pRimERS flANKiNg ThE CYp21 gENE Of mAmmAlS
1Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Department of Genetics and Animal Breeding, Wrocław University of Environmental and Life Sciences
W niniejszej pracy dokonano próby amplifikacji i sekwencjonowania genu CYP21 kilku gatun-ków ptagatun-ków. Użyto zdegenerowanych primerów zaprojektowanych na bazie znanych sekwencji ssaków. W badaniu wstępnym, w teście PCr, użyto DNA ssaków. Wynik próby był pozytywny. Dalsze badania skupiły się na DNA ptaków. Przeprowadzono test PCr. Wybrane produkty zostały oczyszczone i zsekwecjonowane. Uzyskane sekwencje produktów pochodzących od bażanta (Pha-sianus colchicus), perlicy (Numida meleagris), indyka (Meleagris gallopavo), gołębia (Columba livia) i kury (Gallus gallus) nie wykazywały oczekiwanej homologii ze znanymi sekwencjami genu CYP21.
SŁOWA KLUCZOWE: gen 21-hydroksylazy steroidowej, zdegenerowane primery, PCr, sekwen-cjonowanie
WSTĘP
Aby badać i porównywać strukturę genów pomiędzy organizmami, konieczne jest znalezienie sekwencji zwanych ortologicznymi. Ortologami nazywamy geny homo-Do cytowania – For citation: Grabowski K., Strzała t., Kosowska B., 2011. Próba amplifikacji sekwencji 21-hydroksylazy steroidowej kilku gatunków ptaków z użyciem zdegenerowanych primerów flankujących gen CYP21 ssaków. Zesz. Nauk. UP Wroc., Biol., Hod. Zwierz., LXIII, 583: 45–57.
logiczne u różnych gatunków, kodujące produkt o tej samej funkcji. Przykładem takiej sekwencji jest gen CYP21, kodujący cząsteczkę enzymu 21-hydroksylazy steroidowej. Białko to pełni istotną rolę w biosyntezie hormonów steroidowych kory nadnerczy. Produkty reakcji katalizowanych przez ten enzym uczestniczą w regulowaniu gospodar-ki wodno-elektrolitowej organizmu, kształtowaniu się cech płciowych oraz odgrywają istotną rolę podczas przebiegu reakcji na stres.
Najczęstsze zakłócenia steroidogenezy wynikają z niedoboru enzymu 21 hydroksy-lazy steroidowej (New 2004). Mutacje w locus genu CYP21 prowadzą do występowania u człowieka zespołu objawów zwanego wrodzonym rozrostem nadnerczy (ang. congeni-tal adrenal hyperplasia – CAH) (Speiser i wsp. 1985). Za sprawą badań nad patogenezą steroidogenezy sekwencję genu CYP21 człowieka poznano już w 1986 r. (Higashi i wsp. 1986). Gen kodujący 21-hydroksylazę steroidową człowieka znajduje się na chromoso-mie szóstym, w obrębie genów klasy III haplotypu MHC (głównego układu zgodności tkankowej) (Higashi i wsp. 1986, White i wsp. 1986). W odległości 30 kb w kierunku 5’ znajduje się zduplikowana sekwencja genu CYP21, która w komórkach człowieka została unieczynniona przez mutację i egzystuje w formie pseudogenu. Funkcjonalny gen CYP21B oraz pseudogen CYP21A wykazują 98% homologii (White i wsp. 1986). Są rozdzielone sekwencją genu układu dopełniacza – C4B (Law i wsp. 1984). U wszyst-kich opisanych pod tym względem gatunków gen ten składa się z dziesięciu eksonów oddzielonych od siebie intronami. Podobną budowę wykazuje ludzki pseudogen. Wyka-zano również, że w populacji ludzkiej obserwuje się występowanie trzech różnych alleli CYP21 różniących się długością. Badania dowiodły występowania ponad stu mutacji w aktywnej formie genu. tylko około 1% powstaje de novo (Krone i wsp. 2000). Więk-szość jest skutkiem rekombinacji między genem prawidłowym a pseudogenem. Obser-wuje się również powstawanie chimer dwóch form genu na drodze nieuprawnionego crossing-over podczas mejozy (Lee 2004).
Stosunkowo słabo poznana jest sekwencja genu CYP21 u innych naczelnych. Wy-kazano dotychczas, że budowa omawianego fragmentu MHC klasy III orangutana oraz pawiana jest analogiczna do ludzkiej. U orangutana w obrębie pseudogenu obserwuje się mutacje niewystępujące u człowieka (Kawaguchi, Klein 1992). Szympans ma trzy kopie genu 21-hydroksylazy steroidowej. Jak dotąd nie potwierdzono, która z nich koduje funk-cjonalne białko (Kawaguchi i wsp. 1990)
U myszy występują dwie kopie genu CYP21. Jedna z nich jest pseudogenem. Stwier-dzono, że wrodzony przerost nadnerczy u myszy może być spowodowany powstawaniem chimery obu form genu, tak jak u człowieka (riepe i wsp. 2005). Gen CYP21 szczura również jest zduplikowany. Inaczej niż u myszy i człowieka pseudogen zlokalizowany jest poza MHC klasy trzeciej. (Hurt i wsp. 2003).
Pies ma jedną, funkcjonalną kopię genu 21-hydroksylazy steroidowej (takada i wsp. 2002). Sekwencja tego genu u wilka wykazuje prawie całkowitą homologię w stosunku do występującej u psa. różnią się one dwoma podstawieniami nukleotydowymi niemają-cymi wpływu na skład aminokwasowy białka (Brzezińska 2006).
W populacji kota domowego dowiedziono występowania trzech alleli genu CYP21. Sekwencje genu 21-hydrosylazy steroidowej stosunkowo blisko ze sobą spokrewnionych gatunków, kota domowego i rysia, wykazują duże podobieństwa. różnice dotyczą głów-nie regionów głów-niekodujących (Brzezińska 2006).
W genomie bydła występują dwie kopie genu 21-hydroksylazy, lecz jednoznacznie nie ustalono, czy obie są funkcjonalne. Istnienie dwóch, różniących się długością trans-kryptów tego genu, może świadczyć o dodatkowym splicingu, któremu mogą ulegać czą-steczki pre-mrNA. W populacji tego gatunku stwierdzono występowanie dwóch form allelicznych genu (Chung i wsp. 1995).
W genomie świni domowej występuje jedna kopia genu CYP21. W populacji tego gatunku obserwuje się aż sześć alleli genu 21-hydroksylazy steroidowej. różnią się one od siebie sekwencjami intronów oraz pojedynczymi podstawieniami nukleotydowymi w eksonach (Burghelle-Mayeur i wsp. 1992).
W genomie owcy występują dwie kopie genu CYP21. Najprawdopodobniej jedna z nich jest pseudogenem, analogicznie jak u ludzi i myszy (Qin i wsp. 2008).
Pierwsze badania nad genem CYP21 wśród kręgowców znajdujących się na niższych szczeblach drabiny ewolucyjnej w porównaniu ze ssakami, dotyczą węgorza japońskie-go. Dowiedziono występowania trzech kodonów start w obrębie genu 21-hydroksylazy w komórkach węgorza, ale tylko jedna z możliwych sekwencji koduje białko aktywne enzymatycznie. Wykazano również ponad 40% homologię tego genu między badanymi ssakami oraz rybami (Li i wsp. 2003).
Jedynym gatunkiem ptaka o znanej sekwencji genu CYP21 jest obecnie kura domowa (Gallus gallus). Gen występuje w jednej kopii w obrębie haplotypu MHC. Stwierdzo-no 58% homologii sekwencji pomiędzy genem CYP21 człowieka i kury (Shiina i wsp. 2007).
Gen 21-hydroksylazy steroidowej wykazuje dużą homologię u wszystkich dotych-czas przebadanych gatunków kręgowców. Ekson 10 tego genu jest najbardziej polimor-ficzny, a eksony 1, 2, 9 są najbardziej zakonserwowane ewolucyjnie (Burghelle-Mayeur i wsp. 1992). Dalsze badania porównywały sekwencje zarówno intronowe, jak i ekso-nowe, a także sekwencje aminokwasów w białku. Stwierdzono, że dystans ewolucyjny pomiędzy ssakami i węgorzem koreluje z różnicami, jakie wykształciły się w tym czasie w genie CYP21. Mimo to nadal istnieją w jego sekwencji fragmenty wykazujące 40% ho-mologię. Fragmenty homologiczne, silnie ewolucyjnie zakonserwowane, kodują domeny aminokwasowe kluczowe do funkcjonowania białka.
Dokonując analizy homologii tego genu w świecie zwierząt, należy stwierdzić także duże różnice w sekwencji nukleotydowej, czyli znaczący brak homologii. Sytuację taką opisano po porównaniu sekwencji CYP21 między przedstawicielami gryzoni i drapież-ników. Analiza samych intronów wskazuje na odrębne ewoluowanie tych sekwencji na przestrzeni dziejów (Brzezińska 2006).
Celem niniejszej pracy jest poszukiwanie metod pozwalających na poznanie sekwen-cji nukleotydowej genu CYP21 ptaków. Do jego realizasekwen-cji zaprojektowano zdegenerowa-ne startery na podstawie znanych, pełnych sekwencji genu 21-hydroksylazy steroidowej ssaków. Sprawdzono w ten sposób, czy stopień homologii sekwencji genu CYP21 u róż-nych gatunków pozwoli na amplifikację tego fragmentu genomu z użyciem tych samych primerów dla przedstawicieli różnych gromad. Przebadano również użyteczność takich starterów w poznawaniu pełnych sekwencji genu 21-hydroksylazy steroidowej ptaków. Poznanie sekwencji tego genu u przedstawicieli kilku gromad pomoże nie tylko w osza-cowaniu dystansu ewolucyjnego, ale także odpowie na wiele pytań z zakresu badań pod-stawowych. Umożliwi bowiem poznanie kluczowych obszarów genu oraz dróg i sposo-bów powstawania nowych sekwencji eksonów kodujących domeny, które dzięki różnym
rearanżacjom otrzymywały na przestrzeni dziejów możliwość wielokrotnej zmiany swej budowy. Z kolei, biorąc pod uwagę zmienną w czasie presję środowiska, zmiany w bu-dowie struktur biochemicznych (szczególnie w obrębie domen drugo- i naddrugorzędo-wych), mogły być wielokrotnie testowane i weryfikowane na drodze doboru naturalnego na każdym etapie ewolucji. W efekcie, opis różnych sekwencji bardzo istotnego z punktu widzenia funkcjonowania organizmu genu 21-hydroksylazy steroidowej daje możliwości badania dróg powstawania alternatywnych szlaków organizacji genu, z których każdy szlak na danym etapie rozwoju był lub jest optymalnym z punktu widzenia adaptacji gatunku w określonym czasie i przestrzeni. Ze względu na bliskie pokrewieństwo gro-mady ptaków i gadów uzyskanie informacji o genie CYP21 ptaków pomogłoby pomóc w poznaniu sekwencji genu 21-hydroksylazy steroidowej gadów. Badania takie mogłyby być oparte na sekwencjach starterów zaprojektowanych na podstawie nowo poznanych sekwencji genu CYP21 ptaków. Hipotezę tę popiera fakt, że niektórzy naukowcy zalicza-ją ptaki i gady do jednej gromady (Livezey i wsp. 2007).
MATERIAŁ I METODY
Badaniem objęto dwanaście gatunków ptaków: bażanta łownego (Phasianus colchicus), perlicę zwyczajną (Numida meleagris), indyka (Meleagris gallopavo), gołębia (Colum-ba livia), kurę domową (Gallus gallus domesticus), (Colum-bastarda kury domowej z (Colum-bażantem łownym, kaczkę – biegusa indyjskiego (Anas platyrhynchos), gęś domową (Anser anser f. domestica), gęś gęgawę (Anser anser), gęś garbonosą (Anser cygnoides) oraz mieszańce bernikli kanadyjskiej (Branta canadensis) z gęsią domową. Materiał do badań stanowiły próbki krwi obwodowej pozyskane od ptaków będących własnością Instytutu Hodowli Zwierząt Wydziału Biologii i Hodowli Zwierząt Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu.
Sekwencja genu CYP21 kury domowej została już poznana, ale z racji dużego, we-wnętrznego zróżnicowania gatunku, zdecydowano o włączeniu jej w obszar badań. Se-kwencje badanego genu pozostałych gatunków nie zostały dotąd poznane.
W celu wyizolowania całkowitego DNA z krwi ptaków użyto gotowego zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych firmy A&A Biotechnology. Do czasu podjęcia dalszych analiz roztwory kwasów nukleinowych były przechowywane w temperaturze 4°C.
Następnym etapem badań było zaprojektowanie primerów koniecznych do przepro-wadzenia PCr. Z uwagi na znaczą długość sekwencji genu (ponad 2500 nk) i stosun-kowo wysoką zawartość par GC w obszarze genu – zdecydowano się na powielenie go w trzech zachodzących na siebie fragmentach. Zamiar uzyskania sekwencji genu u przed-stawicieli kilkunastu różnych gatunków spowodował potrzebę użycia primerów zdege-nerowanych, będących jednym z powszechnie stosowanych narzędzi filogenetyki mole-kularnej (Kwok i wsp. 1994). Pierwotna sekwencja starterów została zaprojektowana na podstawie sekwencji genu wilka (Kosowska i wsp. 2005: GeneBank nr DQ336566.1.). Dalsza modyfikacja polegała na uwzględnieniu podstawień występujących u osobników kilku innych gatunków zwierząt oraz u człowieka. Ostateczne sekwencje primerów wraz z przewidywanymi długościami produktów przedstawiono w tabeli 1.
tabela 1 table 1 Sekwencje primerów Primer sequences Para: Pair: Kierunek: Primer direction: Sekwencja: Sequence: Długość primera: Primer length: Przewidywana długość produktu: Expected product size: 1 F 5’-GAGCtAtAAGtGGCI*S*-3’ 16bp 1238bp r 5’-CtGCW*tCtCY*ACS*AK*GtG-3’ 18bp 2 F 5’-CAtCAtCtGtY*r*CCtC-3` 16bp 939bp r 5’-CtGAAtCtGGGr*AAtG-3’ 16bp 3 F 5`-CAttY*CCCAGAttCAG-3’ 16bp 836bp r 5’-CAGCACY*r*tGtttACA-3’ 16bp *F = forward, r = reverse, S = G+C, W = A+t, r = A+G, Y = C+t, K = G+t; I = deoksyinozyna – deoxyinosine
Pierwotnie, do amplifikacji genu 21-hydroksylazy steroidowej ssaków zakładano użycie skonstruowanych i zamówionych u producenta primerów. W celu ustalenia opty-malnych warunków dla reakcji PCr przeprowadzono około 250 reakcji, używając jako matrycy – DNA wyizolowanego z komórek człowieka oraz zająca. Dla każdej pary pri-merów temperaturę annealingu wyznaczano doświadczalnie w termocyklerze gradiento-wym. Eksperymentowano także z różnymi stężeniami matrycy, chlorku magnezu i starte-rów w celu ustalenia najlepszych proporcji.
Użycie zdegenerowanych primerów wiąże się najczęściej z uzyskiwaniem niespecy-ficznych produktów. Optymalizacja warunków reakcji PCr umożliwiła uzyskanie możli-wie największego stężenia produktu o oczekiwanej długości, przewyższającego stężenie innych produktów co najmniej dwukrotnie. Obserwacja ta została poczyniona na podsta-wie o intensywności śpodsta-wiecenia prążków po zakończeniu rozdziału elektroforetycznego produktów na żelu agarozowym.
Wyniki uzyskane w badaniu wstępnym dotyczącym amplifikacji sekwencji CYP21 ssaków zachęcały do przetestowania uzyskanej metody na matrycy z krwi ptaków. Mimo ustalenia ponownych gradientów temperatury oraz odczynników stężenie produktów o oczekiwanej długości nie przewyższało znacząco stężenia innych uzyskanych fragmen-tów. W celu uzyskania większego stężenia produktu do sekwencjonowania zdecydowano się na powielenie wybranego fragmentu poprzez re-PCr. Poszukiwany produkt uzyska-no za pomocą elektroforezy preparatywnej na żelu agarozowym i użyto jako matrycy w kolejnej reakcji. Mimo przeprowadzenia około 300 powtórzeń nie udało się w poje-dynczej próbie uzyskać jednego produktu PCr. W efekcie niepowodzenia reamplifikacji zdecydowano się na dalsze używanie izolatów z krwi jako matrycy.
Ostatecznie reakcje przeprowadzano w objętości 25 μl w termocyklerze gradiento-wym firmy Eppendorf. Użyto tych samych stężeń odczynników w przypadku wszystkich trzech fragmentów. Opracowany doświadczalnie skład mieszaniny reakcyjnej przedsta-wia tabela 2.
Warunki termiczne reakcji wyznaczono doświadczalnie. trzy fragmenty, w któ-rych powielano gen, różniły się określonymi parametrami: temperaturą annealingu oraz
czasem elongacji. Ustalone temperatury oraz czasy poszczególnych etapów reakcji ze-brano w tabeli 3.
tabela 2 table 2 Skład mieszaniny reakcyjnej PCr
Composition of PCr mixture Składnik
Component: Contentration:Stężenie: Stosowana objętość:Used volume:
DNA template ok. 30 ng/ μl 1 μl
PCr buffer 10x 2,5 μl
MgCl2 25 M/dm3 2 μl
Primer F 50 pM/ μl 0,5 μl
Primer r 50 pM/ μl 0,5 μl
dNtP’s 10 M/dm3 0,5 μl
taq polymerase 5 U/μl 0,2 μl
H20 100% up to 25 μl tabela 3 table 3 Warunki termiczne PCr PCr thermal conditions Czas trwania
Duration temperaturatemperature Ilość cykliNumber of cycles Fragment
Fragment 1 2 3 1 2 3
Wstępna denaturacja
Initial denaturation 5 min 95°C 1x
Denaturacja Denaturation 30 s 95°C 30x Dołączanie starterów Annealing 30 s 51°C 57 °C 54°C Elongacja Elongation 45 s 30 s 30 s 72°C Końcowa synteza
Final elongation 5 min 72°C 1x
W celu jakościowej i ilościowej oceny produktu reakcji niewielką część uzyskanego roztworu poddawano elektroforezie w dwuprocentowym żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Długość otrzymanych produktów oraz ich stężenie oceniano w świetle Uv, na podstawie markera wielkości. Wyniki zapisywano i przechowywano w formie elektronicznej dzięki systemowi archiwizacji żeli.
Z uwagi na dużą ilość niespecyficznych produktów reakcji widocznych w świetle Uv na żelu – zadecydowano o preparatywnym rozdziale całej mieszaniny. Elektroforezę
prowadzono na 2% żelu agarozowym przez około dwie godziny. Prążki utworzone przez produkty o odpowiedniej długości wycinano i przechowywano w zamkniętych probów-kach w temperaturze -20°C, aż do podjęcia procedury izolacji.
Do izolacji DNA z żelu zastosowano gotowy zestaw do oczyszczania kwasów nu-kleinowych. Wycięty prążek rozpuszczano w buforze zawierającym sole chaotropowe. Uzyskany roztwór mieszano z izopropanolem i przepuszczano przez kolumnę ze złożem krzemionkowym. Dwukrotnie płukano ją buforem zawierającym etanol. Następnie elu-owano zawartość złoża dejonizowaną wodą destylowaną. Uzyskane izolaty przechowy-wano w temperaturze 4°C.
Uzyskane fragmenty DNA wysyłano do sekwencjonowania metodą terminacji łań-cucha w Serwisie Sekwencjonowania i Syntezy DNA Instytutu Biochemii i Biofizyki Państwowej Akademii Nauk w Warszawie.
Ostateczną analizę porównawczą uzyskanych sekwencji przeprowadzono za pomocą programu BLASt (ang. Basic Local Alignment Search tool), (Altschul i wsp. 1994).
WYNiKi
Do sekwencjonowania wysłano łącznie 17 produktów reakcji PCr, w dwóch powtó-rzeniach. W wypadku sekwencjonowania z użyciem pierwszej i drugiej pary primerów nie uzyskano czytelnych chromatogramów, a otrzymane sekwencje były bardzo krótkie. Jedynie sekwencje uzyskane przy użyciu trzeciej pary starterów nadawały się do anali-zy porównawczej. Wykaz długości sekwencji, uanali-zyskanych w wyniku sekwencjonowania z trzema parami starterów, zebrano w tabelach 4, 5 oraz 6.
tabela 4 table 4 Wykaz uzyskanych sekwencji oraz gatunków, od których pochodziły. Sekwencjonowanie
z użyciem pierwszej pary starterów
List of sequences and species from which they were obtained. Sequencing with the first pair of primers Fragment
Fragment StarterPrimer Number of bp.Ilość pz. GatunekSpecies
1 1r1F 3700 Bażant (F)Pheasant
2 1r1F 2040 Bażant (M)Pheasant
3 1r1F 1540 Guinea fowlPerlica (F) 4 1r1F 1470 Guinea fowlPerlica (M)
5 1r1F 00 Indyk (M)turkey
6 1r1F 00 Gołąb (F)Pigeon
tabela 5 table 5 Wykaz uzyskanych sekwencji oraz gatunków, od których pochodziły. Sekwencjonowanie
z użyciem drugiej pary starterów
List of sequences and species from which they were obtained. Sequencing with the second pair of primers
Fragment
Fragment StarterPrimer Number of bpIlość pz. GatunekSpecies
8 2F 0 Bażant (F)Pheasant 2r 132 9 2r2F 1420 Indyk (M)turkey 10 2r2F 1730 Gołąb (F)Pigeon 11 2F 248 Gołąb (M)Pigeon 2r 145 12 2F 129 Kura (F)Chicken 2r 0 tabela 6 table 6 Wykaz uzyskanych sekwencji oraz gatunków, od których pochodziły. Sekwencjonowanie
z użyciem trzeciej pary starterów
List of sequences and species from which they were obtained. Sequencing with the third pair of primers
Fragment
Fragment StarterPrimer Number of bp.Liczba pz. GatunekSpecies
13 3F 367 Bażant (M)Pheasant
3r 396
14 3F 675 Bażant (F)Pheasant
3r 403
15 3r3F 320357 Guinea fowlPerlica (M)
16 3F 0 Gołąb (F)Pigeon
3r 241
17 3F 193 Gołąb (M)Pigeon
3r 327
Uzyskane sekwencje wykazywały znaczące podobieństwo do przypadkowych, nie-kodujących fragmentów genomu kury oraz zeberki, a także w dwóch przypadkach do sekwencji kodujących, nie związanych z 21-hydroksylaza steroidową.
Na rysunku 1 przedstawiono porównanie sekwencji perlicy (badania własne) i se-kwencji kury uzyskanej z GenBanku.
Na rysunku 2 przedstawiono porównanie sekwencji perlicy (badania własne) i se-kwencji zeberki uzyskanej z GenBanku.
1 GGGCAGCCGAAATCTTGCTGCTTGCAGGGGAGAGCTGTAAAAGCAGGCACTTTGCTCTTG 60 Perlica (M) |||||||||||||| ||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| 5297831 GGGCAGCCGAAATCCTGCTGCTTGCAGGGGCGAGCTGTAAAAGCAGGCACTTTGCTCTTG 5297772 Kura 61 TAATTGTTGATAAAGACTTGCAGCTTCTTGCTCCTTGGTCAGAAAAGCAGTGACCGTGTG 120 Perlica (M) |||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| |||||||||||| 5297771 TAATTGCTGATAAAGACTTGCAGCTTCTTGCTCGTTGGTCAGAAA-GCAGTGACCGTGCA 5297713 Kura 121 TGGCCTGAGCCTCCGTGCTGCTGTGCTTGGCAGCATTCTGCATTGCAGGGAAGGTGAACT 180 Perlica (M) ||||||||||||| ||||||||||||| || ||| | |||| ||| | | |||| || 5297712 TGGCCTGAGCCTCTGTGCTGCTGTGCTCTGCTGCACTTTGCACGGCACGCA-GGTGGGCT 5297654 Kura 181 CGCATGCACACCCC-TCCAAAAATGTCCTATTTACAGTGTCAGCTCCAAGAGGATGAGAA 239 Perlica (M) |||||||||||| ||||||||||||||||||| | ||||||||||||||||||| | 5297653 GCCATGCACACCCCCTCCAAAAATGTCCTATTTATGGCATCAGCTCCAAGAGGATGAGGA 5297594 Kura 240 AGTGCCAAGGGCTGCTTGAATCATTTCCATTACGCCTCGCTGGATTTTCTCTTGTTGCTC 299 Perlica (M) |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| 5297593 GGTGCCAAGGGCTGCTTGAATCATTTCCATTACGCCTCGCTGGATCTTCTCTTGTTGCTC 5297534 Kura 300 AGGGGCTGCTGCTGTT-TCACAAACAATTTGTA--TCCACATCGCCCGTCCTCTC 351 Perlica (M) |||||||||||||||| ||||||||| |||||| ||||||||||||| || ||| 5297533 AGGGGCTGCTGCTGTTCTCACAAACAGTTTGTATTTCCACATCGCCCGGCCCCTC 5297479 Kura
rys. 1. Przyrównanie sekwencji (alignment) – stopień zgodności 319/355 (89%). Kura = Gal-lus galGal-lus, fragment chromosomu 19, hipotetyczne białko (GeneBank nr. NC_006106.2; International Chicken Genome Sequencing Consortium, 2004). Perlica (M) = Numida meleagris (15-3r)
Fig. 1. Sequence alignment – compatibility 319/355 (89%). Kura = Gallus gallus, fragment of chicken’s chromosome 19, hypothetical protein (GeneBank number NC_006106.2; International Chicken Genome Sequencing Consortium, 2004) Perlica (M) = Numida meleagris (15-3r) 46 GGAGGAAGGATGGCTTTAAATGTTGCAGCCTGAACAAATCCCAGCAATGAGCTTGACATA 105 Perlica (M) |||| |||||||||||| |||||| |||||||||||||||||||| |||| || |||||| 6658979 GGAGAAAGGATGGCTTTGAATGTTCCAGCCTGAACAAATCCCAGCGATGATCTGGACATA 6658920 Zeberka 106 AATGATTACCGAGGCAGCCTTCCTCTCACCTAAGCTCTGCCACGCTTTAAATAGTAACTC 165 Perlica (M) |||||||||| || |||| ||| || ||||||| ||| || ||||||||||||||| 6658919 AATGATTACCCAGACAGCTTTCTCCTTACCTAAG--CTGTCATTCTTTAAATAGTAACTT 6658862 Zeberka 166 CAACTACTAATTGGGCAGCCGAAATCCCGCTGCTTG-CAGGGGAGAGCTGTAAAAGCAGG 224 Perlica (M) ||||||||||||||||| || |||| |||||||| |||||| ||||||||| ||| 6658861 GAACTACTAATTGGGCAGTAGAGATCCTGCTGCTTGTGTGGGGAGTGCTGTAAAAATAGG 6658802 Zeberka 225 CA-CTTTGCTCTTGTAATTGCTGATAAAGACTTGCAGCTTCTTGCTCCTTGGTCAGAAAA 283 Perlica (M) || | || || ||||||||||| ||||| |||| |||||| |||| | ||||| | 6658801 CAGCAATGTTCCTGTAATTGCTGGTAAAGCCTTGTAGCTTC-TGCTGGCTTGTCAGTGAG 6658743 Zeberka 284 GCAGTGACCGTGTGTGGCCTGAGCCTCCGTGCTGCT 319 Perlica (M) |||| | ||| ||| | |||||| |||||||| 6658742 GCAG---CAGTGAGTGAGCACAGCCTCTGTGCTGCT 6658710 Zeberka
rys. 2. Przyrównanie sekwencji (alignment) – stopień zgodności 221/276 (80%). Zeberka =
Ta-eniopygia guttata, fragment chromosomu 19, niekodujący (GeneBank nr. NC_011483.1;
Warren i wsp. 2010). Perlica (M) = Numida meleagris (15-3F)
Fig. 2. Sequence alignment – compatibility 221/276 (80%) . Zeberka = Taeniopygia guttata, noncoding fragment of 19 chromosome of zebra finch (GeneBank number NC_011483.1; Warren et al. 2010) Perlica (M) = Numida meleagris (15-3F)
OmóWiENiE
Znaczące podobieństwo sekwencji umożliwia ich amplifikację za pomocą metody PCr z wykorzystaniem tych samych par primerów na matrycach pochodzących z komórek osobników różnych gatunków. Istnienie punktowych polimorfizmów w obrębie tych se-kwencji powoduje konieczność projektowania primerów zawierających więcej niż jedno podstawienie w określonych, polimorficznych miejscach (Kwok i wsp. 1994). Do dziś prowadzi się wiele rozległych, filogenetycznych badań dzięki tej metodzie (tekle i wsp. 2010). Pewną innowację stanowi zastosowanie starterów zaprojektowanych na bazie se-kwencji genu 21-hydroksylazy ssaków w badaniach nad ptakami.
Mimo że rzadko ujawnia się problemy związane z prowadzeniem badań, niektórzy naukowcy donosili o kłopotach związanych z zastosowaniem zdegenerowanych prime-rów. Polegają one przede wszystkim na występowaniu niespecyficznych produktów re-akcji PCr. Są one wynikiem amplifikacji fragmentów matrycy na skutek łączenia się określonych par primerów z zastosowanej mieszaniny z nieznanymi fragmentami DNA. Wszelkie zanieczyszczenia próby w postaci obcych kwasów nukleinowych mogą również zastępować właściwą matrycę w przeprowadzanej reakcji (Chamberlain i wsp. 1994). Z racji specyfiki omawianej metody wybór oraz oczyszczenie pożądanego produktu mogą być bardzo trudne. Gen CYP21 jest w ogóle trudny do amplifikacji. Wysoka zawartość par GC może znacząco wpływać na strukturę drugorzędową sekwencji i utrudniać dena-turację (Brzezińska 2006). Donoszono również, że punktowe polimorfizmy w obrębie fragmentów, do których komplementarne są primery, uniemożliwiają zajście PCr (Loidi i wsp. 2006). W badaniach własnych zaobserwowano liczne produkty uboczne reakcji, nawet w pilotażowym badaniu z wykorzystaniem DNA ssaków. Problemy z hybrydyza-cją primerów skutkowały dużym nakładem pracy i długim okresem ustalania metody.
Dopiero niedawno powstały pierwsze prace na temat MHC ptaków. Pierwszym przebadanym pod tym kątem przedstawicielem tej gromady była kura (Gallus gallus). Charakteryzuje się ona uproszczonym i zakonserwowanym MHC wykazującym dużą homologię do tego obszaru badanego u ssaków. Locus badanego genu znajduje się na mikrochromosomie szesnastym. Ciekawi fakt, że sam gen 21-hydroksylazy steroido-wej kury wykazuje stosunkowo małe podobieństwo do sekwencji ssaków (Shiina i wsp. 2007). Analiza pewnych fragmentów MHC indyka (Meleagris gallopavo) ujawniła, że są one bardzo podobne do tych obserwowanych u kury. Nie zmienia się nie tylko układ ge-nów, ale także sekwencje nukleotydowe wykazują dużą homologię (Ahmed i wsp. 2007). Znaczące różnice pomiędzy sekwencją nukleotydową genu CYP21 ssaków i ptaków mo-gły być powodem braku oczekiwanych produktów reakcji PCr w badaniach własnych. Nie bez wpływu wydaje się być także polimorfizm samego MHC. Badania tej grupy genów u przepiórki ujawniły pewne różnice w budowie, polegające głównie na położeniu genów względem siebie oraz liczne duplikacje sekwencji kodujących. Umiejscowienie genu 21-hydroksylazy steroidowej w chromosomach tego gatunku pozostaje niejasne (Hosomichi i wsp. 2006). Znacznie większe różnice w budowie i umiejscowieniu wyka-zuje główny układ zgodności tkankowej zeberki (Taeniopygia guttata). Zaobserwowano liczne duplikacje, a także fragmentacje genów. Dowiedziono również, że geny dziedzi-czące się u kury w formie haplotypu są u omawianego gatunku rozrzucone na co najmniej dwóch mikrochromosomach (Balakrishnan i wsp. 2010). Obrazuje to, jak dalece poli-morficzne są haplotypy MHC. Dobrym argumentem na poparcie tej tezy są wyniki badań
genetycznych przeprowadzonych na walabii dama (Macropus eugenii). Dowiedziono, że geny MHC tego gatunku są rozrzucone na siedmiu chromosomach (Siddle i wsp. 2009). Ewentualne duplikacje lub fragmentacje genu CYP21 w DNA ptaków mogły być przy-czyną braku pożądanych sekwencji w wynikach badań własnych. Uzyskane fragmenty są najprawdopodobniej wynikiem niespecyficznego łączenia się primerów z matrycą. Ewen-tualny związek omawianych sekwencji z genem 21-hydroksylazy pozostaje niejasny.
WNiOSKi
1. Brak homologii pomiędzy uzyskanymi sekwencjami a CYP-21 ptaków oraz ssa-ków wskazuje na zbyt duże zdegenerowanie primerów użytych w niniejszych analizach, co pociąga za sobą amplifikację przypadkowych fragmentów genomu.
2. Uzyskanie niehomologicznego względem ssaczego genu CYP21 fragmentu DNA ptaków wskazuje na brak homologii tych sekwencji DNA, przynajmniej w obrębie miejsc przyłączania starterów.