Automatyczny system do elektroforezy PhastSystem

4 System dokumentacji i analizy żeli – Imagistore 5000, z oprogramowaniem GelBase/GelBlot ProPc.

99 Odczynniki:

1 Płyn wzrostowy Eagle’a pH 7,4 z surowicą płodową (10%) i antybiotykami.

2 Bufor denaturujący: 0,05% cyjanoksylen, 0,05% błękit bromofenolowy, 10mM EDTA i 2% glicerol.

3 20% TCA (kwas trójchlorooctowy). 4 50% etanol i 10% kwas octowy lodowaty. 5 10% etanol i 5% kwas octowy.

6 8,3% glutaraldehyd. 7 0,5% azotan srebra. 8 2,5% węglan sodowy. 9 5% kwas octowy.

10 10% kwas octowy i 12,5% glicerol.

Namnażanie wirusów:

- Wirusy namnażać w hodowli komórek linii IB-RS-2.

- Po ok. 20 godz. od zakażenia, gdy efekt cytopatyczny (CPE) osiągnął ponad 80%, zebrać supernatant zawierający wirusa i odwirować przy 3000xg przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

- Określić miano infekcyjne wirusów w supernatancie. W zależności od szczepu powinno wynosić od 10^6,5 do 10^7,8 TCID50/ml.

Przygotowanie próbki do elektroforezy:

- Przy pomocy spektrometru RNA/DNA GeneQuant Calculator określić stężenie i czystość całkowitego RNA wyizolowanego z próbki materiału biologicznego.

- Rozcieńczyć RNA do stężenia ok. 0,5-1 µg/ml stosując wodą destylowaną zawierającą 50 jednostek inhibitora Rnazy.

- Próbkę RNA użyć w reakcji RT-PCR.

Przygotowanie systemu elektroforezy do pracy:

- Zaprogramowano parametry pracy systemu do elektroforezy: Sample App. Down: 1.2 0000 Vh

Sample App. Up: 1.3 0002 Vh Alarm at: 1.1 190 Vh

Sep. 1.1 400 V 10 mA 2.5 W 4°C 200 Vh Sep. 1.2 400 V 1 mA 2.5 W 4°C 002 Vh Sep. 1.3 400 V 10 mA 2.5 W 4°C 100 Vh - Wyczyścić 70% etanolem przedział do rozdziału elektroforetycznego.

- Umieścić dreny urządzenia do barwienia, odbarwiania i utrwalania żeli w naczyniach z odpowiednimi odczynnikami.

Przebieg doświadczenia:

- RNA izolować przy pomocy zestawu Rneasy kit (Qiagen), zgodnie z metodyką zalecaną przez producenta.

- Reakcję RT-PCR wykonać w jednej probówce zestawem Ready-To-Go You-Prime

First-Strand Beads. Do dostarczonego przez producenta odczynnika dodawać jako

matrycę RNA (ok. 1 µg), 1 µl (10 pM) startera 1B, uzupełnić H2O-DEPC do objętości 33 µl i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.

100

- Następnie do mieszaniny dodać po 1 µl (10 pM) każdego ze starterów, 1 µl (2 jednostki) Taq polimerazy, uzupełnić H2O-DEPC do objętości 100 µl i amplifikowano

w termocyklerze według parametrów:

- wstępna denaturacja - 3 min. 94°C; - denaturacja – 30 sec 94°C;

- wiązanie starterów – 45 sec 55°C;

- wydłużanie łańcucha (elongacja) – 1 min. 72°C;

- Trzy ostatnie etapy amplifikacji powtarzać przez 30 cykli.

- Po ostatnim cyklu wykonć dodatkową elongację przez 5 min. w temp. 72°C.

- Produkty RT-PCR rozdzielać elektroforetycznie w 12% żelu poliakrylamidowym (PAGE).

- Do 5 µl produktu RT-PCR dodać 1 µl buforu denaturującego;

- Przy pomocy aplikatora nanieść 1µl mieszaniny na żel umiejscowiony w komorze rozdziału PhastSystem'u.

- Elektroforezę prowadzić zgodnie z przedstawionymi powyżej warunkami. - Po zakończeniu rozdziału żele barwić standardową metoda srebrową, zgodnie z procedurą

zalecaną przez producenta (Nota No. 210).

Oczekiwane wyniki:

Produkty amplifikacji cDNA wirusa SVD przedstawia rysunek15.1. Zastosowanie pary starterów SVD1A i SVD1B pozwoliło powielić fragment materiału genetycznego badanych szczepów wirusa SVD o długości 620 bp kodujący białko kapsydowe VP1 i odcinek początkowy białka niestrukturalnego 2A.

Rys. 15.1

Analiza elektroforetyczna produktów RT-PCR wirusa choroby pęcherzykowej świń (SVD) z zastosowaniem

PhastSystem'u.

1 - kontrola ujemna – woda;

2 - produkty amplifikacji pary starterów VDV1A i SVDV1B - SVDPL/73; 3 - ITL/2/73

4 - NET/3/92;

101 Przykład 16.

E

E.

1,2Szalata M., ^1,2Kalak R., ^1,2Lipiński D., ²Pławski A., ^1,2Słomski R.

1Katedra Biochemii i Biotechnologii, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego, Wołyńska 35, 60-637 Poznań, e-mail: slomski@au.poznan.pl

2Zakład Genetyki Człowieka PAN, Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań

Wprowadzenie

Najlepszą metodą oceny homogenności preparatów białkowych jest elektroforeza w żelach poliakryloamidowych z SDS. Większość publikacji dotyczących oczyszczania rekombinowanych białek zamieszcza wynik rozdziału elektroforetycznego z uzyskaną czystą frakcją białka. Obecność dodatkowego intensywnego prążka o oczekiwanej wielkości wśród wszystkich białek bakteryjnych w układach nadekspresyjnych stanowi potwierdzenie udanej nadekspresji. Przeprowadzając elektroforezę można ocenić zarówno wielkość badanego białka, jak i określić jego czystość. Cząsteczki migrują w polu elektrycznym z różną szybkością zależną od wielkości cząsteczki oraz jej ładunku, wprost proporcjonalnie do natężenia pola elektrycznego, a odwrotnie proporcjonalnie do masy. Obecność dodecylosiarczanu sodu (SDS), który nadaje cząsteczkom ładunek ujemny, niszcząc jednocześnie strukturę IV rzędową białek, umożliwia precyzyjne określenie wielkości białek. W takich warunkach można wykryć, że badana cząsteczka ma budowę podjednostkową oraz z jakiej wielkości podjednostek składa się. Obecność tylko jednego prążka o oczekiwanej wielkości po barwieniu błękitem brylantowym Coomassiego potwierdza czystość uzyskanego preparatu, bardzo często sięga się w tym celu do bardziej czułej metody barwienia srebrem. Oczyszczanie białek uzyskanych z transformowanych komórek jest niezbędne dla ich pełnej charakterystyki i stosowane jest powszechnie w wielu laboratoriach. Rekombinowane białka otrzymywane w układach bakteryjnych lub eukariotycznych mogą być wydzielane na zewnątrz, co jest najbardziej pożądane. Mogą też wiązać się z błonami, tworzyć białka wewnątrzkomórkowe lub ciałka inkluzyjne. Bardzo często rekombinowane białka powstają w formie nieaktywnej. Nadekspresja białek w układach eukariotycznych zapewnia prawidłowe modyfikacje potranslacyjne. Oczyszczanie rekombinowanych białek jest ułatwione przez nadekspresję białka w zwiększonych ilościach, a także przez możliwość wprowadzenia znacznika ułatwiającego izolację białka. Tworzenie białek fuzyjnych w nadekspresji pozwala na lepsze oczyszczenie białka. Ponadto fragment fuzyjny zwiększa stabilność, przyspiesza izolację z kultur komórek pro- i eukariotycznych, często w procesie jednoetapowym, oraz pozwala wykorzystywać białko przez przemysł biotechnologiczny w masowej produkcji enzymów lub wysokooczyszczonych środków farmaceutycznych. Białka fuzyjne powstają poprzez dołączenie do sekwencji DNA kodującej określone białko sekwencji kodującej część fuzyjną. Najczęściej na końcu C białka wprowadza się poliargininę, polihistydynę, białko A czy transferazę glutationu (GST). Do oczyszczania wykorzystuje się chromatografię jonowymienną z ligandem poli(Arg), chromatografię immunopowinowactwa (ang. immunoaffinity), gdzie ligandem są przeciwciała IgG oraz chromatografię powinowactwa (ligandem jest np. glutation). Bardzo szeroko stosowane jest oczyszczanie białek zawierających dodatkowo wprowadzone reszty histydynowe, cysteinowe lub tryptofanowe (grupy muszą być usytuowane na zewnątrz cząsteczki) na kolumnach

102

IMAC, powinowactwa z immobilizowanymi (chelatującymi) metalami (ang. immobilized metal affinity chromatography). Najczęściej wykorzystywane są jony miedzi, niklu, cynku, kobaltu, wapnia czy magnezu. Dodatkowe fragmenty mogą być łatwo usunięte przez trawienie enzymami proteolitycznymi, np. karboksypeptydazą B. Często wprowadza się pomiędzy białko i część znakującą dodatkowe sekwencje rozpoznawane przez specyficzne proteazy (trombina, czynnik Xa, enterokinaza). Prawidłowy przebieg odcinania jest monitorowany elektroforetycznie, ponieważ krótsze białko migruje szybciej.

Materiał

1 Złoże powinowactwa, Talon (Clontech)

2 Hodowla bakterii E. coli z nadekspresją białka FeldI. 3 Pusta kolumienka K9/15

4 Probówki

5 Standardy wielkości białek MW, 2,512; 6,214; 8,159; 14,404; 16,949 K. 6 Bibuła Whatman 3 MM.

7 Celofan

Aparatura

1 Wirówka Sorvall

2 Wirówka Eppendorf z chłodzeniem 3 Ręczny homogenizator (wychłodzony) 4 Kołyska

5 Aparat do elektroforezy pionowej Hoefer Mighty Small SE 250.