Transformujące czynniki wzrostowe (TGFs, ang. transforming growth factors) to białka odkryte w 1978 roku przez J.E. DeLarco i G.J. Todaro w płynie hodowlanym fi-broblastów mysich, transformowanych wirusem Moloneya (Mo-RSV). Nazwa została zaproponowana ze względu na zdolność tych czynników do odwracalnej, fenotypowej transformacji niektórych rodzajów komórek prawidłowych, głównie pochodzenia me-zenchymalnego. Komórki te poddane działaniu transformujących czynników wzro-stowych wykazywały in vitro: utratę zahamowania kontaktowego, zmianę morfologii oraz zdolność do wzrostu niezależnego od przyczepienia do podłoża, charakterystycz-ne dla większości komórek nowotworowych. Białka te są syntetyzowacharakterystycz-ne przez wiele różnych typów komórek zwierzęcych i ludzkich, zarówno transformowanych, jak i prawidłowych. Wyróżnia się obecnie dwa podstawowe typy tych czynników: TGFα i TGFβ. Typ α jest homologiem EGF i działa przez receptory EGF. Typ β jest różny strukturalnie od EGF i nie działa przez receptor tego czynnika, ale wymaga obecności EGF do pełnej stymulacji wzrostu niezależnego od przyczepienia do podłoża.
Superrodzina TGFβ to duża, licząca dziś ponad 40 różnych polipeptydów grupa białek o aktywności plejotropowej. Do superrodziny tej zalicza się oprócz TGFβs także aktywiny/inhibiny (Act/Inh, ang. Activin/Inhibin), białka morfogenetyczne kości (BMPs, ang. bone morphogenic proteins), czynniki wzrostu i różnicowania (GDFs, ang. growth and differentiation factors), inhibitor Mulleriana (AMH, ang.
anti-mullerian hormone), myostatynę i inne. Transformujący czynnik wzrostowy typu β (TGFβ) to polipeptyd o niespotykanej, wielokierunkowej aktywności bio-logicznej, zaliczany do grupy hormonów plejotropowych. Dotychczas ustalono strukturę pięciu czynników zaliczanych do rodziny TGFβ. Ssacze TGFβ (TGFβ1–3) są białkami o m.cz. 25 kDa, zbudowanymi z dwóch identycznych podjednostek, połączonych mostkami disiarczkowymi. Wszystkie TGFβ wykazują około 70% po-dobieństwa w sekwencji aminokwasowej i zbliżoną aktywność biologiczną. TGFβ są syntetyzowane w formie nieaktywnej cząsteczki prekursorowej zbudowanej z 391 reszt aminokwasowych. Najbardziej kompletne informacje o syntezie, właściwo-ściach i aktywności biologicznej mamy o TGFβ1. Podobnie jak w innych białkach syntetyzowanych na rybosomach związanych z retikulum endoplazmatycznym pep-tyd sygnałowy pre-pro-TGFβ1 (29 reszt aminokwasowych) jest odcinany podczas przejścia prekursora przez błony szorstkiej siateczki endoplazmatycznej. Inne po-translacyjne modyfikacje, jak dimeryzacja, glikozylacja i tworzenie skomplikowanej formy nieaktywnej (LAP-TGFβ), mają miejsce przed sekrecją peptydu w aparacie Golgiego. Magazynem TGFβ1 u ssaków, podobnie jak dla płytkowego czynnika wzrostowego (PDGF), czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) i epidermalnego czyn-nika wzrostowego (EGF) są płytki krwi.
Większość danych dotyczących syntezy, aktywacji i sygnalizacji TGFβ1 jest oparta na wynikach badań in vitro. Dojrzały, aktywny dimer TGFβ1 (m.cz. 25 kDa) jest w znakomitej większości przypadków niekowalencyjnie związany z pozostałą częścią prekursora (LAP, ang. latency associated peptide), określanego zazwyczaj jako mały kompleks latentny (SLC, ang. small latent complex), a całość kowalen-cyjnie związana ze swoistym białkiem nośnikowym (LTBP, ang. latency associated peptide binding protein) i nazywana dużym kompleksem latentnym (LLC, ang.
large latent complex). LTBP stabilizuje czynnik wzrostowy, ułatwia jego sekre-cję i pomaga w oddziaływaniu z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
Przyjmuje się, że ECM jest magazynem zewnątrzkomórkowym TGFβ1, skąd może być szybko lokalnie uwalniany. Losy wydzielanego kompleksu są różne w zależ-ności od zapotrzebowania organizmu na ten czynnik wzrostowy. Po uwolnieniu z nieaktywnego kompleksu może on wywierać swój skutek biologiczny poprzez wiązanie do swoistych receptorów w błonach komórek docelowych (RI–RIII).
Lokalny nadmiar aktywnego TGFβ może być neutralizowany przez szereg białek wiążących, jak: β-glikan, będący fragmentem zewnątrzkomórkowym receptora III lub kompleksowany przez inny proteoglikan – dekorynę. Białkiem, które usuwa TGFβ z krążenia, jest α2-makroglobulina. Kompleks TGFβ–α2M kierowany jest do komórek mających receptory dla α2-makroglobuliny (makrofagi, hepatocyty) i tam degradowany enzymatycznie. System syntezy, sekrecji i neutralizacji TGFβ przedstawia rysunek 3.1.
1. Tworzenie nieaktywnych kompleksów 2. Sekrecja
3. Magazynowanie w macierzy zewnątrzkomórkowej 4. Uwalnianie aktywnego TGF
5 i 6. Tworzenie nieaktywnych kompleksów surowiczych 7. Tworzenie kompleksów usuwanych z krążenia 8. Aktywacja receptorów
kompleks TGF – G
Rys. 3.1. Synteza, sekrecja i aktywacja transformującego czynnika wzrostowego typu β (TGFβ).
LAP – peptyd zapewniający latencję TGFβ, LTBP – peptyd wiążący kompleks latentny, βG – β-glikan, α2M – α2-makroglobulina, I, II, III – receptory błonowe TGFβ
W odróżnieniu od TGFβ (i GDF8) pozostałe białka należące do superrodziny TGFβ są wydzielane w postaci aktywnych dimerów, wiązanych (blokowanych) lo-kalnie przez różnych antagonistów (m.in. przez folistatynę i białka do niej podobne oraz sklerozynę). Niezwykle skomplikowany i niejednoznaczny jest także proces ak-tywacji (uwalniania z nieaktywnego kompleksu LAP–TGFβ) tego czynnika, opisany w pkt. 3.1.
3.1. Uwalnianie aktywnego TGFβ z kompleksu latentnego
Z uwagi na wszechstronność działania i powszechność występowania TGFβs jest zrozumiałe, że ich aktywność musi być regulowana bardzo precyzyjnie. To prawdo-podobnie jest przyczyną rzadko spotykanej, wielostopniowej regulacji aktywności biologicznej na poziomie syntezy, sekrecji, uwalniania z nieaktywnego kompleksu oraz wiązania TGFβs ze swoistymi białkami nośnikowymi (Rys. 3.1). Uwalnianie biologicznie aktywnego TGFβ wymaga dysocjacji tego czynnika wzrostowego z nie-aktywnego kompleksu. Proces ten określany jest mianem aktywacji TGFβ. Propono-wane są różne mechanizmy aktywacji TGFβ z małego (SLC), jak i z dużego (LLC) kompleksu latentnego, zarówno na drodze proteolizy, jak i zmian konformacyjnych.
TGF
LAP
ECM LTBP
LTBP TGF
LAP
integryna v
LAPTGF
LTBP
a
ECM
LAPTGF
LTBP
b
MMPs
Cytoszkielet aktynowy Cytoszkielet
aktynowy
integryny v (3,6)
Cytoszkielet
aktynowy Cytoszkielet
aktynowy
Rys. 3.2. Bezpośredni (a) i pośredni (b) mechanizm uwalniania aktywnego TGFβ z latentnego kompleksu LTBP–LAP–TGFβ. Objaśnienia w tekście
Proteolityczne uwalnianie TGFβ z nieaktywnych kompleksów może być realizo-wane przez: niektóre metaloproteinazy (MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13), pla-zminę, elastynę i aktywatory plazminogenu (typu urokinazy i tkankowego), a także przez glikozydazy usuwające reszty cukrowe z LAP.
Uważa się, że aktywacja (uwalnianie) TGFβ1 zachodzi także na drodze anga-żującej integryny, ponieważ latentny kompleks TGFβ jest wiązany przez wszystkie integryny αv (αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 i αvβ8) oraz α5β1, α8β1 i integrynę płyt-kową αIIbβ3. Integryny (rozdział 2.2.4 w cz. I) są heterodimerami podjednostek α i β, a liczba tworzonych przez nie izoform receptorów wynosi 24. Receptory te mają zdolność wiązania różnych ligandów, w tym czynników wzrostowych (VEGF, PDGF, IGFs), ale najbardziej skomplikowane jest ich oddziaływanie z TGFβ. Przy-najmniej dwa różne mechanizmy mogą być zaangażowane w ten proces: bezpośredni i pośredni (Rys. 3.2).
Mechanizm bezpośredni to proces niezależny od działania proteaz, polegający na tym, że wiązanie integryn do kompleksu TGFβ powoduje zmiany konformacyjne w latentnym kompleksie, prowadzące do uwolnienia aktywnego TGFβ. Pośredni to mechanizm, w którym integryny działają jako białka dokujące (rozdział 3.4 w cz. I) dla kompleksu TGFβ i niektórych proteaz (trombina, MMP-4) powodujących hy-drolityczne rozbicie kompleksu LAP. Nie można także wykluczyć aktywacji TGFβ1 przez reaktywne formy tlenu (ROS), ponieważ TGFβ1 stymuluje aktywność oksyda-zy NADPH i produkcję ROS, które z kolei aktywowałyby TGFβ. Proces ten mógł-by reprezentować dodatnie sprzężenie zwrotne w aktywacji TGFβ1 przez komórki apoptotyczne.
3.2. Mechanizm aktywacji receptorów TGFβ i sygnalizacja z udziałem białek Smad
Dotychczas opisano dwa typy receptorów o aktywności kinazy serynowo-treonino-wej, charakterystyczne dla większości (ale nie dla wszystkich) białek zaliczanych do superrodziny TGFβs. Obecnie znanych jest siedem receptorów typu I (ALK 1–7, ang. activin-like kinase) i pięć receptorów typu II (TGFβR-II, ActR-II, ActR-IIB, BMPR-II, MISR-II). Receptory swoiste dla TGFβ: TGFβ1R-I (ALK-5) i TGFβR-II są relatywnie małymi glikoproteinami o m.cz. odpowiednio 75 i 53 kDa (rozdział 2.2.3 w cz. I). Receptory te zbudowane są z krótkiej części akceptorowej, zawie-rającej domeny bogate w cysteinę, pojedynczej części transbłonowej i części we-wnątrzkomórkowej, zawierającej dużą domenę kinazową. W części efektorowej receptorów TGFβR-I (w odróżnieniu od receptorów TGFβR-II) zlokalizowana jest pomiędzy błoną komórkową a domeną kinazową 30-aminokwasowa domena GS (zawiera sekwencję GSGS), kluczowa dla regulacji aktywności TGFβR-I. W for-mie nieaktywnej domena ta jest związana z immunofilinami (FKBP12, FKBP12.6).
Części C-końcowe obu typów receptorów, zlokalizowane poza domeną katalityczną, zbudowane są z 24 (TGFβR-II) i 5 (TGFβR-I) reszt aminokwasowych. Opisano także receptor TGFβR- III o charakterze wysokocząsteczkowego proteoglikanu i endoglinę (glikoproteinę, jak początkowo niesłusznie sądzono, specyficzną dla