Budowa proteasomu

Proteasomy występują we wszystkich organizmach prokariotycznych i eukariotycznych. Ich struktura bardzo nieznacznie zmienia się w zależności od stopnia rozwoju organizmów, w których występują. W pracy zostanie przedstawiona struktura i mechanizm działania proteasomu ludzkiego.

3.3.1. Proteasom 26S

Proteasom jest dużym kompleksem białkowym zbudowanym z ponad 30 łańcuchów polipeptydowych o łącznej masie cząsteczkowej równej ok. 2000 kDa.63 Stała sedymentacji tego kompleksu wynosi 26S (26 Svedbergów) dlatego też opisuje się go jako proteasom 26S. Składa się on z dwóch zasadniczych części: regulatorowej – proteasom 19S oraz katalitycznej – proteasom 20S (Schemat 22B i 22C).^64-66

3.3.1.1. Proteasom 19S

Zadaniem proteasomu 19S jest rozpoznawanie oraz rozwijanie protein, które w wyniku znakowania cząsteczkami ubikwityny stanowią substraty w reakcji degradacji katalizowanej przez proteasom 20S. Proteasom 19S, w skład którego wchodzi 19 białek, zbudowany jest z dwóch różniących się funkcją części: podstawy oraz wieka. Wieko odpowiedzialne jest za rozpoznanie substratu oraz rozkład łączącego się z nim łańcucha

poliubikwitynowego. W jego skład wchodzi 10 protein. Podstawa proteasomu 19S składa się z 9 protein, wśród których wyróżnić można sześć ATPaz bezpośrednio oddziałujących z podjednostką α proteasomu 20S. Wspomagają one energozależne rozwijanie łańcucha peptydowego substratu, otwieranie kanałów pierścienia α proteasomu 20S oraz przenoszenie substratu do komory w obrębie podjednostek β tego proteasomu. W skład jednego proteasomu 26S wchodzą dwa proteasomy 19S (Schemat 22A).67

3.3.1.2. Proteasom 20S

Proteasom 20S jest polipeptydem o masie ok. 700 kDa i jest jednym z podstawowych składników komórkowych stanowiąc ok. 1% masy wszystkich białek w komórce. Posiada strukturę w kształcie cylindra składającego się z 28 podjednostek ułożonych w cztery heptameryczne pierścienie, przy czym każdy z nich zbudowany jest z 7 podjednostek α lub β (Schemat 22B). Dwa zewnęt rzne pierścienie zbudowane z podjednostek α1−7 mają charakter strukturalny. Pozostałe dwa pierścienie leżące wewnątrz składają się z podjednostek β1-7, wśród których β1, β2 i β5 wykazują właściwości katalityczne.68

Badania rentgenograficzne proteasomu 20S wykazały, że kształt pierścieni ułożonych w sekwencji αββα determinuje strukturę cylindra o długości 150 Å. Posiada on wolny kanał biegnący przez środek.69

Wejście do kanału jest bardzo wąskie i ma szerokość 13 Å, natomiast wewnątrz znajduje się komora o szerokości 53 Å, w obrębie której usytuowane są centra aktywne enzymu. Składają się one z 6 reszt aminokwasowych treoniny kluczowych w procesie katalizy reakcji proteolizy. Są one rozmieszczone w trzech podjednostkach każdego z pierścieni β (Schemat 22C).^70,71Wąski dostęp do centrum aktywnego enzymu pociąga za sobą konieczność wstępnego rozwinięcia struktury hydrolizowanego białka z udziałem proteasomu 19S.

Każda z występujących w proteasomie 20S podjednostek β wykazujących właściwości katalityczne posiada inny rodzaj aktywności. Każda z podjednostek β1, β2 i β5 posiada N-końcową treoninę (Thr1), której obecność jest kluczowa do osiągnięcia aktywności proteolitycznej enzymu i która stanowi jego zasadnicze centrum aktywne. Grupa hydroksylowa łańcucha bocznego treoniny odpowiedzialna jest za nukleofilowy atak na węgiel karbonylowy wiązania peptydowego, natomiast rodzaj wiązania peptydowego, na które następuje atak determinuje obecność innych łańcuchów bocznych aminokwasów tworzących tak zwane wnęki wiążące.

Zgodnie z modelem dla proteaz stworzonym przez Schechtera i Bergera wnęki opisywane są symbolami S1, S2, …, Sn i S1’, S2’, …, Sn’ odpowiadającymi miejscom wiążącym reszty aminokwasowe substratu (liganda) występującym przed (P1, P2, …, Pn) i po (P1’, P2’, …, Pn’) hydrolizowanym wiązaniu peptydowym (P1–P1’) (Rysunek 3).72

Symbole Pn i Pn’ stosowane są również do opisu reszt występujących w peptydowych inhibitorach enzymów proteoilitycznych. Analogicznie numerowanie tych reszt rozpoczyna się od miejsca (wiązania), które bierze udział w tworzeniu kowalencyjnego wiązania z enzymem (Rysunek 3). Wiadomo, że nie każdy związek może być dowolnie hydrolizowany w reakcji katalizowanej danym enzymem. To samo twierdzenie odnosi się do inhibitorów, co oznacza, że nie każdy inhibitor może oddziaływać z enzymem jednocześnie hamując jego aktywność biologiczną. Wiąże się to z definicją farmakofora. Farmakofor jest to zestaw sterycznych oraz elektronowych właściwości związku, których występowanie jest niezbędne do zapewnienia optymalnych supramolekularnych oddziaływań ze specyficznym biologicznym celem (enzymem) z osiągnięciem zamierzonej aktywności biologicznej lub jej inhibicji. Farmakofor nie oznacza struktury konkretnego związku, a raczej wskazuje grupę związków posiadających zbliżone, określone grupy funkcyjne oraz co za tym idzie właściwości.73 Tak więc do osiągnięcia zamierzonego działania enzymu (aktywność proteolityczna lub jej inhibicja) potrzebna jest obecność odpowiednich grup funkcyjnych w pozycjach P1-Pn i P1’-Pn’ substratu lub inhibitora specyficznie oddziałującego z kieszeniami S1-Sn i S1’-Sn’ enzymu. Zatem w strukturze substratu lub inhibitora kluczową rolę ma zarówno rodzaj łańcuchów bocznych aminokwasów wchodzących w skład łańcucha peptydowego jak i konfiguracja absolutna na centrach stereogenicznych poszczególnych aminokwasów.

N H N H N H N H O O O O N H O R₂ R₁ R₁' R₂' R₃' N H R₃ S1 S2 S3 S1' S2' S3' N H N H N H O O O O O O P1 P2 P3 P1' P2' P3' ENZYM

Substrat (proteina) / inhibitor Pn Sn' Pn' ... ... ... ... Sn

Rysunek 3. Schematyczny model proteaz z oznaczonymi wnękami oddziałującymi z resztami substratów oraz przykładowego inhibitora; linią przerywaną wskazano w substracie miejsce działania hydrolitycznego enzymu

3.3.1.2.1. Selektywność podjednostek β proteasomu 20S

Najistotniejszą różnicą w budowie podjednostek β proteasomu wpływającą na selektywność danej podjednostki jest łańcuch boczny w pozycji 45. Znajduje się on we wnęce wiążącej S1, w której usytuowuje się łańcuch boczny aminokwasu sąsiadujący z hydrolizowanym wiązaniem peptydowym P1.74 W ten sposób rozróżniamy trzy selektywne aktywności charakterystyczne dla każdej podjednostki:

- chymotrypsynopodobna (ang. chymotrypsin-like) dla β5 (reszta Met45): hydroliza wiązania peptydowego występującego po aminokwasie z rozbudowanym, hydrofobowym łańcuchem bocznym,

- trypsynopodobna (ang. trypsin-like) dla β2 (reszta Gly45): hydroliza wiązania peptydowego występującego po aminokwasie z zasadowym łańcuchem bocznym,

- kaspazopodobna (ang. caspase-like), pokwasowa (ang. postacidic) lub peptydylo-glutamylowa hydrolizująca peptydy (ang. peptidyl-glutamyl peptide hydrolyzing, PGPH) dla β1 (reszta Arg 45): hydroliza wiązania peptydowego występującego po aminokwasie z kwaśnym łańcuchem bocznym.65,67

Różnorodność selektywności powoduje, że proteasom jest zdolny do zhydrolizowania niemal każdego wiązania w łańcuchu peptydowym. Produktami proteolizy katalizowanej przez proteasom są oligopeptydy o długości łańcuchów składających się od 3 do 25 aminokwasów, ze średnią ilością 8 do 12 aminokwasów w łańcuchu.74

Wykazano, że inhibicja lub inaktywacja poprzez mutację podjednostki β5 powoduje znaczny spadek aktywności proteolitycznej proteasomu. Podobnych zależności nie obserwowano jednak dla aktywności podjednostek β1 oraz β2. Wyniki te wskazują na kluczowe znaczenie aktywności chymotrypsynowej dla ogólnej proteolizy katalizowanej przez proteasom.⁷⁵ Inne badania wykazały, że do inhibicji degradacji protein w komórkach raka szyjki macicy HeLa, której rezultatem jest apoptoza tych komórek i działanie przeciwnowotworowe, potrzebne jest blokowanie wszystkich centrów aktywnych w podjednostkach β1, β2 i β5 w proteasomie.76

W kolejnej części pracy szczegółowo przedstawiony zostanie mechanizm proteolizy katalizowanej przez proteasom oraz inhibicja tego enzymu z podziałem na grupy inhibitorów i ich działanie.