PODSTAWY PROCESU

Aby lepiej zrozumieć mechanizm retencji chromatografii jonowo-wykluczają­ cej dla uproszczenia załóżmy, że fazą ruchomą jest czysta woda. Woda z fazy ru­ chomej tworzy sferę hydratacyjną dookoła zdysocjowanych grup funkcyjnych zło­ ża. Zawarta w porach i unieruchomiona dookoła grup funkcyjnych, tworzy fazę sta­ cjonarną. Pod względem formalnym można powiedzieć, że grupy funkcyjne złoża i jony wodorowe są rozpuszczone w tak zdefiniowanej fazie stacjonarnej. Wobec tego należy rozważać trzy części kolumny: stałe złoże, fazę stacj onamą i ciecz poru­ szającą się między ziarnami złoża, czyli fazę ruchomą.

CHROMATOGRAFIA W YKLUCZANIA JONOWEGO 119

Mechanizm retencji chromatografii jonowo-wykluczającej oparty jest na nas­ tępującym zjawisku [2-6]. Neutralne, nienaładowane cząsteczki mogą penetrować wnętrze żywicy i ewentualnie z nią oddziaływać. Cząsteczki te mogą pochodzić od obojętnych związków, np. cukrów i alkoholi, lub od niezdysocjowanych kwasów lub zasad. Z drugiej strony jony o tym samym ładunku co grupy funkcyjne złoża są od niego odpychane elektrostatycznie. Występuje tu analogia do równowagi Don- nana na półprzepuszczalnych membranach (Rys. 1.). Jony i obojętne cząsteczki mogą swobodnie przechodzić hipotetyczną membranę między obu fazami z wyjątkiem kowalencyjnie związanych ze złożem grup funkcyjnych. Z reguły stężenie jonów w fazie stacjonarnej jest znacznie większe niż w ruchomej, następuje osmotyczny przepływ wody do żywicy, powodujący jej pęcznienie. Proces pęcznienia zmniej­ sza się wraz ze wzrostem stężenia jonów w fazie ruchomej i wzrostem stopnia usie- ciowania żywicy.

hipotetyczna membrana Donnana

Rys 1 Schemat mechanizmu wykluczania jonów

Stosunek stężenia cząsteczek zjonizowanych do obojętnych jest funkcją stałej dysocjacji, pH i stężenia próbki. Określa on jej efektywny ładunek. Dlatego też wspomniana stała dysocjacji wpływa na retencję związków oznaczanych metodą chromatografii jonowo-wykluczającej. Mocne, całkowicie zdysocjowane, kwasy lub zasady są elektrostatycznie odpychane od złoża. W konsekwencji są one wymywa­ ne razem (nie rozdzielone) w objętości martwej kolumny, tzn. objętości fazy rucho­ mej w kolumnie. Z kolei niezdysocjowane cząsteczki mogąpenetrować wnętrze ży­ wicy. W przypadku czystego mechanizmu wykluczania jonowego (brak oddziały­ wań z żywicą) są one również wymywane razem w sumie objętości martwej i wew­ nętrznej kolumny. Objętość wewnętrzna kolumny oznacza tu objętość fazy stacjo­ narnej w kolumnie. W ten sposób można w łatwy sposób wyznaczyć eksperymen­ talnie obie te objętości [6]. Tylko kwasy i zasady o pośrednich wartościach stałych dysocjacji (lO ^ lO '2) mogą być rozdzielane w tej technice (przy założeniu czystego mechanizmu wykluczania jonów). Silniejszą retencję należy więc oczekiwać dla kwasów charakteryzujących się wyższymi wartościami pKz (ujemnego logaiytmu

120 B.K. GŁÓD

ze stałej dysocjacji), jak to zostało wykazane przez Tanakę i wsp. [7]. Analog:czna zależność dla zasad została po raz pierwszy zaobserwowana przez Haddada i wsp. [8], Zależności te są analogiczne do obserwowanych w chromatografii wykluczania sterycznego między współczynnikiem podziału, a logarytmem z mas molekular­ nych analizowanych związków.

OPIS TEORETYCZNY

Mechanizm retencji chromatografii wykluczania jonowego opisuje szereg róż­ nych modeli. W najprostszych przypadkach, używając bardzo zgrubnych założeń, otrzymano proste równania analityczne pozwalające na wyznaczenie współczynni­ ka podziału. Bardziej realistyczne podejście znacznie komplikuje wyprowadzone równania. Mogą być one rozwiązane globalnie. W tym przypadku podstawowe za­ leżności chromatograficzne oraz równowagi termodynamiczne odniesione są do obję­ tości piku chromatograficznego. Jest to hipotetyczna objętość, w której z założenia przyjmuje się stałe stężenie próbki równe jej stężeniu w maksimum piku,

W przypadku buforowanej fazy ruchomej po założeniu, że jony wodorowe w fazie ruchomej pochodzą tylko od buforu, a w fazie stacjonarnej tylko od grup funkcyjnych złoża, otrzymuje się [6]:

1 + 2 K * /

/ ^ K 2b+4Kbcb - K b s s

gdzie Yh+ i YF- oznaczają odpowiednio współczynniki aktywności jonów wodoro­ wych i zdysocjowanych grup funkcyjnych złoża w fazie stacjonarnej, K^, Kp i Kb- stałe dysocjacji próbki, grup funkcyjnych złoża i buforu, Kp - współczynnik po­ działu niezdysocjowanej postaci kwasu, cf i cb - stężenia grup funkcyjnych złoża i buforu, a indeksy M i S odpowiednio fazę ruchomą i stacjonarną.

W chromatografii jonowo-wykluczającej tradycyjnie stosuje się silne wymie­ niacze do oznaczania kwasów słabych i średniej mocy. Z powyższego równania wynika, że zmniejszenie stężenia zdysocjowanych grup funkcyjnych złoża (poprzez zmniejszenie ich całkowitego stężenia lub zastosowanie słabego wymieniacza) po­ winno zwiększyć współczynnik podziału. Takie podejście umożliwiłoby rozdziele­ nie również mocnych kwasów tą techniką, co faktycznie zostało potwierdzone eks­ perymentalnie [6, 8,9],

Po założeniu, że bufor i grupy funkcyjne złoża są mocnymi kwasami, a ich stężenia są znacznie większe od stężenia analizowanej próbki, powyższe równanie upraszcza się do postaci:

c h r o m a t o g r a f i aw y k l u c z a n i aj o n o w e g o 121

Proste równanie analityczne otrzymano również w przypadku gdy, fazą rucho­ mą była czysta woda i przy założeniu, że objętości fazy ruchomej i stacjonarnej są sobie równe [1 1, 1 2]:

Ka - 4c-™ +K> +8K*C™ _ - ^ K l + 8K,cm

4cmax - K Ł + Jk; +8^ ac _ 2cm -2 K t

gdzie cmax — stężenie w maksimum piku.

Z powyższego równania wynika m.in., że współczynnik podziału zależy od jednej tylko wielkości eksperymentalnej, stosunku c ^ K .

Podejście globalne jest niekonsekwentne, korzysta się w nim bowiem z rozkła­ du Gaussa zakładającego liniową izotermę adsorpcji. Możemy z nią mieć do czy­ nienia, gdy analizowana próbka występuje w jednej postaci. Gdy ulega ona asocja­ cji, dysocjacji lub jest skompleksowana, wówczas nie ma powodu aby obie postacie próbki były dokładnie tak samo zatrzymywane przez kolumnę. Powoduje to asyme­ trię piku. W przypadku próbki ulegającej dysocjacji w fazie ruchomej, jej stały sto­ pień dysocjacji uzyskuje się poprzez dodanie bufom do fazy ruchomej. Niestety, bufor uniemożliwia pracę niektórym detektorom (np. konduktometrycznemu, elek- trokinetycznemu czy też potencjometrycznemu). M.in. dlatego w chromatografii jonowo-wykluczającej często jako fazę ruchomą stosuje się czystą wodę.

Kształt piku odwzorowuje zmiany stężenia próbki, co oznacza, że w różnych jego częściach mamy do czynienia (gdy fazą ruchomą jest woda) z różnym stop­

niem dysocjacji próbki. Z obu stron, w jego dolnej części stężenie próbki jest naj­ mniejsze. Oznacza to największy efektywny ujemny ładunek próbki. Zgodnie z me­ chanizmem wykluczania jonowego początek i koniec piku poruszają się szybciej niż jego maksimum. Na chromatogramie przejawia się to frontalnym rozmyciem pików. Ponadto oznacza to, że retencja próbki zależy od jej stężenia. Zarówno bar­ dzo mocne jak i bardzo słabe kwasy występują w jednej postaci i dają symetryczne piki chromatograficzne. Dodatek buforu do fazy ruchomej powoduje, że stopień dysocjacji jest stały wzdłuż piku. Powoduje to otrzymanie symetrycznych pików oraz wpływa na współczynnik retencji próbki (Rys. 2.).

Proces chromatograficzny spowodowany jest przepływem fazy ruchomej przez kolumnę. Oznacza to stan nierównowagowy, nieodwracalny. Dokładny opis zjawi­ ska można uzyskać po rozwiązaniu układu równań różniczkowych opisujących prawo zachowania masy systemu. Jest on w ogólności nierozwiązywalny. Analitycznie można je rozwiązać jedynie dla bardzo uproszczonych przypadków jednoskładni­ kowej próbki. Nieco bardziej skomplikowane układy można rozwiązywać

metoda-122 B.K. GŁÓD

mi numerycznymi, modelującymi cykliczne przechodzenie próbki z fazy ruchomej do stacjonarnej i na odwrót.

2

Rys. 2. Wpływ buforu na retencję i symetrię pików alifatycznych kwasów tłuszczowych [30]: 1 - szczawiowy, 2 - bursztynowy, 3 - mrówkowy, 4 - octowy, 5 - propionowy i 6 - masłowy. Faza ruchoma: A - woda, B - 0,1 mM H,SOs. Kolumna: Bio-Rad HPX-87H, 300 * 7,8 mm śr. wew.

W modelowaniu komputerowym kolumny metodą Craiga, obliczenia nume­ ryczne symulujące kolumnę chromatograficzną są zastosowane lokalnie do małych (wąskich) jej fragmentów odpowiadających półkom teoretycznym [6]. Zakłada się przy tym, że na każdej półce dochodzi do ustalenia się równowagi. Metoda rekuren- cyjna symuluje przechodzenie próbki przez kolumnę. Polega ona na obliczaniu metodą iteracyjną równowagowych stężeń próbki i buforu w fazie ruchomej i sta­ cjonarnej na każdej półce. Ilość próbki ulegająca podziałowi jest równa sumie przy­ niesionej w porcji fazy ruchomej i pozostałej w fazie stacjonarnej z poprzedniego kroku czasowego. W następnym kroku faza ruchoma porusza się o jedną półkę wzdłuż kolumny i obliczane są nowe stężenia próbki i buforu.

Opracowane modele retencji chromatografii wykluczania jonowego pozwalają przewidywać wpływ szeregu parametrów charakteryzujących próbkę, fazę rucho­ mą i stacjonarną oraz kolumnę na retencję [5], W szczególności zaliczyć do nich można objętość i stężenie próbki, jej stałą dysocjacji, stężenie i stałą dysocjacji bu­

CHROMATOGRAFIA WYKLUCZANIA JONOWEGO 123

foru, obecność w fazie ruchomej związków inkluzyjnych lub jonowo-asocjacyj- nych, stężenie i stałą dysocjacji grup funkcyjnych złoża, wymiary kolumny oraz jej sprawność. Wyniki obliczeń uzyskane metodą modelowania kolumny lepiej zga­ dzają się z danymi eksperymentalnymi, niż uzyskane z równań globalnych.