Odczynniki do 2-D: Cover Fluid, Anode Buffer, Cathode Buffer

4 Odczynniki do barwienia żeli elektroforetycznych: PlusOne Coomassie Blue R-350 5 Bufor do rehydratacji: 9 M mocznik, 1% CHAPS, 0,5% IPG Buffer pH 3-10, 0,4% DTT,

0,002% błękit bromofenolu

6 Bufor do równoważenia żelu IEF: 6M mocznik, 2% SDS, 1% DTT, 30% glicerol, 0,002% błękit bromofenolu, 50 mM Tris – HCl, pH 8,8.

Przygotowanie próbki

Hodowla linii komórek śródbłonka ludzkiego:

- Unieśmiertelnione komórki śródbłonka ludzkiego hodować z użyciem pożywki DMEM z dodatkiem 10% surowicy wołowej, antybiotyku oraz HAT

- Przed eksperymentem komórki przemyć 3-krotnie buforem PBS, pH 7.4.

- Osady komórek zawiesić w buforze lizującym (8M mocznik, 4% CHAPS, 2% bufor IPG 3-10, 1% DTT)

- Oczyścić próbkę używając zestawu 2-D Clean-Up Kit

- Stężenie białek w próbkach do elektroforezy dwukierunkowej oznaczyć przy użyciu zestawu 2-D Quant.

Przygotowanie systemu do pracy

Przygotować: żele, bufory do elektroforezy, rękawiczki gumowe, nożyczki, wodę destylowaną.

- Do pojemnika na paski IEF (24 cm Strip Holder) dodać 300µl buforu do rehydratacji żelu

- Próbkę z lizatem komórek śródbłonka w buforze do rehydratacji (nie więcej niż 200 µl) dodać do mieszaniny rehydratacyjnej

- Pasek do IEF wyjąć z opakowania tuż przed użyciem i zdjąć z niego folię

- Wsunąć pasek IEF, żelem do dołu, do pojemnika zawierającego mieszaninę rehydratacyjną oraz próbkę.

- Rehydratację prowadzić w systemie Ettan IPGphor przez około 12 godzin.

Przebieg doświadczenia

- Warunki rozdziału IEF były zgodne z instrukcją systemu Ettan IPGphor. Czas trwania izoogniskowania wynosił około 10 godzin.

- Po zakończeniu rozdziału IEF, paski równoważyć w czasie 15 min w buforze do równoważenia.

- Po usunięciu nadmiaru buforu z paska IEF (odsączenie na skrawku bibuły), umieścić go na górze żelu SDS-PAGE i zalać 0,5% agarozą.

- Wykonać rozdział w drugim kierunku w warunkach podanych w instrukcji do systemu

Ettan DALT. Czas rozdziału wynosi około 5 godz. Separację przerwać gdy „front”

rozdzielanych białek zbliża się do końca żelu (bufor anodowy).

- Rozdzielone białka barwić z użyciem błękitu Coomassie, a następnie odbarwiać w roztworze 40% metanolu i 10% kwasu octowego.

- Po wybarwieniu żele pozostawić na 2 godziny w 10% kwasie octowym, a następnie na 1 godzinę w 10% glicerynie.

Uwaga! Barwienie żeli wykonać z ciągłym delikatnym mieszaniem.

- Żele analizować za pomocą skanera ImmageScanner oraz oprogramowania

83 Oczekiwane wyniki

Przy zastosowaniu metody elektroforezy dwukierunkowej w żelach o dużym rozmiarze (26x20cm), można uzyskać efektywny rozdział białek nawet nieznacznie różniących się wartością pI oraz masą cząsteczkową. Liczba białek widocznych na żelu zależy jednak silnie od metody przygotowania próbki. Uzyskany obraz białek rozdzielonych w opisanym powyżej eksperymencie przedstawia rysunek. 11.1.

Rys. 11.1

Rozdział białek komórek śródbłonka z użyciem elektroforezy dwukierunkowej w żelu poliakrylamidowym. Pierwszy kierunek wykonano na paskach IEF pH 3-10 z zastosowaniem systemu Ettan IPGphor. Drugi kierunek, w żelu SDS-PAGE 12,5%, wykonano z użyciem systemu Ettan DALT. Białka wybarwiono błękitem Coomassie. W prawej części żelu widoczne są standardy mas cząsteczkowych.

Piśmiennictwo:

1. O’Farrell P.H., “High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins” J. Biol. Chem. 1975, 250, 4007-4021.

2. Berkelman T. et al. “2D Electrophoresis. Principles and Methods” Amersham Biosciences, 1998.

84 Przykład 12.

E

1,2Walkowiak B., ³ Walkowiak A.

1Zakład Biofizyki Molekularnej i Medycznej Instytutu Fizjologii i Biochemii Uniwersytetu Medycznego, ul. Mazowiecka 6/8, 92-215 Łódź,

e-mail: bogdan.walkowiak@csk.am.lodz.pl

2Zakład Biofizyki Instytutu Inżynierii Materiałowej Politechniki Łódzkiej, ul. Stefanowskiego 1/15, 90-924 Łódź,

3Pracownia Fizyki Gimnazjum nr 21 w Łodzi, ul Balonowa 1, 94-108 Łódź

Wprowadzenie:

Potrzeba jednoznacznej identyfikacji makrocząsteczek rozdzielanych elektroforetycznie doprowadziła do opracowania techniki elektroforetycznego transferu tych cząsteczek z żelu na membranę. Unieruchomione na membranie białka czy fragmenty DNA wizualizowane są następnie metodami immunobarwienia lub specyficznej hybrydyzacji. Opracowano różne metody transferu. W odniesieniu do białek najbardziej popularną metodą jest transfer wykonywany w warunkach pełnego zanurzenia żelu, i przylegającej do niego membrany, w buforze do transferu. Metoda ta ma jednak szereg wad. Potrzeba tam znacznej ilości buforu, czas trwania transferu jest długi i często nie przynosi spodziewanych efektów, a rozkład gęstości płynącego prądu jest niekorzystny dla transferu. Oba ostatnie parametry, to jest czas transferu i rozkład gęstości prądu w naczyniu do transferu rzutują na efektywność metody. Przeważająca ilość ładunku elektrycznego, stanowiącego prąd jonowy w elektrolicie, omija żel z przylegającą do niego membraną. Obniża to znacznie efektywność elektroforetycznego wymywania białek z żelu. Efekt ten dotyczy szczególnie mocno dużych białek. Z drugiej strony długi czas trwania procesu przyczynia się do elucji z membrany białek, które już opuściły żel i zdołały do niej dotrzeć. Tą drogą można stracić znaczną ilość białek, które po transferze zamiast na membranie będą znajdowały się w roztworze w całej objętości buforu. W ten sposób można wyjaśnić częste, wśród osób stosujących tę metodę, narzekania na kłopoty z białkami opornymi na ich wykrywanie metodą immunoblottingu. Dotyczy to szczególnie białek o małych i średnich masach. Wad tych nie ma metoda transferu półsuchego. Ilość buforu niezbędna do wykonania transferu jest bardzo niewielka. Potrzeba tylko nasączyć kilka warstw bibuły filtracyjnej. Prąd płynie tylko w obszarze wyznaczonym kontaktem żelu z membraną i z nasączonymi buforem bibułami, co pozwala na bardzo wysoka wydajność procesu, a czas trwania transferu jest niezwykle krótki, od kilku do kilkudziesięciu minut. W porównaniu z wielu godzinami niezbędnymi w poprzedniej metodzie uzyskuje się znaczne skrócenie czasu. Co więcej, w metodzie transferu półsuchego można łatwo zapobiegać ucieczce białek z membrany. Poniższe opracowanie ukazuje zalety techniki transferu półsuchego.

Materiały:

1 Ludzkie osocze ubogopłytkowe.

2 Żele do elektroforezy - PhstGel Homogenous 7.5. 3 Bufory elektrodowe - PhastGel Buffer Strips SDS.

85