bioloGiCzne Działanie naDtlenoazotynu

nadtlenoazotyn jest czynnikiem o szerokim spektrum działania w stosunku do biomolekuł. Biologiczne skutki modyfikacji oksydacyjnych wywołanych przez onoo– są liczne, ale ważne jest, aby pamiętać, że w dużym stopniu zależą one od stężenia tworzonego nadtlenoazotynu i jego komórkowej lokalizacji. związek

ten i jego pochodne reagują zarówno z aminokwasami (m.in. tyrozyną, cysteiną, metioniną, tryptofanem), lipidami (fosfolipidy błon, lipoproteiny frakcji ldl), kwa-sami nukleinowymi, a także różnymi antyoksydantami. nadtlenoazotyn powoduje tworzenie grup karbonylowych, dimeryzację, nitrowanie i nitrozylację aminokwa-sów, alkoholi, węglowodanów i związków tiolowych. może działać jako jedno- lub dwuelektronowy utleniacz, z istotną rolą jonów metali przejściowych, spełniających funkcję katalizatorów. jego aktywność, z jednej strony prowadzi do negatywnych następstw, takich jak utrata funkcji białek, a z drugiej, do powstawania związków będących donorami tlenku azotu, odgrywających rolę w rozkurczaniu naczyń krwionośnych [15].

liczne badania dowodzą, że powstający w naczyniach krwionośnych nadtleno-azotyn jest zarówno silnym oksydantem jak i czynnikiem nitrującym. modyfikacje białek spowodowane działaniem nadtlenoazotynu powodują zmiany w strukturze i funkcji tych biomolekuł, których występowanie stwierdzono w wielu stanach cho-robowych [39].

nadtlenoazotyn wywołuje nitrowanie reszt aminokwasów alifatycznych takich jak: cysteina, metionina oraz aminokwasów aromatycznych: tryptofan i tyrozyna. najbardziej podatne na utlenianie są aminokwasy siarkowe (cysteina, metionina), a także tyrozyna, tryptofan, fenyloalanina i histydyna [40]. działanie nadtleno-azotynu na białka ma bardzo istotne znaczenie w modulowaniu funkcjonowania enzymów. szczególnie narażone na działanie onoo– sągrupy prostetyczne zawie-rające jony metali przejściowych bądź hem. W wyniku ich utleniania dochodzi do zahamowania aktywności enzymatycznej m.in. mieloperoksydazy, ceruloplazminy, dysmutazy ponadtlenkowej [38]. Wolne rodniki powstające w wyniku homolizy nadtlenoazotynu, bądź podczas jego reakcji z co₂ (no₂•, oH•, no₂•, co₃•), również mają zdolność do oddziaływania z białkami, co prowadzi do ich modyfikacji. utle-nianie przez onoo– wolnych grup tiolowych prowadzi m.in. do zaburzenia funkcji enzymów zaangażowanych w metabolizm energetyczny komórki (dehydrogenazy bursztynianowej, reduktazy fumaranu) [10].

szczególną uwagę należy zwrócić na udział nadtlenoazotynu w procesie nitro-wania tyrozyny (rys. 2). nitrowanie tyrozyny prowadzi do kowalencyjnej modyfi-kacji białka w wyniku dodania grupy nitrowej (-no₂) w sąsiedztwie grupy hydrok-sylowej w pierścieniu aromatycznym reszt tyrozynowych. choć nadtlenoazotyn bezpośrednio nie może reagować z grupą fenolową, to produkty jego rozpadu – rodnik hydroksylowy i ditlenek azotu wykazują taką aktywność. dodatkowo, nie-trwały nitrozonadtlenowęglan (onooco₂–), powstający w reakcji onoo– z co₂, jest źródłem silnie reaktywnego rodnika węglanowego, który podobnie jak •oH może powodować tworzenie rodników tyrozylowych reagujących dalej z no₂•. onooco₂– ma czas półtrwania krótszy niż 3 ms i reaguje z tyrozyną ze stałą reakcji większą od 2 × 105 m–1 s–1 [41, 42]. rodniki co₃•– reagują z resztą tyrozyny poprzez oderwanie wodoru od grupy hydroksylowej, natomiast w odróżnieniu od rodników

•oH, nie przyłączają się do pierścienia aromatycznego. dzięki temu, może powsta-wać więcej rodników tyrozylowych, oddziałujących następnie z •no₂ do postaci

3-nitrotyrozyny. co prawda rodniki •no₂ również reagują z resztą tyrozyny poprzez oderwanie atomu wodoru z grupy hydroksylowej, jednak stała szybkości tej reak-cji jest 2–3 rzędy wielkości mniejsza od stałej szybkości reakreak-cji rodników •oH czy co₃•– [43–45].

Wielu autorów uważa, że markerem działania nadtlenoazotynu w organizmie jest obecność znitrowanej tyrozyny w białkach. W osoczu osób zdrowych poziom 3-nitrotyrozyny jest stosunkowo niski (< 0,1 nmol/mg białka), ale znacząco wzrasta w przebiegu wielu chorób związanych z ostrym lub przewlekłym stanem zapalnym (posocznica, zespół ostrej niewydolności płuc, choroba niedokrwienna serca, chro-niczna niewydolność nerek, reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzyca, nowotwory płuc), a także u osób palących [46–49].

rysunek 2. powstawanie nitrotyrozyny i dityrozyny przy udziale nadtlenoazotynu figure 2. formation of nitrotyrosine and dityrosine by peroxynitrite

nadtlenoazotyn nie tylko silnie działa na tyrozynę, ale również na aminokwasy siarkowe (cysteinę i metioninę) [50]. W przypadku cys onoo– jest odpowie-dzialny za proces dwuelektronowego utleniania prowadzący do wytworzenia wiązań disiarczkowych, co może być ważnym mechanizmem inaktywacji wielu enzymów. W temperaturze pokojowej, w pH fizjologicznym nadtlenoazotyn utlenia grupy –sH około 1000 razy szybciej niż nadtlenek wodoru. reakcja onoo– z grupami tiolowymi przebiega z wytworzeniem produktów pośrednich, głównie s-nitrotioli

(rsno₂) oraz niewielkich ilości s-nitrozotioli (rsno). te drugie są ważnym skład-nikiem metabolizmu tlenku azotu i odgrywają istotną rolę w przekształcaniu tok-sycznego onoo– do tlenku azotu [51].

metionina jest utleniana przez nadtlenoazotyn [52], jak również przez inne reaktywne formy tlenu, takie jak nadtlenek wodoru, ozon, kwas chlorowy(i), do sulfotlenku metioniny (mesoX) i dalej do sulfonu metioniny (me2soX) (rys. 3).

In vivo działanie nadtlenoazotynu na metioninę ograniczone jest prawdopodobnie

do dwuelektronowego utleniania jej do mesoX. powyższa reakcja zachodzi, jeśli w jej środowisku nie występuje ditlenek węgla. utlenianie metioniny hamowane jest więc przez obecność ditlenku węgla, niezależnie od pH roztworu w przeciwieństwie do reakcji nitrowania tyrozyny. nitrowanie tyrozyny i utlenianie metioniny, są zatem reakcjami konkurencyjnymi i zależą od dostępności ditlenku węgla [53, 54].

rysunek 3. proces wywołanego przez nadtlenoazotyn utleniania metioniny figure 3. the process of peroxynitrite-induced oxidation of methionine

nadtlenoazotyn powoduje także modyfikację związków lipidowych: fosfolipi-dów błon, liposomów i lipoprotein [34]. peroksydacja lipifosfolipi-dów z udziałem onoo–

polega na odłączeniu atomu wodoru od nienasyconych kwasów tłuszczowych. nie jest przy tym wymagana obecność jonów metali przejściowych jako katalizatorów reakcji. produktami utleniania lipidów są wodoronadtlenki lipidów, skoniugowane dieny i aldehydy. produkty pośrednie peroksydacji (wodoronadtlenki lipidów, dial-dehyd malonowy, izoprostany, 4-hydroksynonenal) mogą prowadzić do dalszych uszkodzeń oksydacyjnych w komórce. utlenianie fosfolipidów oraz cholesterolu jest przyczyną zmian płynności i przepuszczalności błon komórkowych, co ma poważne konsekwencje dla prawidłowego funkcjonowania komórki. utlenianie lipidów two-rzących otoczkę mielinową neuronów prowadzi do demielinizacji i rozwoju chorób układu nerwowego [13, 18, 55]. nitrowanie fosfolipidów błon wpływa na zaburze-nie transdukcji sygnału w komórce [7].

lipoproteiny o niskiej gęstości (ldl) są szczególnie podatne na utleniające i nitrujące działanie nadtlenoazotynu. akumulacja utlenionego cholesterolu i ldl jest przyczyną rozwoju miażdżycy [56].

nadtlenoazotyn jako silny związek utleniający i nitrujący jest w stanie wywo-ływać modyfikacje zasad azotowych. spośród 4 zasad azotowych nukleotydów największą wrażliwość na jego toksyczne działanie wykazuje guanina. W wyniku

jej utleniania powstaje 8-oksoguanina, która następnie może zostać przekształcona do kwasu cyjanurowego i oksazolonu. W konsekwencji dochodzi do rozerwania pierście nia imidazolowego guaniny i powstania trwałej mutacji. nadtlenoazotyn powoduje również nitrowanie guaniny, czego produktem jest 8-nitroguanina, trakto-wana jako specyficzny marker uszkodzeń dna wywołanych przez onoo– [57, 58]. nadtlenoazotyn poprzez swoje toksyczne działanie przyczynia się do powstawania jedno- i dwuniciowych pęknięć dna. W wyniku odłączenia atomu wodoru od deok-syrybozy dochodzi do rozerwania pierścienia cukrowego i przerwania nici dna. powstawanie jednoniciowych pęknięć dna spowodowanych działaniem onoo–

obserwuje się głównie w pH zasadowym, podczas gdy liczba uszkodzeń w pH kwaśnym i obojętnym jest dużo niższa. jednoniciowe pęknięcia dna powstające na skutek uszkadzającego wpływu nadtlenoazotynu mogą nadmiernie aktywować jądrowy enzym – polimerazę poli(adp-rybozy) (parp), co w konsekwencji prowa-dzi do nekrotycznej śmierci komórki w warunkach stresu oksydacyjnego [59–61].

piśmienniCtwo Cytowane

[1] e.r. stadtman, r.l. levine, ann. n. y. acad. sci., 2000, 899, 191.

[2] n.r. madamanchi, a. vendrov, m.s. runge, arterioscler. thromb. vasc. Biol, 2005, 25, 29. [3] k.k. Griendling, G.a. fitzGerald, circulation, 2003, 108, 1912.

[4] r. radi, proc. natl. acad. sci. u.s.a, 2004, 101, 4003.

[5] H. ischiropoulos, l. zhu, j.s. Beckman, arch. Biochem. Biophys., 1992, 298, 446. [6] d. salvemini, s. cuzzocrea, free radic. Biol. med., 2002, 33, 1173.

[7] c. szabo, H. ischiropoulos, r. radi, nat. rev. drug discov., 2007, 6, 662.

[8] j.s. Beckman, t.W. Beckman, j. chen, p.a. marshall, B.a. freeman, proc. natl. acad. sci. u.s.a, 1990, 87, 1620.

[9] p.c. dedon, s.r. tannenbaum, arch. Biochem. Biophys., 2004, 423, 12. [10] j.p. kamat, indian j. exp. Biol, 2006, 44, 436.

[11] j.t. Groves, curr. opin. chem. Biol, 1999, 3, 226.

[12] l. liaudet, G. vassalli, p. pacher, front Biosci., 2009, 14, 4809. [13] a. denicola, r. radi, toxicology, 2005, 208, 273.

[14] r. radi, G. peluffo, m.n. alvarez, m. naviliat, a. cayota, free radic. Biol. med., 2001, 30, 463. [15] c. ducrocq, B. Blanchard, B. pignatelli, H. ohshima, cell mol.life sci., 1999, 55, 1068. [16] j.s. Beckman, j. chen, H. ischiropoulos, j.p. crow, methods enzymol., 1994, 233, 229. [17] W.a. pryor, G.l. squadrito, am. j. physiol, 1995, 268, 699.

[18] p. pacher, j.s. Beckman, l. liaudet, physiol. rev., 2007, 87, 315. [19] m.c. symons, j. inorg. Biochem., 2000, 78, 299.

[20] e. potargowicz, e. szerszenowicz, m. staniszewska, d. nowak, postepy Hig. med. dosw., 2005, 59, 259.

[21] a. Gendzwill, pol. merkur. lekarski, 2007, 23, 280.

[22] r. rutkowski, s.a. pancewicz, k. rutkowski, j. rutkowska, pol. merkur. lekarski, 2007, 23, 131. [23] f. krotz, H.y. sohn, u. pohl, arterioscler. thromb. vasc. Biol, 2004, 24, 1988.

[24] r.p. patel, j. mcandrew, H. sellak, c.r. White, H. jo, B.a. freeman, v.m. darley-usmar, Biochim. Biophys. acta, 1999, 1411, 385.

[26] r.f. furchgott, j.v. zawadzki, nature, 1980, 288, 373.

[27] r.m. palmer, a.G. ferrige, s. moncada, nature, 1987, 327, 524.

[28] m.c. carreras, j.j. poderoso, am. j. physiol. cell physiol., 2007, 292, 1569.

[29] m. mielczarek-puta, a. chrzanowska, W. Grabon, a. Baranczyk-kuzma, postepy Hig. med. dosw., 2008, 62, 214.

[30] B. alvarez, r. radi, amino. acids, 2003, 25, 295.

[31] r. meli, t. nauser, p. latal, W.H. koppenol, j. Biol. inorg. chem., 2002, 7, 31.

[32] o. augusto, m.G. Bonini, a.m. amanso, e. linares, c.c. santos, s.l. de menezes, free radic. Biol. med., 2002, 32, 841.

[33] j. zielonka, a. sikora, j. joseph, B. kalyanaraman, j. Biol. chem., 2010, 285, 14210. [34] r. radi, j.s. Beckman, k.m. Bush, B.a. freeman, arch. Biochem. Biophys., 1991, 288, 481. [35] H. Gunaydin, k.n. Houk, chem. res. toxicol., 2009, 22, 894.

[36] m.p. jensen, d.p. riley, inorg. chem., 2002, 41, 4788.

[37] a. korkmaz, s. oter, m. seyrek, t. topal, interdiscip. toxicol., 2009, 2, 219. [38] G. ferrer-sueta, r. radi, acs chem. Biol, 2009, 4, 161.

[39] p. nowak, B. olas, B. Wachowicz, postepy Biochem., 2010, 56, 239. [40] c. szabo, toxicol. lett., 2003, 140-141, 105.

[41] s.v. lymar, Q. jiang, j.k. Hurst, Biochemistry, 1996, 35, 7855.

[42] s. zhu, k.f. Basiouny, j.p. crow, s. matalon, am. j. physiol. lung. cell mol. physiol, 2000, 278, 1025.

[43] j.m. souza, G. peluffo, r. radi, free radic. Biol. med., 2008, 45, 357. [44] l. Gebicka, j. didik, postępy Biochem., 2010, 56, 103.

[45] s. Bartesaghi, G. ferrer-sueta, G. peluffo, v. valez, H. zhang, B. kalyanaraman, r. radi, amino. acids, 2007, 32, 501.

[46] c. vadseth, j.m. souza, l. thomson, a. seagraves, c. nagaswami, t. scheiner, j. torbet, G. vilaire, j.s. Bennett, j.c. murciano, v. muzykantov, m.s. penn, s.l. Hazen, j.W. Weisel, H. ischiropoulos, j. Biol. chem., 2004, 279, 8820.

[47] B. pignatelli, c.Q. li, p. Boffetta, Q. chen, W. ahrens, f. nyberg, a. mukeria, i. Bruske-Hohlfeld, c. fortes, v. constantinescu, H. ischiropoulos, H. ohshima, cancer res., 2001, 61, 778. [48] n.W. kooy, j.a. royall, y.z. ye, d.r. kelly, j.s. Beckman, am. j. respir. crit. care med., 1995, 151,

1250.

[49] B. lipinski, j. diabetes complications, 2001, 15, 203.

[50] B. alvarez, G. ferrer-sueta, B.a. freeman, r. radi, j. Biol. chem., 1999, 274, 842.

[51] a. van der vliet, p.a. Hoen, p.s. Wong, a. Bast, c.e. cross, j. Biol. chem., 1998, 273, 30255. [52] W.a. pryor, X. jin, G.l. squadrito, proc. natl. acad. sci. u.s.a, 1994, 91, 11173.

[53] B.s. Berlett, r.l. levine, e.r. stadtman, proc. natl. acad. sci. u.s.a, 1998, 95, 2784.

[54] m. tien, B.s. Berlett, r.l. levine, p.B. chock, e.r. stadtman, proc. natl. acad. sci. u.s.a, 1999, 96, 7809.

[55] r.G. Brannan, e.a. decker, j. agric. food chem., 2001, 49, 3074.

[56] H. Botti, a. trostchansky, c. Batthyany, H. rubbo, iuBmB. life, 2005, 57, 407. [57] t. douki, j. cadet, free radic. res., 1996, 24, 369.

[58] v. yermilov, j. rubio, H. ohshima, feBs lett., 1995, 376, 207.

[59] H. ohshima, l. virag, j. souza, v. yermilov, B. pignatelli, m. masuda, c. szabo, methods mol. Biol, 2002, 186, 77.

[60] c. szabo, H. ohshima, nitric. oxide., 1997, 1, 373. [61] c. szabo, free radic. Biol. med., 1996, 21, 855. praca wpłynęła do redakcji 26 kwietnia 2012

CHemiCzne aspekty CelowaneJ terapii