CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA

Chromatografia powinowactwa stanowi niezwykle użyteczną metodą izolowa­ nia białek, szczególnie tych, których oczyszczenie jest trudne lub nawet niemożli­ we do osiągnięcia metodami tradycyjnymi. Wysoka specyficzność powyższej tech­ niki jest uwarunkowana wzajemnym powinowactwem dwóch substancji biologicz­ nie czynnych. Jedna z nich, kowalencyjnie związana z nierozpuszczalnym nośni­ kiem i zwana ligandem, specyficznie adsorbuje drugą substancję, izolując ją z mie­ szaniny innych związków. W chromatografii powinowactwa ligand związany z noś­ nikiem nazywa się biosorbentem. Przykłady swoistych ligandów dla kilku znanych białek zestawiono w Tabeli 1.

W chromatografii powinowactwa duże znaczenie ma stosowany nośnik. Do­ bry wypełniacz kolumn powinien posiadać następujące właściwości:

a) hydrojilowość: redukuje niespecyficzne oddziaływania;

b) strukturą makroporowatą: warunkuje dostępność całkowitej powierzchni złoża dla większości molekuł obecnych w mieszaninie;

104 M. WÓJCIK, M. KOZIOŁKIEW ICZ

c) sztywność struktury: decyduje o odporności złoża na ciśnienie stosowane podczas separacji;

d) obojętność chemiczną: nośnik nie powinien uczestniczyć w procesie sepa­ racji białek;

e) stabilność chemiczną, wypełniacz musi odznaczać się odpornością na sto­ sowane rozpuszczalniki.

Tabela 1. Specyficzność wybranych ligandów [9]

Ligand Specyficzność

NAD, NADP Dehydrogenazy

Białko A Fragment Fc przeciwciał

Białko G Przeciwciała

Lizyna Plazminogen

Arginina Fibronektyna, protrombina

Heparyna Lipoproteiny

Benzamidyna Proteazy serynowe

Żelatyna Fibronektyna

Błękit B Kinazy, dehydrogenazy

Jako nośniki najczęściej wykorzystywane są sita molekularne, w odpowiedni sposób zaktywowane. Są to pochodne dekstranowe (Sephadex), agarozowe (Se- pharose) lub poliakryloamidowe (Bio Gel P i Enzacryl). Można wyróżnić dwie for­ my nośników, tj. nieaktywowane i aktywowane. Pierwsza grupa może być przysto­ sowana do celów chromatografii powinowactwa we własnym zakresie, druga zaś, spotykana w handlu, obejmuje preparaty specjalnie przystosowane do kowalencyj­ nego wiązania z ligandem. Do aktywacji żelu powszechnie stosuje się reakcję z bro- mocyjanem, w wyniku której powstająugrupowania karboiminowe, reagujące wyłą­ cznie z grupami aminowymi przyłączanej substancji. Z tak przygotowanym nośni­ kiem można kowalencyjnie związać białka, kwasy nukleinowe oraz te wielocukry, które zawierają reszty aminocukrowe. W tym miejscu warto zaznaczyć, że grupy karboiminowe są nietrwałe w środowisku wodnym i dlatego aktywowane złoże po­ winno być poddane reakcji wiązania z ligandem natychmiast po rozpuszczeniu, lub przechowywane w postaci zliofilizowanej z dodatkiem substancji stabilizujących, np. dekstranu czy laktozy. W takiej postaci dostarczane są nośniki aktywowane fir- mowo.

Rzadziej stosowane w wiązaniu ligandu do nośnika są grupy: epoksydowa i 2,2,2-trifluoroetanosulfonylowa. Tabela 2 podaje kilka przykładów grup aktyw­ nych nośnika używanych w chromatografii powinowactwa oraz reagujące z nimi grupy funkcyjne ligandów.

W YKORZYSTANIE CHROMATOGRAFII DO IZOLOWANIA BIAŁEK 105

Tabela 2. Charakterystyka fazy stałej [9]

Grupy aktywne względem ligandu

Grupa reagująca z nośnikiem

Grupa dystansowa ^Optimum

pH ^{Specyficzność} BrCN n h2 8 - 10 Białka, peptydy M erkaptopropylowa SH Równowartość ok. 13 atomów węgla 9-11 Związki sulfhydrylowe

Tiolowa SH _{9-13 Związki sulhydrylowe}

Epoksydowa n h2 Równowartość 9 Białka, peptydy OH ok. 1 1 atomów _{10 Węglowodany} SH węgla _{1 1} Związki

sulfhydrylowe 2,2,2-trifluoroetanosuIfonylowa n h2 8 - 10 Białka, peptydy

Aminoheksylowa COOH 6 atomów węgla Aminokwasy, białka

Karboksyheksylowa n h2 6 atomów węgla Kwasy karboksylowe

Aktywność biosorbentu można znacznie podwyższyć poprzez zmianą odleg­ łości między cząsteczkami ligandu i nośnika. Długość wiązania ligand-nośnik po­ winna być taka, aby miejsce aktywne ligandu było dostępne dla danego białka. Jest to szczególnie ważne dla niewielkich ligandów. W przypadku ligandów o znacz­ nych rozmiarach i białek o małej masie cząsteczkowej, stosowanie grup dystanso­ wych nie jest wymagane. Jeżeli interesujące nas białko charakteryzuje się wysoką masą cząsteczkową wówczas wskazana jest obecność grup dystansowych. Ich obec­ ność sprawia, że częściowo zostają wyeliminowane efekty steryczne nośnika, a tym samym wzrasta dostępność miejsca aktywnego ligandu dla proteiny. W sytuacji, gdy nie posiadamy wiedzy o odległości między cząsteczkami ligandu i nośnika, na­ leży rozpocząć próby z nośnikami, które zawierają łańcuch alifatyczny z sześcioma atomami węgla. Jest to długość łańcucha nośnika optymalna dla większości roz­ działów prowadzonych na drodze chromatografii powinowactwa.

Podczas etapu przyłączenia ligandu do nośnika, należy wziąć pod uwagę efek­ ty steryczne ligandu oraz wielkość grup dystansowych. Wysokie stężenie niewiel­ kich ligandów może blokować niektóre aktywne miejsce na złożu, przyczyniając się do niższej wydajności ich wiązania. W związku z tym, optymalne stężenie ligan­ dów białkowych o masie cząsteczkowej około 50 kDa wynosi 10 mg ligandu/ml żelu. Dla dużych ligandów, które mogą blokować sąsiadujące miejsca aktywne, stę­ żenie powinno być znacznie mniejsze, np. 5 mg/ml dla IgG lub 1 mg/ml dla IgM. Reakcja wiązania ligandu z nośnikiem wymaga 2-4 godzin inkubacji w temperatu­ rze pokojowej, lub 16 godzin inkubacji w temperaturze 4°C. Wybór warunków inku­ bacji jest przede wszystkim określony przez stabilność ligandu. Ponadto, w trakcie wiązania ligandu z nośnikiem, wymagana jest kontrola pH i siły jonowej buforu. Istotnym etapem przygotowania złoża jest usunięcie nadmiaru ligandu i zabloko­ wanie aktywnych grup nośnika, które nie zostały z nim związane i wobec tego sta­

106 M WÓJCIK, M KOZIOŁKIEW ICZ

nowią potencjalne miejsca niespecyficznych oddziaływań. Dla zablokowania tych miejsc stosuje się odpowiednie reagenty. W przypadku, kiedy grupa karboksylowa (COO~) jest stosowana do przyłączenia ligandu zawierającego grupę aminową(NH,), jako czynniki blokujące wykorzystywane są Tris lub etanoloamina. W sytuacji od­

wrotnej, tzn. kiedy grupy NH2 służą do przyłączenia ligandu z grupą (COO), wska­ zane jest użycie kwasu octowego jako czynnika blokującego. Stężenie czynnika blokującego powinno być 5-10-krotnie wyższe w stosunku do całkowitego stęże­ nia reaktywnych miejsc nośnika. Gwarantuje to całkowitą blokadę wszystkich nie- przereagowanych miejsc. Istotny wpływ na przebieg powyższego procesu ma stę­ żenie jonów wodorowych. Zbyt niska lub wysoka wartość pH może stanowić prze­ szkodę w całkowitym zablokowaniu nieprzereagowanych miejsc, lub przyczynić się do zniszczenia matrycy albo związanego z nią ligandu. Usunięcie czynnika blo­ kującego oraz zrównoważenie kolumny chromatograficznej wymaga przemycia jej buforem w ilości 5-10 objętości kolumny. Na tak przygotowaną kolumnę można nanieść badaną próbkę. Analizowane białka są zazwyczaj rozpuszczone w buforze fosforanowym lub buforze zawierającym Tris (0,1-0,2 M). Ten sam bufor jest zaz­ wyczaj buforem elucyjnym. Obecność NaCl (0,1-0,5 M) w buforze elucyjnym jest polecana w celu zmniejszenia niespecyficznych oddziaływań oraz zwiększenia od­ działywań białko-ligand.

2. CHROMATOGRAFIA Z UNIERUCHOMIONYM JO N EM METALU