Antysensowe oligonukleotydy (ASO)

Antysensowe oligonukleotydy (ASO) to jednoniciowe fragmenty DNA lub RNA o ograniczonej długości. Wiążą się specyficznie do komplementarnych sekwencji na zasadzie parowania zasad Watsona-Cricka. Pierwsze zastosowanie ASO jako potencjalnego czynnika przeciwwirusowego zostało opublikowane w roku 1978.⁵³ Badania dotyczyły obniżenia replikacji wirusa RSV przy użyciu 13-nukleotydowego oligomeru DNA. Od tego czasu w praktyce laboratoryjnej zastosowanie znalazło wiele modyfikacji, które pozwoliły nadać ASO nowe, korzystne z aplikacyjnego punktu widzenia cechy. Głównym celem było zwiększenie siły wiązania ASO do rejonów docelowych RNA, selektywności oraz stabilności enzymatycznej przy jednoczesnym braku toksyczności. Modyfikacje wprowadzane były do różnych elementów składowych ASO - heterocyklicznej zasady, pierścienia cukrowego, wiązania fosfodiestrowego i szkieletu fosfocukrowego - skutkując powstaniem kilku generacji analogów.⁵⁴ ASO wykazują preferencję wiązania względem dostępnych rejonów jednoniciowych. Efekty wywoływane przez hybrydyzację mogą się różnić w zależności od budowy ASO. Łącząc się z miejscami docelowymi mogą maskować miejsca potencjalnych interakcji trzeciorzędowych RNA-RNA oraz RNA-białko, uniemożliwiając prawidłowy przebieg procesów zależnych od RNA. Może także dochodzić do przecinania docelowego RNA za pośrednictwem RNaz. Dzieje się tak w przypadku gapmerów, czyli ASO zawierających ciąg deoksyrybonukleotydów, który tworzy z rejonem docelowym heterodupleks DNA:RNA będący substratem RNazy H.⁵⁴

Badania nad inhibicją wirusa grypy z użyciem tej strategii rozpoczęły się u schyłku lat 80-tych. Już wtedy pojawił się pierwszy zarys koncepcji zakładającej, że możliwe jest zaprojektowanie ASO, które zapewniałyby ochronę przed infekcją wieloma szczepami wirusa. Efekt ten miał zostać osiągnięty przez celowanie w 5’ i 3’ terminalne rejony RNA o zachowawczej sekwencji pośród segmentów i szczepów wirusa grypy.

28 Pierwsza z opublikowanych prac tego nurtu dotyczyła oligonukleotydów DNA selektywnie hamujących efekt cytopatyczny wywoływany przez wirusa grypy w komórkach MDCK.⁵⁵ ASO nakierowane były na 3’ terminalny rejon sekwencji wspólnej dla wszystkich segmentów. Doświadczenia zostały przeprowadzone dla szczepów A/PR/8/34 (H1N1), A/Victoria/3/75 (H3N2) oraz A/Philippines/2/82 (H3N2), lecz nie dla wszystkich został osiągnięty satysfakcjonujący efekt inhibicji. Ten sam zamysł został zrealizowany w innych badaniach z użyciem szczepów A/PR/8/34 (H1N1), A/Udorn/307/72 (H3N2) oraz A/New Caledonia/20/99 (H1N1).⁵⁶ Efekt inhibitorowy został osiągnięty i wywołał ochronne działanie względem testowanych myszy.

W kolejnej pracy, testowano ASO względem rejonów terminalnych 5’ i 3’ PB2 vRNA, obejmujących sygnały pakowania.⁵⁷ Efekt zahamowania namnażania wirusa został osiągnięty w warunkach komórkowych dla ośmiu szczepów H1N1. Podobną aktywność przeciwwirusową wobec kilku szczepów wirusa wykazano dla ASO nakierowanych na rejony pakowania segmentów PB1 i PA.⁵⁸ Konserwatywny rejon terminalny był także celem działania ASO o dużej aktywności w badaniach przeprowadzonych na wysoce patogennym szczepie A/Tiger/Harbin/01/2002 (H5N1).⁵⁹ Doświadczenia na myszach pozwoliły stwierdzić, że miano wirusa w płucach zostało skutecznie obniżone, a pozostałe negatywne efekty zdrowotne wywoływane przez patogen zniwelowane.

W badaniach komórkowych testowano również ASO nakierowane na kodony AUG mRNA PB1, PB2, PA i NP.⁶⁰ Rezultaty potwierdziły efekt przeciwwirusowy zależny od położenia miejsca hybrydyzacji względem kodonu AUG. Maksymalna uzyskana inhibicja szczepu A/PR8/34 (H1N1) wynosiła 78%. Kontynuacją tych doświadczeń było przeprowadzenie testów na myszach, w których uzyskano zbliżone wyniki zahamowania namnażania wirusa. Odnotowano 10-krotne obniżenie miana wirusa w płucach myszy infekowanych wirusem H1N1.^{61, 62}

Ponadto, opublikowane prace prezentowały także wyniki działania modyfikowanych ASO. Oligomery nakierowane na segment PB1 oraz PA okazały się zdolne do zahamowania namnażania wirusów szczepu A/PR8/34 (H1N1) oraz A/WSN/33 (H1N1) w teście łysinkowym.^{63, 64} Efekt inhibitorowy modyfikowanych ASO działających na miejsce wiązania białka NP z RNA uchronił zainfekowane myszy przed działaniem śmiertelnej dawki wirusa.⁶⁵ Kolejne doświadczenia polegały na celowaniu w konserwatywne rejony genu NS1 wysoce patogennego szczepu A/Chicken/Henan/1/04 (H5N1).⁶⁶ Wyniki analiz przeprowadzonych na tkance płuc oraz zainfekowanych

29 zwierzętach pozwoliły stwierdzić obniżenie miana wirusa pod wpływem modyfikowanych ASO. Zaproponowano, że w przyszłości ASO mogą posłużyć jako forma profilaktyki oraz terapii zakażeń wirusem grypy u ludzi.

W opublikowanych pracach stosowano również syntetyczne analogii kwasu nukleinowego w formie koniugatów oligomerów morfolinowych i peptydów penetrujących komórki. ASO nakierowane były na miejsce startu translacji mRNA PB1 i NP, a także region 3’-terminalny vRNA NP szczepu SC35M H7N7.⁶⁷ Wykazano redukcję miana wirusa i przeżycie 30% infekowanych myszy. Ponadto, oligomery morfolinowe były stosowane przeciwko wirusowi szczepu A/Eq/Miami/1/63 (H3N8).⁶⁸ Wywołały one obniżenie replikacji wirusa o 95% u myszy. W innych badaniach testowano oligomery morfolinowe nakierowane na sekwencje konserwatywne pośród szczepów oraz uważane za funkcjonalnie istotne.⁶⁹ Dwa z nich - celujący w kodon AUG mRNA PB1 oraz 3’-terminalny rejon vRNA NP - wykazały potencjał hamujący względem szerokiego spektrum szczepów: A/WSN/33 (H1N1), A/Memphis/8/88 (H3N2), A/Eq/Miami/63 (H3N8), A/Eq/Prague/56 (H7N7) oraz A/Thailand/1(KAN-1)/04 (H5N1).

Badania nad strukturą drugorzędową segmentów wirusa z użyciem technik eksperymentalnych oraz bioinformatycznych zapoczątkowały nowe podejście do projektowania ASO.25-27, 37-39 Jego podstawą jest selekcja miejsc docelowego działania oligomerów bazująca na danych strukturalnych wskazujących istnienie miejsc jednoniciowych i dostępnych dla hybrydyzacji. Metodę zastosowano względem segmentów vRNA8, vRNA5 oraz (+)RNA5. W pełni 2’-O-metylowane oligomery zawierające nukleotydy typu LNA nakierowane głównie na rejony wewnętrzne segmentów wykazały inhibicję wirusa A/California/04/2009 (H1N1).25, 27, 38, 39 Obniżenie miana wirusa dla najlepszych testowanych ASO było kilkudziesięciokrotne w komórkach MDCK.

Badania nad ASO toczą się także w kontekście sposobów ich dostarczania do komórek. Przykładem nowego podejścia jest zastosowanie przeciwciała jako systemu wprowadzającego.⁷⁰ ASO modyfikowane resztami tiofosforanowymi były nakierowane na konserwatywne rejony 5’ i 3’ UTR mRNA PA. Wykazały wysoką aktywność przeciwwirusową w doświadczeniach na linii komórkowej MDCK oraz na myszach infekowanych wirusem A/Tiger/Harbin/01/2002 (H5N1). W literaturze istnieją również doniesienia o zastosowaniu wektorów lentiwirusowych jako nośników sekwencji ASO

30 do linii komórkowych.⁷¹ Celem ich działania był rejon 5’UTR vRNA1, vRNA2 oraz vRNA3 wirusa szczepu A/PR/8/34 (H1N1). Inhibicja zapewniona przez konstytutywną ekspresję ASO w komórce była ponad 10-krotna. Rolę nośników mogą także pełnić nanocząstki. Przykładem są oligomery DNA przyłączone do dwutlenku tytanu mającego zdolności do penetracji komórki.⁷² Miejscem ich docelowego działania był konserwatywny rejon niekodujący 3’ RNA segmentu 5. Doświadczenia na komórkach MDCK wykazały kilkukrotną inhibicję namnażania szczepów A/Aichi/2/68 (H3N2), A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) oraz A/Salekhard/01/2009 (H1N1).

ASO są przedmiotem licznych prowadzonych aktualnie prób klinicznych mających w perspektywie zastosowanie nowych terapii u ludzi. W 2018 roku upubliczniono wyniki pierwszej fazy badań bezpieczeństwa i właściwości farmakokinetycznych oligomeru morfolinowego, zawierającego reszty piperazyny w określonych pozycjach łańcucha.⁷³ Jest on nakierowany na inhibicję translacji M1/M2 poprzez wiązanie do konserwatywnych sekwencji mRNA. Pozytywne rezultaty prób, w których ASO podawano pacjentom wskazują, że będą prowadzone dalsze badania zmierzające do jego zarejestrowania jako leku przeciwko wirusowi grypy typu A.