Podsumowanie i wnioski

W przedstawionej pracy wykonano szereg eksperymentów mających na celu weryfikacje dotychczasowych doniesień literaturowych oraz poszerzenie wiedzy na temat

otrzymywania i wykorzystania struktur anhydrocyklicznych rybonukleozydów.

W poszukiwaniach, prócz eksperymentów laboratoryjnych, wielu prób reakcji chemicznych,

analizy wyników za pomocą metod instrumentalnych, posiłkowano się również metodami obliczeniowymi.

Ustalono, że metoda otrzymywania 2,3’-anhydrocytydyny opublikowana przez Y. Mizuno i T. Sasaki^[153] nie pozwala na skuteczne otrzymanie zakładanego produktu. W wyniku przeprowadzonych eksperymentów stwierdzono, że w warunkach prowadzenia reakcji z silną zasadą jak np. t-butanolan sodu może powstawać pewna ilość produktu anhydrocyklicznego, jednak ulega on substytucji nukleofilowej jonem alkoholanowym. Wskazuje na to wyizolowanie 3’-O-t-butylo-4-N,2’,5’-O,O-tripiwaloilocytydyny (237a). Również inne próby otrzymania mostka 2,3’-anhydrocyklicznego cytydyny z 3’-O-mesylo-4-N,2’,5’-O,O-tripiwaloilocytydyny (86) lub 3’-O-mesylocytydyny (236) w warunkach zasadowych, z 86 w warunkach kwasowych lub w reakcji Mitsunobu 4-N,2’,5’-O,O-tripiwaloilocytydyny (87) nie powiodły się. Oznacza to, że struktury anhydrocykliczne nie nadają się do wprowadzania modyfikacji w pozycji 3’ cytydyny, czyli nie nadają się do funkcjonalizacji układu cis-diolowego mającej na celu otrzymanie pochodnych 3’-modyfikowanych lub 2’,3’-dimodyfikowanych. Dlatego postanowiono prowadzić dalsze badania z wykorzystaniem pochodnych urydyny, w przypadku której wiadomo, że strategia funkcjonalizacji układu cis-diolowego z wykorzystaniem struktur anhydrocyklicznych znajduje zastosowanie. Nie ogranicza to ewentualnej uniwersalności podejścia, ponieważ gotowe pochodne urydyny można znanymi metodami przeprowadzić do pochodnych cytydyny.

W pracach nad pochodnymi urydyny stwierdzono, że reakcja Mitsunobu mieszanin izomerów 2’,5’- oraz 3’,5’-diacylowanych prowadzi jedynie do jednego produktu 2,2’-anhydrocyklicznego. Jest to ciekawy wynik, dlatego poświęcono mu więcej czasu. Przedstawiono możliwy mechanizm tej reakcji oraz posiłkując się metodami obliczeniowymi stwierdzono, że czynnikiem decydującym o obserwowanej tu regioselektywności jest geometria układu. Argumentami za tym stwierdzeniem są: regioselektywność reakcji Mitsunobu, gdy obie grupy hydroksylowe układu cis-diolowego są wolne, regioselektywność reakcji urydyny z węglanem difenylu, wynik analizy rozkładu ładunków cząstkowych na atomach tlenu i węgla pochodnych urydyny oraz obliczone energie stanów przejściowych tworzenia mostków anhydrocyklicznych w reakcji urydyny z węglanem difenylu.

W dalszym toku prac określono przydatność w syntezie otrzymanej 3’,5’-di-O-piwaloilo-2,2’-anhydrourydyny (241a) poprzez porównanie z reaktywnością nieblokowanej

2,2’-anhydrourydny (95). W wyniku przeprowadzonych reakcji stwierdzono, że 241a nie posiada żadnej szczególnej przewagi nad 95 w reakcjach substytucji nukleofilowej, ale może stanowić substrat do otrzymania 1-(3’,5’-di-O-piwaloilo-β-D-arabinofuranozylo)uracylu (254). Ustalono też, że związek 241a można otrzymać z lepszą wydajnością na drodze piwaloilowania 2,2’-anhydrourydny (95) i poprzez analogię lepszym sposobem otrzymywania 3’,5’-di-O-benzoilo-2,2’-anhydrourydyny (241b) od reakcji Mitsunobu jest benzoilowanie 95. Zbadano również możliwość wykorzystania częściowego piwaloilowania urydyny do

otrzymywania dipiwaloilowanej pochodnej 2,3’-anhydrocyklicznej (255).

W przeprowadzonej reakcji wykonano metodą one-pot piwaloilowanie a następnie mesylowanie. Tak otrzymaną mieszaninę pochodnych mesylowych poddano cyklizacji i po wykorzystaniu metod chromatograficznych otrzymano mieszaninę dwóch izomerów anhydrocyklicznych w stosunku 100:2 z przewagą 255. Zaprezentowana metoda może stanowić alternatywę otrzymywania mostka 2,3’-anhydrocyklicznego urydyny względem syntezy przedstawionej przez Yunga i Foxa.^[135]

W trakcie poszukiwań nowych reaktywności struktur anhydrocyklicznych stwierdzono, że butylolit nie ulega substytucji w oczekiwanym miejscu części cukrowej pochodnych 2,2’-anhydrourydyny (241a, 259 - 5’-O-trytylo-2,2’-anhydrourydna), a jedynym produktem podstawienia, jaki uzyskano w danych warunkach, jest 4-n-butylo-1-(3’,5’-di-O-piwaloilo-β-D-arabinofuranozylo)-2-pirymidynon (260). Wynik ten sugeruje niepełną aromatyzację pierścienia uracylu. Po substytucji następuje dehydratacja pozycji 4, czego siłą napędową jest pełna aromatyzacja układu. Strukturę potwierdzono analizą widm 1D i 2D NMR. Podobny wynik opublikowano wcześniej^[224] w przypadku innego związku metaloorganicznego, czyli jodku metylomagnezowego. Również H-fosfonian dietylu nie ulega substytucji do pochodnych 241a i 259. W warunkach przeprowadzonych reakcji nie zaobserwowano żadnej substytucji, co daje do zrozumienia, że struktury posiadające mostek anhydrocykliczny między częścią zasadową a resztą cukrową są mniej elektrofilowe i tym samym mniej podatne na atak nukleofilowy niż pochodne epoksydowe (2’,3’-anhydrocykliczne) lub 2’- i 3’-karbonylowe.

Badaniom poddano również reaktywność mostka 2,3’-anhydrocyklicznego pochodnych urydyny: 2’-O-metylo-5’-O-trytylo-2,3’-anhydrourydyny (264), 2’-azydo-5’-O-trytylo-2,3’-anhydrourydyny (267) oraz 2,3’-anhydrourydyny (106). Przeprowadzone eksperymenty potwierdziły, że reaktywność (podatność na atak nukleofilowy) mostka 2,3’-anhydrocyklicznego urydyny jest dużo mniejsza niż mostka 2,2’-2,3’-anhydrocyklicznego

i w większości przypadków oczekiwane reakcje nie zachodziły. Co więcej, gdy grupy 5’- i 3’-hydroksylowe są wolne, można zaobserwować zachodzenie reakcji, jednak są to reakcje biegnące poprzez struktury pośrednie 2,5’-anhydrocykliczne, 2’,3’-anhydrocykliczne (epoksydowe) oraz 2,2’-anhydrocykliczne będące produktami wewnątrzcząsteczkowych przegrupowań. Jedynie w reakcji nieblokowanej pochodnej 106 z p-tiokrezolem w obecności ftalimidku potasu zaobserwowano powstawanie produktu podstawienia w pozycji 3’. Przeprowadzone analizy wskazują, że podstawienie nastąpiło bezpośrednio do mostka 2,3’-anhydrocyklicznego, a uzyskany produkt ma konfigurację rybozy. Rezultat tej reakcji można tłumaczyć tym, że jony tiolanowe należą do jednych z najlepszych nukleofili. Do tej pory, o ile wiadomo autorowi, nie publikowano przykładu bezpośredniej substytucji do mostka 2,3’-anhydrocykliznego prócz sytuacji, gdy w pozycji 2’ był silnie elektronoakceptorowy podstawnik fluorkowy, który poprzez efekt indukcyjny zwiększał elektrofilowość pozycji 3’ mostka anhydrocyklicznego.

Aby nie ograniczać się wyłącznie do pochodnych pirymidynowych, zbadano również reaktywność struktury 8,2’-S-anhydroadenozyny (168). W przeciwieństwie do 8,2’-O-anhydroadenozyny (150) reaktywność 168 jest bardzo ograniczona. Związek 150 ulega substytucjom w pozycji 2’ wobec nukleofili takich jak anion benzoesanowy, anion azydkowy, anion tiolanowy. Ulega również substytucjom w pozycji 8, o czym było wspominane w części literaturowej. Związek 168 poddano reakcjom z kilkoma wybranymi nukleofilami, poddano również hydrolizie w warunkach kwasowych i zasadowych stosując skuteczne wobec pochodnych 2,2’-anhydrourydyny warunki. Znów, jedynie reakcja z p-tiokrezolem w obecności ftalimidku sodu pozwoliła uzyskać oczekiwany produkt. W innych przypadkach żadna reakcja nie zachodziła, nawet reakcja przegrupowania wewnątrzcząsteczkowego. Z mieszaniny reakcyjnej izolowano substrat z mostkiem 8,2’-S-anhydrocyklicznym, co może wskazywać, że z możliwych struktur anhydrocyklicznych ta właśnie jest najkorzystniejsza termodynamicznie. Z tych obserwacji wynika jeden zasadniczy wniosek, że w strategii funkconalizacji układu cis-diolowego z wykorzystaniem struktur anhydrocyklicznych struktura 8,2’-S-anhydroadenozyny (168) jest niewłaściwa, a jedyną racjonalną możliwością w tym podejściu jest wykorzystanie 8,2’-O-anhydroadenozyny (150).

W ostatniej części pracy opisano syntezę dwóch serii 2’,3’-dimodyfikowanych pochodnych urydyny wykorzystujące znane możliwości syntetyczne. W syntezie serii pochodnych 1-(β-D-ksylofuranozylo)uracylu rozwinięto podejście zaprezentowane w pracy Q. Dai et al.^[151] z zespołu J.A. Piccirilliego o pochodne 2’-azydkową, 2’-[1,2,3]triazolową,

2’-O-metylową i 2’-S-tiotolilową do etapu z grupą 3’-hydroksylową skierowaną nad płaszczyznę pierścienia. Reakcje wykonano z wydzieleniem produktów poszczególnych etapów w celu pełnego monitorowania przebiegu syntezy, jednak jak wykazano dla pochodnej 2’-azydkowej metoda one-pot jest bardziej wydajna, szybsza i dużo mniej pracochłonna. Zaprezentowano również kontynuację syntezy do produktów 2’,3’-dipodstawionych o konfiguracji rybozy dla pochodnej 2’-O-metylowej. Synteza serii pochodnych 3’-deoksyurydny cechuje się mniejszą innowacyjnością, jednak przygotowanie tej serii, tak jak i serii ksylofuranozylowej, umożliwia ciekawą analizę wpływu wielkości i charakteru chemicznego podstawnika w pozycji 2’ na aktywność przeciwwirusową, aktywność przeciwnowotworową i cytotoksyczność pochodnych nukleozydowych. Część wyników badań biologicznych już otrzymano i na ich podstawie można wyciągać pierwsze wnioski. W szeregu rosnącej objętości podstawnika serii 3’-deoksy można było wyróżnić dwa

momenty. Pierwszym momentem był zanik aktywności przeciw glejakowi

wielopostaciowemu między pochodną 2’,3’-dideoksydidehydro a pochodną 2’-jodkową. Pochodna 2’-O-metylowa była również aktywna przeciw glejakowi. Aktywności za to nie wykazała pochodna 2’-azydkowa, której objętość była podobna do objętości pochodnej jodkowej i objętości pochodnej 2’-O-metylowej. Różnice objętościowe wynikają głównie z rodzaju podstawnika. W tym przypadku spadek aktywności nie zależał od wielkości podstawnika. Drugim momentem był zanik cytotoksyczności między pochodną 2’-azydkową a pochodną 2’-triazolową. Jest to szczególnie ciekawa obserwacja, ponieważ pochodne te nie różnią się szczególnie żadnym z podanych parametrów prócz objętości podstawnika. Z dalszymi wnioskami należy się wstrzymać do uzyskania wszystkich wyników badań biologicznych.

Przeprowadzone eksperymenty dokowania molekularnego wskazują dobre energie wiązania ligandów w miejscach aktywnych odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1 i polimerazy mitochondrialnej γ. Jednak, gdy spojrzy się na usytuowanie w kieszeni względem trifosforanu AZT i trifosforanu ddC można zaobserwować, że obecność podstawnika w pozycji 2’ powoduje pogorszenie dopasowania ze względu na usytuowanie reszty aminokwasowej w bliskiej odległości od atomu C-2’ ligandu w położeniu optymalnym (położenie AZT). Można zauważyć że wzrost wielkości podstawnika w pozycji 2’ według prostej miary jaką jest jego objętość najczęściej zwiększa przesunięcie ligandu względem struktury wzorcowej, jednak nie musi mieć to jednoznacznego efektu w obniżeniu aktywności ze względu na powstawanie nowych wiązań wodorowych podstawników posiadających

akceptory oraz donory wiązań wodorowych. Niektóre ligandy posiadały dobre mody wiązania do enzymów pomimo obecnych podstawników, co potwierdza słuszność przeprowadzonych syntez oraz ukierunkowania badań w stronę określenia zmian aktywności przeciw wirusowi HIV-1. Należy jednak również rozważyć poszerzenie w przyszłości badań biologicznych oraz eksperymentów dokowania molekularnego o wirusy posiadające polimerazę RNA zależną od RNA (RdRp) (np. HCV), która powinna mieć większą tolerancję substratową dla pochodnych rybonukleozydów posiadających modyfikacje w pozycjach 2’ i 3’.

Poruszony w pracy temat jest szeroki i przedstawione opracowanie nie wyczerpuje go. Można zaproponować wiele kolejnych eksperymentów do każdego rozdziału tej pracy. Zwłaszcza ciekawe byłyby próby przetestowania podejścia D. McGee^[152] do pochodnych 2,3’-anhydrourydyny i 8,2’-O-anhydroadenozyny, synteza mostka 8,3’-O-anhydro-cyklicznego adenozyny oraz weryfikacja publikacji M. Hiraty,^[198] co będzie musiało być tematem innych opracowań.