PNA formujące trypleksy

Peptydowy kwas nukleinowy (PNA) jest sztucznym analogiem kwasu nukleinowego z nukleozasadami związanymi ze szkieletem neutralnego pseudopeptydu poprzez wiązanie metylenokarbonylowe.⁷⁴ Pierwsze doniesienie literaturowe dotyczące PNA pojawiło się w roku 1991. W kolejnych latach oligomery PNA znalazły szerokie zastosowanie w biologii molekularnej oraz jako potencjalne cząsteczki o działaniu terapeutycznym.^75-82 PNA są chemicznie trwałe i wykazują wyjątkową odporność na nukleazy i proteazy. Jest to cecha szczególnie korzystna w kontekście aktywności cząsteczki w warunkach in vitro i in vivo. PNA są zdolne do tworzenia dupleksów poprzez klasyczne parowanie zasad typu Watsona-Cricka, z komplementarnymi nićmi w orientacji równoległej lub antyrównoległej. Ze względu na fakt, iż szkielet PNA jest pozbawiony ładunku, nie występuje zjawisko elektrostatycznego odpychania nici charakterystyczne dla fosfocukrowego szkieletu DNA oraz RNA. Powinowactwo, specyficzność i stabilność termodynamiczna wiązania oligomerów PNA są znacznie zwiększone w porównaniu do naturalnych DNA lub RNA.74, 76, 83-85 Wystąpienie nawet pojedynczego niesparowania w sposób znaczący obniża temperaturę topnienia i trwałość dupleksu. Niemodyfikowane PNA mogą tworzyć także oddziaływania typu Hoogsteen,

31 które prowadzą do powstania potrójnej helisy. Nie wykazują szczególnej selektywności wiązania względem jednoniciowych lub dwuniciowych kwasów nukleinowych. PNA może wiązać się do rejonu docelowego na różne sposoby, przyłączając się do istniejących struktur lub powodując ich naruszenie (Rycina 6). W drugim przypadku, homopirymidynowe oligomery mogą tworzyć trypleksy rozplatając dwuniciowe rejony DNA lub RNA i formować struktury PNA•DNA-PNA lub PNA•RNA-PNA. Dwie nici PNA tworzą wtedy pary Watsona-Cricka i Hoogsteena odpowiednio z nicią DNA lub RNA. Druga z nici DNA lub RNA pozostaje natomiast niesparowana i występuje w postaci tzw. pętli p (z ang. P-loop) (Rycina 6).74, 79, 86-89

Rycina 6. Możliwe oddziaływania tworzone pomiędzy PNA a innymi kwasami nukleinowymi. PNA oznaczone są pogrubioną linią.

Pierwsze zastosowania PNA jako metody inhibicji opierały się na jego działaniu antysensowym oraz zmianie struktury kwasów nukleinowych skutkujących zahamowaniem transkrypcji i translacji w komórkach eukariotycznych.^90-94 Początkowo, zasadniczym czynnikiem limitującym były ograniczone zdolności wnikania PNA do żywych komórek. Konieczność poprawienia właściwości PNA doprowadziła do zaprojektowania szeregu skutecznych strategii. Pośród nich wymienić można połączenie PNA z oligomerami DNA, ligandami receptorów, liposomami oraz peptydami penetrującymi błony komórkowe. Podejścia te zostały z powodzeniem zastosowane w kilku przeprowadzonych badaniach.93, 95, 96 Na szczególną uwagę zasługuje opisane w literaturze pojawienie się nowych, korzystnych cech dzięki zastosowaniu koniugatów PNA-neamina.⁹⁷ Zapewniają one zwiększoną rozpuszczalność PNA, przenikanie do komórek, stabilizację potrójnych helis oraz potencjał przecinania RNA w rejonie

32 docelowego wiązania. Ostatnia z wymienionych cech wynika z wykazywanej przez diaminy i poliaminy zdolności do katalizowania hydrolizy RNA. Przecięcie przez neaminę w pobliżu miejsca hybrydyzacji obserwowane było w zakresie pH 7,0- 8,0 oraz w obecności jonów dwuwartościowych o fizjologicznym stężeniu. Mechanizm tej reakcji nie został w pełni wyjaśniony. Nieznany jest także wpływ struktury drugorzędowej RNA na działanie neaminy. Strategia z zastosowaniem koniugatów została jednak wykorzystana w badaniach przeciwko wirusowi HIV i doprowadziła do zahamowania jego namnażania w komórkach.⁹⁸

Niemodyfikowany PNA zawierający zasady C i T może wiązać się z dużą bruzdą dupleksu RNA i tworzyć trypleks PNA-RNA-RNA jedynie w stosunkowo niskim pH wynoszącym 5,5. Struktura jest wtedy stabilizowana przez trójki nukleotydów C⁺•G-C i T•A-U (Rycina 7).⁸⁸ Odnotowano, że krótkie oligomery preferencyjnie wiążą się do dwuniciowych RNA, prawdopodobnie przyczyną jest niepełna kompatybilność strukturalna wiązania do większej bruzdy DNA. W celu zwiększenia powinowactwa i selektywności wiązania PNA do dwuniciowych RNA w warunkach zbliżonych do fizjologicznych opracowane zostały zmodyfikowane zasady.^99-101 Wykazano, że PNA zawierające tiopseudoizocytozynę (L) i 5-metylocytozynę zmodyfikowaną guanidyną (Q) mogą preferencyjnie wiązać dwuniciowe RNA, w stosunku do jednoniciowych RNA i dwuniciowych DNA, w sposób zależny od sekwencji (Rycina 7).100, 102-106 Pierwsza z modyfikowanych zasad została zaczerpnięta z badań prowadzonych nad tworzeniem trypleksów DNA2-DNA. Przewiduje się, że na podobnych zasadach oparte jest działanie monomerów wprowadzonych do sekwencji PNA. Podobna stabilność dupleksów RNA-RNA oraz RNA-RNA-PNA jest przyczyną indukowanej przez PNA inwazji dupleksu RNA-RNA.

Tiopseudoizocytozyna wykazuje steryczne odpychanie guanozyny w parze typu Watson-Crick, dlatego destabilizuje ewentualne wiązanie RNA-PNA. Natomiast, w przypadku par typu Hoogsteen wzmaga oddziaływania van der Waalsa skutkując stabilizacją trypleksu RNA2-PNA i minimalizacją wpływu pH oraz jonów na to wiązanie. Druga z modyfikacji, 5-metylocytozyna zmodyfikowana guanidyną, z wysoką specyficznością tworzy wiązanie Q•C-G. Jednocześnie, faworyzuje formowanie trypleksu poprzez steryczną destabilizację tworzenia ewentualnej pary typu Watson-Crick. Modyfikacja wspomaga także zdolność PNA do penetracji błony komórkowej.

33 Rycina 7. Struktury chemiczne trójek nukleotydowych będących podstawą trypleksów tworzonych pomiędzy PNA i RNA.

Zdolność do tworzenia trypleksów z dwuniciowymi RNA wydaje się wyjątkowo interesującą cechą oligomerów PNA. Struktury helikalne są zwykle rejonami, których dostępność dla strategii inhibicji jest bardzo ograniczona. Jednocześnie motywom, w których występuje parowanie nukleotydów, takich jak chociażby spinki do włosów, często przypisuje się istotne funkcje biologiczne. Wiele par nukleotydowych wykazuje wysoką zachowawczość, wspierając hipotezę roli w ważnych procesach wewnątrzkomórkowych. Przyłączenie PNA może prowadzić do stabilizacji dupleksów RNA, zakłócenia oddziaływań trzeciorzędowych oraz interakcji z białkami. Kierunek rozwijania tego typu podejść, nastawionych na celowanie w helikalne rejony RNA, stanowi wciąż obszar badawczo niewyeksploatowany. Istnieją duże szanse, że nowe odkrycia w tej dziedzinie przyniosą przełomowe koncepcje i pomysły, które zaowocują w zastosowaniach terapeutycznych. Pierwsze badania z zastosowaniem PNA

34 formujących trypleksy nakierowanych na hamowanie namnażania wirusa grypy są przedmiotem niniejszej pracy.