Aktywność biologiczna

Badania mające na celu określenie aktywności fungistatycznej, herbicydowej, deterentnej oraz skuteczność syntezowanych związków jako adiuwanty wykonano we współpracy z Instytutem Ochrony Roślin – Państwowym Instytutem Badawczym w Poznaniu. Testy aktywności cieczy jonowych wobec mikroorganizmów przeprowadzono we współpracy z Zakładem Stosowania i Formulacji Pestycydów Instytutu Przemysłu Organicznego w Warszawie.

4.3.1. Działanie fungistatyczne

Próbkę związku rozpuszczonego w 4 mL metanolu dodano w stężeniach 10, 100 oraz 1000 ppm do sterylnego podłoża z odżywką (PDA – Potato Dextrose Agar, Difco^TM), podgrzanego do 50^oC. Płynne podłoże zawierające badany związek wylano na płytki Petriego o średnicy 50 mm. Krążki badanych izolatów o średnicy 4 mm wyłożono na środek płytki. Układ kontrolny stanowiły płytki z podłożem zawierającym czysty metanol. Badane związki porównywano z preparatami handlowymi zawierającymi tebukonazol (Tebu 250 EW) lub propikonazol (Bumper 250 EC). Płytki inkubowano

46 w temperaturze otoczenia, do momentu osiągnięcia przez kontrolę brzegu płytki. Następnie mierzono średnicę grzybni, odejmując wartość początkową (4 mm).

Dla każdego związku wykonano 4 powtórzenia doświadczenia. Zmierzone wartości poddano analizie statystycznej Student-Newman-Keuls, wyznaczając różnice pomiędzy kontrolą a układami badanymi. Aktywność związków testowano wobec grzybów z gatunków Fusarium culmorum, Microdochium nivale, Botrytis cinerea i Sclerotina sclerotiorum z kolekcji IOR-PIB w Poznaniu.

4.3.2. Właściwości herbicydowe

Ciecze jonowe rozpuszczono w układzie woda:etanol w stosunku objętościowym 1:1, w ilości odpowiadającej 170 g anionu 3,6-dichloro-2-metoksybenzoesanowego w przeliczeniu na 1 ha. Jako środki porównawcze zastosowano komercyjny herbicyd zawierający kwas 3,6-dichloro-2-metoksybenzoesowy stosowany w dawce 700 g w 1 L preparatu.

Nasiona wysiano do doniczek napełnionych glebą na głębokość równą 1 cm i umieszczono w szklarni w celu zapewnienia optymalnych warunków dla wzrostu roślin (temperatura 20±2^oC, wilgotność powietrza 60%). Po wytworzeniu liścieni dokonano przerywki, pozostawiając po 4 rośliny w każdej doniczce. Zabieg wykonano w fazie 4 liści roślin BBCH 14 (BBCH, niem. Biologische Bundessortenamt und Chemische Industrie) za pomocą opryskiwacza kabinowego wyposażonego w rozpylacze TeeJet 110/02.

Opryskiwacz przemieszczał się nad roślinami ze stałą prędkością 3,1 m/s. Odległość rozpylacza od wierzchołków roślin wynosiła 40 cm, ciśnienie cieczy w rozpylaczu wynosiło 2 bar, a wydatek cieczy w przeliczeniu na 1 ha wynosił 200 L.

Po wykonaniu zabiegu doniczki z roślinami ponownie umieszczono w szklarni, w temperaturze 20±2^oC i wilgotności powietrza 60%. Czas oświetlania wynosił 16 godzin na dobę. Po upływie 2 tygodni, rośliny ścięto tuż nad glebą i określono ich masę z dokładnością do 0,01 g.

Badanie wykonano w 4 powtórzeniach w układzie całkowicie losowym.

Na podstawie uzyskanych pomiarów obliczono redukcję świeżej masy roślin w porównaniu do kontroli (rośliny nieopryskiwane).

47 4.3.3. Badania cieczy jonowych jako adiuwanty środków ochrony roślin

Nasiona rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. napus) wysiano do doniczek napełnionych glebą na głębokość równą 1 cm i umieszczono w szklarni w celu zapewnienia optymalnych warunków dla wzrostu roślin (temperatura 20±2^oC, wilgotność powietrza 60%, fotoperiod 16 godz./doba). Po wytworzeniu liścieni dokonano przerywki, pozostawiając po 5 roślin w każdej doniczce.

Do sporządzenia cieczy użytkowej, zastosowano komercyjny herbicyd Chwastox Extra 300 SL zawierający 300 g MCPA w formie soli sodowo-potasowej w 1 L preparatu, w dawce odpowiadającej 400 g substancji czynnej na 1 ha. Zastosowana dawka herbicydu jest o ponad połowę niższa od zalecanej (dawka rekomendowana wynosi 900 g MCPA na 1 ha). Następnie do cieczy użytkowej dodano odpowiedni adiuwant w postaci cieczy jonowej, w ilości odpowiadającej odpowiednio 0,1 lub 0,2%.

Zabieg wykonano w fazie 4 liści (BBCH 14) za pomocą opryskiwacza kabinowego wyposażonego w rozpylacze TeeJet 110/02. Opryskiwacz przemieszczał się nad roślinami ze stałą prędkością 3,1 m/s. Odległość rozpylacza od wierzchołków roślin wynosiła 40 cm, ciśnienie cieczy w rozpylaczu wynosiło 1,5 bar, a wydatek cieczy w przeliczeniu na 1 ha wynosił 200 L.

Po wykonaniu zabiegu doniczki z roślinami ponownie umieszczono w szklarni, a po upływie 2 tygodni, rośliny ścięto tuż nad glebą i określono ich masę z dokładnością do 0,01 g. Badanie wykonano w 4 powtórzeniach w układzie całkowicie losowym.

Na podstawie uzyskanych pomiarów obliczono redukcję świeżej masy roślin w porównaniu do kontroli (rośliny nieopryskiwane). Skuteczność działania oceniano także wizualnie, używając skali od 1-100%, gdzie 0 oznacza brak działania, a 100% - całkowite zniszczenie roślin.

4.3.4. Aktywność wobec mikroorganizmów

Badanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej wykonano metodą kolejnych rozcieńczeń, w celu wyznaczenia wartości minimalnych stężeń związków, przy których następowało zahamowanie wzrostu mikroorganizmów (MIC) oraz wystąpienie zjawiska biobójczego – MBC wyznaczonego dla bakterii oraz MFC określonego dla grzybów.

Szczepy bakterii wyhodowano na pożywce Mullera-Hintona w czasie 24 godzin, w przypadku grzybów na pożywce Sabourauda w czasie 48 godzin. Następnie przygotowano zawiesinę każdego z mikroorganizmów o stężeniu 106 cfu/mL, z której

48 przygotowano kolejne stężenia pożywek niezbędnych do przeprowadzenia badania.

Wzrost mikroorganizmów lub jego brak określono wizualnie, po inkubacji trwającej 24 godziny w temperaturze 37^oC dla bakterii oraz 48 godzin w temperaturze 29^oC, w przypadku grzybów. Najmniejsze stężenie, przy którym zaobserwowano brak wzrostu mikroorganizmów, oznaczono jako MIC.

W kolejnym etapie jednakową ilość każdej próbki dodano do pożywki agarowej z czynnikiem dezaktywującym składającym się w 0,3% z lecytyny, 3% polisorbinianu 80 oraz 0,1% L-cysteiny. Tak przygotowany układ inkubowano w czasie 24 godzin, w temperaturze 37^oC (bakterie) lub przez 5 dni, w temperaturze 29^oC (grzyby).

Najmniejsze stężenie, w którym nie zauważono kolonii mikroorganizmów określono jako MBC lub MFC. Test wykonano wobec mikroorganizmów: Micrococcus luteus ATCC 9341, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecium ATCC 49474, Moraxella catarrhalis ATCC 25238, Escherichia coli NCTC 8196, Bacillus subtilis ATCC 6633, Serratia marcescens ATCC 8100, Proteus vulgaris NCTC 4635, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Candida albicans ATCC 10231, Rhodotorula rubra (Demml 1889, Lodder 1934). Standardy szczepów dostarczone były z kolekcji kultur bakterii brytyjskich (National Collection of Type Cultures – NCTC w Londynie) i amerykańskich (American Type Culture Collection – ATCC). Szczep Rhodotorula rubra pozyskano ze zbiorów Zakładu Bakteriologii Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu.

4.3.5. Działanie deterentne

Badania wykonano w Instytucie Ochrony Roślin – Państwowym Instytucie Badawczym w Poznaniu, według procedury opisanej przez Nawrota.¹⁹⁷ Działanie deterentne zostało określone na podstawie pokarmu pobranego przez organizmy testowe.

Wyznaczono wartości trzech wskaźników:

 wskaźnik bezwzględny (A) obliczono na podstawie wzoru:

𝐴 =(𝐶𝐶 − 𝑇𝑇)

(𝐶𝐶 − 𝑇𝑇)∗ 100

w którym CC oznacza ilość pokarmu pobranego w układzie kontrolnym, a TT ilość pokarmu pobranego w układzie badawczym, w którym obecna była jedynie próbka testowa.

49

 wskaźnik względny (R) obliczono z zależności:

𝑅 =(𝐶 − 𝑇)

(𝐶 + 𝑇)∗ 100

gdzie C jest ilością pokarmu pobraną w układzie kontrolnym z możliwością wyboru, a T ilością pokarmu w układzie testowym, w którym owady miały wybór pomiędzy próbką odniesienia i próbką badaną.

 wskaźnik sumaryczny (T), jako sumę wartości wskaźników bezwzględnego i względnego:

𝑇 = 𝐴 + 𝑅

Działanie deterentne określono na podstawie ilości uzyskanych punktów, według skali przedstawionej w tabeli 2.

Tabela 2. Kryteria oceny aktywności deterentnej¹⁹⁷

Współczynnik sumaryczny Aktywność deterentna

200-151 Bardzo dobra

150-101 Dobra

100-51 Średnia

0-50 Słaba

-200-0 Brak aktywności (antraktant)

Związki testowano wobec chrząszczy wołka zbożowego (Sitophilus granarius), chrząszczy i larw trojszyka ulca (Tribolium confusum) oraz larw skórka zbożowego (Trogoderma granarium). Związkiem odniesienia była azadirachtyna.¹⁹⁸

50