.J., Dixon M.J., 1997. The mutational spectrum in Treacher Collins syn-drome reveals a predominance of mutations that create a premature-termination codon. Am. J. Hum. Genet., 60: 515–524.

Ellis P.E., Dawson M.I., Dixon M.J., 2002. Mutation testing in Treacher Collins syndrome. J.

Or-thod., 29(4): 293–7.

Gladwin A.J., Dixon J., Loftus S.K., Edwards S., Wasmuth J.J., Hennekam R.C.M., Dixon M.J., 1996. Treacher Collins syndrome may result from insertions, deletions or splicing mutations, which introduce a termination codon into the gene. Hum Mol Genet., 10: 1533–1538.

Horiuchi K., Ariga T., Fujioka H., Kawashima K., Yamamoto Y., Igawa H., Sakiyama Y., Sugi-hara T., 2004. Treacher Collins syndrome with craniosynostosis, choanal atresia and esopha-geal regurgitation caused by a novel nonsense mutation in TCOF1. Am J Med Genet., 128A: 173–175.

Horiuchi K., Ariga T., Fujioka H., Kawashima K., Yamamoto Y., Igawa H., Sakiyama Y., Sugihara T., 2005. Mutational analysis of the TCOF1 gene in 11 japanese patients with Treacher Collins syndrome and mechanism of mutagenesis. Am J Med Genet., 134A: 363–367.

Isaac C., Marsh K.L., Paznakas W.A., Dixon J., Dixon M.J., Jabs E.W., Meier U.T., 2000. Charac-terization of the nucleolar gene produkt, treacle, in Treacher Collins syndrome. Mol Biol.Cell., 11(9): 3061–3071.

Jones N.C., Farlie P.G., Minichiello F., Newgreen D.N., 1999. Detection of an appropriate kinase activity in branchial arches I and II that coincides with peak expression of the Treacher Collins syndrome gene product, treacle. Hum Mol Genet., 12: 2239–2245.

Madhan R., Nayar S., 2006. Prosthetic management of a patient with Treacher Collins syndrome.

Indian J Dent Res.,17(2): 78–81.

Marsh K. L., Dixon J., Dixon M. J., 1998. Mutations in the Treacher Collins syndrome gene lead to mislocalization of the nucleolar protein treacle. Hum. Mol. Genet., 7: 1795–1800.

Marszałek B., Wójcicki P., Kobus K., Trzeciak W.H., 2002. Clinical features, treatment and genetic background of Treacher Collins syndrome. J. Appl. Genet., 43(2): 223–233.

Marszałek-Kruk B., Wójcicki P., Kobus K., Trzeciak W.H., 2006. Genetic polymorphism of TCOF1 does not correlate with symptoms of Treacher Collins syndrome. Polski Przegląd Chirurgiczny, 78, 11: 1239–1251.

Paznekas W.A., Zhang N., Gridley T., Jabs E.W., 1997. Mouse TCOF1 is expressed widely, has mo-tifs conserved in nucleolar phosphoproteins, and maps to chromosome 18. Biochem Biophys Res Commun., 238: 1–6.

Shoo B.A., McPherson E., Jabs E.W., 2004. Mosaicism of a TCOF1 mutation in an individual clini-cally unaffected with Treacher Collins syndrome. Am. J. Med. Genet., 126A: 84–88.

So R.B., Gonzales B., Henning D., Dixon J., Dixon M.J., Valdez B.C., 2004. Another face of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene: identification of additional exons. Gene. 328: 49– 57.

Splendore A., Silva E.O., Alonso L.G., Richeri-Costa A., Alonso N., Rosa A., Carakushanky G., Cavalcanti D.P., Brunoni D., Passos-Bueno R.R., 2000. High mutation detection rate in TCOF1

64 _{Barbara Wierzbicka i wsp.}

among Treacher Collins syndrome patients reveals clustering of mutations and 16 novel patho-genic changes. Hum. Mutat., 16: 315–322.

Splendore A., Jabs E.W., Passon-Bueno M.R., 2002a. Screening of TCOF1 in patients from differ-ent populations: confirmation of mutational hot spots and iddiffer-entification of a novel missense that suggests an important functional domain in the protein treacle. J. Med. Genet., 39: 493–495. Splendore A., Jabs E.W., Passon-Bueno M.R., Van Maldergem L., Wulfsberg E.A. 2002b. TCOF1

mutations excluded from a role in other first and second branchial arch-related disorders. Am J. Med. Genet., 111: 324–327.

Splendore A., Fanganiello R.D., Masotti C., Morganti L.A.C., Passos-Bueno M.R., 2005. TCOF1 mutation database: novel mutation in the alternatively spliced exon 6A and update in mutation nomenclature. Hum. Mutat., 25, 429–434.

Su P.H., Chen J.Y., Chen S.J., Yu J.S., 2006. Treacher Collins syndrome with a de Novo 5-pb dele-tion in the TCOF1 gene. J. Formos Med. Assoc., 105,6: 518–521.

Teber Ö.A., Gillessen-Kaesbach G., Fischer S., Böhringer S., Albrecht B., Albert A., Arslan-Kirch-ner M., Haan E., Hagedorn-Greiwe M., Hammans C., Henn W., Hinkel G.K., König R., Kun-stman K., Kunze J., Neumann L.M., Prott E.C., Rauch A., Rott H.D., Seidel H., Spranger S., Sprangel M., Zoll B., Lohmann D.R., Wieczorek D., 2004. Genotyping In 46 patients with tentative diagnosis of Treacher Collins syndrome revealed unexpected phenotypic variation. Eur. J. Hum. Genet., 1–12.

Wise C.A., Chiang L.C., Paznekas W.A., Sharma M., Musy M.M., Ashley J.A., Lovett M., Jabs E.W., 1997. TCOF1 gene encodes a putative nucleolar phosphoprotein that exhibits mutations in Treacher Collins syndrome throughout its coding region. Proc Natl Acad Sci., 94: 3110– 3115.

Winokur S.T., Shiang R., 1998. The Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product, treacle, is targeted to the nucleolus by signals in its C-terminus. Hum. Mol. Genet., 12:1947–1952. Wójcicki P., Marszałek-Kruk B., 2005. Uwarunkowania genetyczne oraz zasady leczenia zespołu

Treachera Collinsa. Dent. Med. Probl., 42, 4: 619–626.

MUTATIONS OF 1, 11 AND 20 EXONS OF THE TCOF1 GENE IN PATIENTS