2. Funkcjonalizacja układu cis-diolowego rybonukleozydów
2.2. Częściowe blokowanie grup funkcyjnych
W chemii rybonukleozydów najprostszym wydaje się być wprowadzanie modyfikacji w części cukrowej w pozycji 5’. Ze względu na obecność układu cis-diolowego można zastosować różne metody jednoczesnego blokowania grup 2’ i 3’-OH np. tworzenie cyklicznych ortoestrów, acetali, ketali (np. grupa 2’,3’-O-izopropylidenowa).[125,126] W ten sposób grupa 5’-OH pozostaje wolna i można ją bezpiecznie, selektywnie modyfikować. Z kolei regioselektywne modyfikowanie rybonukleozydów w pozycji 2’ lub 3’ wymaga przygotowania odpowiednich syntonów, w których grupa 2’-OH, albo 3’-OH pozostaje wolna. Przygotowanie związków z wolną grupą 2’-OH stało się relatywnie proste, gdy wprowadzono do użycia bifunkcyjne, disiloksanowe grupy symultanicznie blokujące pozycje 3’-OH i 5’-OH jak grupa tetraizopropylodisiloksanowa (TIPDSi) zaprojektowana przez W.T. Markiewicza (Rysunek 2.2.1),[127] które są relatywnie drogie.
Najbardziej wymagające jest uzyskanie syntonu z wolną grupą 3’-OH. Można go uzyskać przez uprzednie zablokowanie pozycji 5’ i 3’ grupą Markiewicza, następnie zablokowanie pozycji 2’ grupą niemigrującą w układzie cis-diolowym (np. grupą eterową jak
Rysunek 2.2.1. Przykład wykorzystania TIPDSiCl2 w chemii nukleozydów przez S.K. Roya i J.-Y. Tanga.[141]
Rysunek 2.2.2. Częściowe acylowanie rybonukleozydów zaprezentowane przez Y. Ishido et al.[128]
grupa trytylowa, tetrahydropiranylowa, allilowa, metoksymetylowa), zdjęcie blokady Markiewicza i selektywne wprowadzenie grupy ochronnej w pozycji 5’. Do tego celu nadają się grupy o dużej zawadzie sterycznej jak grupa trytylowa, piwaloilowa, benzoilowa i t-butylodimetylosililowa. Innym wyjściem jest zastosowanie strategii częściowego blokowania wykorzystując różnice w kwasowości i dostępności grup hydroksylowych części
cukrowej. Obliczone w kalkulatorze* wartości pKa dla grup hydroksylowych urydyny wynoszą 12,7 (2’-OH), 13,0 (3’-OH), 14,6 (5’-OH). Z tych wartości wynika, że w pierwszej
kolejności np. acylowaniu ulegać będzie grupa 2’-OH (Rysunek 2.2.2.). W momencie, gdy w układzie cis-diolowym jest już jedna grupa ochronna, wówczas ze względów sterycznych kolejne acylowanie zachodzić będzie preferencyjnie na grupie 5’-OH. Przy odpowiednim
Tabela 2.2.1. Acylowanie rybonukleozydów; Piv – piwaloil, Bz – benzoil, An – anizoil, wydajność po kolumnie chromatograficznej. [136] * 2-N-izobutyryloguanozyna, ** acylowaniu uległa też grupa egzoaminowa zasady.
doborze warunków i wielkości czynnika acylującego można uzyskać duże nadmiary izomeru o wolnej grupie 3’-OH. Dla czynników acylujących warunki częściowego blokowania badano w zespole Y. Ishido[128] i najlepsze wyniki przedstawiono w Tabeli 2.2.1. Odpowiedni chlorek acylu dodawano kroplami do schłodzonej mieszaniny reakcyjnej. Wykazano, że głównym produktem diacylowania rybonukleozydów był związek 2’,5’-O-diacylowany. Mieszaninę oczyszczano na chromatograficznej kolumnie żelowej w celu określenia wydajności diacetylowania części cukrowej. W trakcie oczyszczania na kolumnie zachodziła migracja acylu w układzie cis-diolowym. Po kilkukrotnej krystalizacji autorzy uzyskiwali w postaci czystej produkty 3’,5’-diacylowane.
Wyniki te wykorzystano w innych pracach jak np. w syntezie przedstawionej przez M. Kawana et al.,[129] w której autorzy bez oczyszczania, po częściowym piwaloilowaniu w obniżonej temp. przeprowadzili mesylowanie metodą one-pot, co jak w przypadku cytydyny (85) pozwoliło wyizolować czystą 3’-O-mesylo-4-N,2’,5’-O,O-tripiwaloilo-cytydynę (86, 72%) (Rysunek 2.2.3.), którą w dalszym etapie przeprowadzono do postaci 3’-deoksyarabinofuranozylowej. W przypadku pozostałych nukleozydów udało się uzyskać surową postać analogów mesylowanych, które okazały się w dalszych etapach również prowadzić do pochodnych 3’-deoksyarabinofuranozylowych z wydajnościami 28-56%. Z kolei J. Fogt et al.[130] (Rysunek 2.2.4.) w swej pracy wykazali, że w wyniku zastosowanej procedury częściowego piwaloilowania cytydyny przy odpowiednim nadmiarze
B RCl Ekw. Rozp. Temp. II+III
/[%] IV + V /[%] VI /[%] U BzCl 2,2 Py lód/NaCl 10 75 14 U PivCl 2,5 Py lód/NaCl - 97 - A BzCl 2,4 Py/DMF lód/NaCl - 77 21
A PivCl 4,0 Py/DMF lód/NaCl - 77 10
C PivCl 6,0 Py/DMF lód/NaCl - 87 -
G PivCl 3,3 Py t.pok. - 75(19**) 6
GiBu* BzCl 2,4 Py lód/NaCl - 76 21
Rysunek 2.2.3. Otrzymywanie 3’-O-mesylo-4-N,2’,5’-O,O-tripiwaloilocytydyny .
Rysunek 2.2.4. Częściowe acylowanie cytydyny oraz 2’-C-metylocytydyny.
chlorku piwaloilu (3,5 ekw.) można uzyskać głównie 4-N,2’,5’-O,O-tripiwaloilocytydynę (87) i wyizolować ją w postaci krystalicznej. Odwrotny rezultat otrzymano dla 2’-C-metylocytydyny (61), ponieważ w wyniku częściowego piwaloilowania uzyskano jedynie 4-N,3’,5’-O,O-tripiwaloilo-2’-metylocytydynę (88).
Analogicznie do prac na temat częściowego acylowania, w zespole K. Ogilviego[131,132,133] wykazano, że prowadzone w normalnych warunkach reakcje częściowego sililowania prowadzą do mieszaniny izomerów 2’,5’- oraz 3’,5’- blokowanych w niemal równych ilościach. Izomery te można było rozdzielić metodami chromatograficznymi i wyizolować w postaci czystej. Jednak po dodaniu katalizatora w obecności pirydyny udawało się uzyskiwać bardzo duże nadmiary izomeru blokowanego w pozycjach 2’ i 5’ (Tabela 2.2.2). W roli katalizatora wykorzystywane były AgNO3, AgClO4
i (nBu)4NNO3. Badania były prowadzone szeroko, na wszystkich naturalnych rybonukleozydach, również na rybonukleozydach uprzednio blokowanych grupą dimetoksytrytylową w pozycji 5’ i blokowaną grupą egzoaminową. We wszystkich przypadkach, prócz 2-N-benzoiloguanozyny, wyniki były bardzo dobre. Co więcej, gdy do prowadzonych reakcji dodano kolejny reagent – 1,4-diazabicyklo[2.2.2]-oktan (DABCO) lub N-tlenek 4-nitropirydynowy uzyskiwano odwrotną regioselektywność.
Rysunek 2.2.5. Synteza puromycyny.[134]
W ten sposób otrzymywano duże nadmiary izomerów blokowanych w pozycjach 3’ i 5’. Najlepsze wyniki zamieszczono w Tabeli 2.2.2. Podejście to jest często wykorzystywane, czego przykładem może być synteza puromycyny (79) i jej analogów opisana przez N.Q. Nguyen-Trung et al. w 2003 roku (Rysunek 2.2.5).[134] W syntezie tej autorzy przeprowadzili częściowe sililowanie adenozyny (89) z TBDMSCl (chlorek
t-butylodimetylosililu) według procedury Ogilviego. Po wyizolowaniu produktów disililowania – 2’,5’-di-O-(t-butylodimetylosililo)-β-D-adenozynę (90) z wydajnością 60% oraz 3’,5’-di-O-(t-butylodimetylosililo)-β-D-adenozynę (91) z wydajnością 34%, związek 91 poddano izomeryzacji z 2,5% (v/v) roztworem Et3N w MeOH, co pozwoliło podnieść wydajność względem 90 do 85%. Następnie 90 poddano utlenieniu CrO3 i redukcji NaBH4 otrzymując 9-(2’,5’-di-O-(t-butylodimetylosililo)-β-D-ksylofuranozylo)adeninę (92), którą poddano kolejnym etapom syntezy.
Nukleozyd TBDMS-Cl /[mmol] Katalizator /[mmol] /[mmol] Zasada Czas /[h] 2’,5’ /[%] Produkt 3’,5’ /[%] Produkt
5’-DMTr-U 1,3 AgNO3 (1,2) Py (3,7) 1,5 70 15
A 2 AgNO3 (2) Py (5) 1 68 22 CBz* 2,2 AgNO3 (2,2) Py (5) 1 82 13 G 2,2 AgNO3 (2,2) Py (5) 2 60 35 U 2,2 AgNO3 (2,2) DMAP (5) 3 80 15 U 2,2 (nBu)4NNO3 (2,2) Py (5) 1 87 6 U 2,2 AgClO4 (2,2) Py (5) 2 90 7 5’-TBDMSi-U 1,3 AgClO4 (1,2) Py (5) 2 90 6 A 2,2 AgClO4 (2,2) Py (5) 2 87 8 5’-TBDMSi-A 1,3 AgClO4 (1,2) Py (3) 2 80 10 CBz* 2,2 AgClO4 (2,2) Py (5) 2 90 5 GBz* 2,5 AgClO4 (2,5) Py (6) 5 55 40 U 2,2 (nBu)4NClO4 (2,2) Py (5) 2 90 5 A 2,2 (nBu)4NClO4 (2,2) Py (5) 2 85 5 CBz* 2,2 (nBu)4NClO4 (2,2) Py (5) 2 93 4 U 2,3 AgClO4 (2,3) DABCO (6) 3 5 90
5’-DMTr-U 1,3 AgClO4 (1,2) DABCO (6) 2 5 91
5’-TBDMSi-U 1,3 AgClO4 (1,2) DABCO (6) 3 5 90
Rysunek 2.2.6. Ditrytylowanie urydyny.[137]
Tabela 2.2.2. Sililowanie rybonukleozydów [Hakimelahi, G.H. et al.].[132]* CBz/GBz – nukleozydy z benzoilowaną grupą egzoaminową; **N-tlenek 4-nitropirydyny.
GBz* 2,6 AgClO4 (2,5) DABCO (6) 6 30 60
A 2,2 AgClO4 (2,2) N-tlenek(2,3) ** 2 5 89
CBz* 2,2 AgClO4 (2,2) N-tlenek (2,3) 2 8 90
GBz* 2,6 AgClO4 (2,5) N-tlenek (2,6) 2,5 - 98
Hakimelahi, G.H. z zespołu K. K. Ogliviego w swej pracy[133] poruszył też temat częściowego dimetoksytrytylowania. Reakcje prowadził również w obecności AgNO3 i pirydyny. Dla urydyny uzyskał duży nadmiar pochodnej blokowanej w pozycjach 2’ i 5’ (80%), co jest ciekawym wynikiem, bo grupy trytylowe są odporne na izomeryzację w czasie rozdziału chromatograficznego i izolacja pożądanego produktu z wolną grupą 3’-OH nie nastręcza trudności. W przypadku pozostałych naturalnych rybonukleozydów nie zaobserwowano regioseleketywności w tych warunkach. Częściowe trytylowanie jest często wykorzystywane w syntezie pochodnych nukleozydów i nie brakuje przykładów w literaturze począwszy od N.C. Yunga i J.J. Foxa z 1961 roku.[135, 136, 137] Dość zaskakujące w tym
kontekście było ostatnie doniesienie literaturowe, że 3’,5’-di-O-trytylourydyna (93, Rysunek 2.2.6.) inhibuje replikację flawiwirusów (wirusa dengi, wirusa żółtej gorączki) z EC50 ~ 1 µM przy niskiej toksyczności.[138]