Odpowiedź komórki na sygnały zewnątrzkomórkowe, jak i przekaz sygnałów we-wnątrzkomórkowych są realizowane i koordynowane przez swoiste oddziaływania międzycząsteczkowe, głównie białko–białko, białko–fosfolipid i białko–DNA.
Podstawową rolę w tych oddziaływaniach grają konserwatywne ewolucyjnie regiony białek, określane mianem domen białkowych. Takie moduły białkowe zo-stały wykształcone w procesie ewolucji i służą do rozpoznawania odpowiednich determinant, eksponowanych na ich partnerach molekularnych. Wykorzystanie dopasowania tego typu oddziaływań może pośredniczyć w regulacji różnorodnych procesów biochemicznych i integrować wiele różnych szlaków przekazywania sy-gnału. Obecność kilku domen w jednej cząsteczce białka, jak to zachodzi w białkach
adaptorowych i kotwiczących lub w białkach tworzących rusztowania, pozwalające na równoczesne wiązanie wielu ligandów białkowych (białka dokujące), umoż-liwia funkcjonalną integrację związków uczestniczących w przekazie sygnału zewnątrz- i wewnątrzkomórkowego.
Dzisiaj znamy wiele domen białkowych odpowiedzialnych za interakcje międzycząsteczkowe homo-i heterologiczne, zbudowanych z 40–200 reszt ami-nokwasowych. Domeny te można podzielić na takie, które rozpoznają krótkie 4–10-aminokwasowe sekwencje (SH2, PTB, SH3, WW, EH, EVH, PDZ) lub są odpowiedzialne za specyficzne oddziaływania międzydomenowe (PDZ, DD, DED, TRAF). W niektórych przypadkach wiązanie określonej domeny do takich sekwen-cji wymaga wcześniejszej ich fosforylasekwen-cji na resztach tyrozyny, seryny lub treo-niny. Znane są także domeny białkowe wiążące swoiście substraty niebiałkowe.
Przykładem są domeny PH, FYVE i PX wiążące fosfolipidy (głównie fosfatydylo-inozytydy), odpowiedzialne za przybłonową lokalizację wielu białek i/lub łączenie poszczególnych etapów sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Inną grupę stanowią domeny pośredniczące w interakcji białko–DNA, takie jak motywy: palca cynko-wego, zamka leucynowego (może także uczestniczyć w dimeryzacji cząsteczek białkowych) czy helisa–skręt–helisa.
Znanych jest wiele domen białkowych odpowiedzialnych za rozpoznanie i wią-zanie do krótkich sekwencji aminokwasowych innych białek. Historycznie pierwszą taką domeną białkową, której przypisano udział w interakcji białko–białko, była domena SH2 (ang. Src homology 2), opisana pod koniec lat 80. przez Tony'ego Pawsona, jako homologiczna sekwencja występująca w kinazach tyrozynowych niereceptorowych. Domeny SH2 występują w wielu białkach cytoplazmatycznych i jądrowych, mają zdolność swoistego wiązania ufosforylowanej tyrozyny, a przez to zdolność do wiązania różnych fosfoprotein. Powinowactwo domen SH2 do peptydów zawierających fosfotyrozynę (pY) jest około 1000 razy większe niż do tych samych peptydów defosforylowanych. Obecność białek mających domeny SH2 stwierdzono we wszystkich organizmach eukariotycznych poza drożdżami.
Domeny te zbudowane są z około 100 reszt aminokwasowych, z centralnie poło-żonym motywem zbudowanym z dwóch antyrównoległych β-struktur oraz dwóch N- i C-końcowych fragmentów α-helikalianych, leżących w swoim bezpośrednim sąsiedztwie, powodując, że konformacja przestrzenna domeny przybiera strukturę globularną. Domeny SH2 wiążą ufosforylowane białka, a o swoistości wiązania de-cydują sekwencje (3–5 reszt aminokwasowych), zlokalizowane bezpośrednio za fos-fotyrozyną, w kierunku C-końca łańcucha peptydowego. Przykładowo, sekwencje wiążące domeny SH2: fosfolipazy C to pYIPLPD, kinazy Src – pYYEEI, a białka adaptorowego Grb2 – pYVNV. Na podstawie porównania sekwencji aminokwaso-wej ponad 20 różnych domen SH2 ustalono, że motyw wiążący fosfoproteiny zbu-dowany jest z -GNGpYXXXSPLLL-, gdzie X oznacza dowolny aminokwas poza cysteiną i tryptofanem. Podstawienie jednego z aminokwasów sekwencji wiążącej domenę SH2 innym może zmieniać charakter sygnału przekazywanego przez białka uczestniczące w tym procesie, a w konsekwencji patologiczną odpowiedź komórki.
Domeny PTB (ang. phosphotyrosine-binding) zostały opisane początkowo jako domeny funkcjonalnie homologiczne z domenami SH2, stąd ich nazwa – domeny wiążące fosfotyrozynę. Cechą charakterystyczną, odróżniającą domeny PTB od SH2, jest sposób rozpoznawania białek docelowych. Odmiennie od domen SH2 domeny PTB rozpoznają do pięciu reszt aminokwasowych, poprzedzających fosfotyrozynę, licząc od N-końca peptydu. Obecnie wiadomo, że tylko niektóre z białek zawiera-jących domeny PTB (m.in. białka adaptorowe: Shc i IRS) wiążą białka docelowe w sposób zależny od ich fosforylacji.
Ze względu na podobieństwo strukturalne niektórzy autorzy zaliczają domeny PTB i PH do jednej superrodziny domen PH/PTB (zob. poniżej). Domeny PTB w tym układzie stanowią mniejszość (około 60 białek człowieka). Przyjmuje się, że rozpoznają sekwencję -NPX(pY/Y/F)- zlokalizowaną zazwyczaj w rejonie przy-błonowym białek transbłonowych. Domena ta nie wykazuje preferencji do fosfo-tyrozyny w wielu białkach. Przykładowo, domena PTB receptora IL-4 wiąże się z większą sekwencją -GNPApYRS-, a domena PTB białka ARH wiąże sekwencję zawierającą motyw -IFDNPVYQKTT-. Ostatnio udowodniono, że przynajmniej niektóre domeny PTB wiążą fosfoinozytydy, np. domena PTB białka adaptorowego Shc wiąże sekwencję -HIIENPQpYFSDA- receptora neurotrofiny oraz fosfatydy-loinozytolo(4,5)-difosforan (PtdIns(4,5)P2) i fosfatydyloinozytolo(4)monofosforan (PtdIns(4)P).
Domeny SH3 to konserwatywne ewolucyjnie sekwencje aminokwasowe zbu-dowane z 50–75 reszt aminokwasowych, wykazujące zdolność wiązania białek za-wierających charakterystyczne, krótkie sekwencje aminokwasowe, bogate w pro-linę i aminokwasy hydrofobowe. Typowym motywem takich sekwencji jest układ -P-X-X-P-, flankowany innymi aminokwasami, głównie hydrofobowymi, tworzą-cy lewoskrętną helisę typu II. W rzeczywistości domeny SH3 rozpoznają i wiążą wszystkie aminokwasy, w których azot α-aminowy jest podstawiony amidowo, lecz jedynym takim aminokwasem białkowym jest prolina. Podstawową rolą do-men SH3 jest tworzenie (często w kooperacji z innymi dodo-menami) funkcjonalnych, oligomerycznych kompleksów białkowych, w określonych przedziałach komór-kowych. Białka mogą posiadać wiele domen SH3, potencjalnie umożliwiających wiązanie wielu ligandów. Fosforylacja seryny w domenach SH3 (i PDZ) powoduje odłączenie białek sygnałowych, w przeciwieństwie do autofosforylacji receptorów o aktywności kinaz tyrozynowych, która promuje przyłączanie ich fosfotyrozyn do domen SH2 innych białek sygnałowych. Białka z domenami SH3 są składnikami wszystkich organizmów eukariotycznych.
Domeny WW to 35–40-aminokwasowe sekwencje zawierające dwie reszty tryptofanowe (stąd nazwa WW) rozdzielone inercją 20–22 reszt aminokwasowych.
Rozpoznają sekwencje kilkuaminokwasowe bogate w prolinę i/lub fosfoserynę /fos-fotreoninę. Wyróżnia się cztery grupy (klasy) domen WW: I (PPXY), II (PPLP), III (oligo-P[R/K]), IV (XXX[pS/pT]P). Występują w białkach wszystkich organi-zmów eukariotycznych.
SH2 (ang. Src homology 2), homologiczna do regionu 2 Src, zbudowana z około 100 aa
Występowanie: wszystkie organizmy eukariotyczne oprócz drożdży Wiązane sekwencje: 3–5 reszt aminokwasowych po fosfotyrozynie
PTB (ang. phosphotyrosine-binding), wiążąca fosfotyrozynę, zbudowana z około 160 aa
Występowanie: wszystkie organizmy eukariotyczne oprócz drożdży Wiązane sekwencje: do 5 reszt aminokwasowych przed fosfotyrozyną SH3 (ang. Src homology 3), homologiczna do regionu 3 Src, zbudowana z około 60 aa
Występowanie: wszystkie organizmy eukariotyczne
Wiązane sekwencje: kilkuaminokwasowe, bogate w prolinę (typowa PXXP) flankowane aminokwasami hydrofobowymi, dzielone na dwie klasy I i II WW (dwie reszty tryptofanowe W), zbudowana z około 35 aa
Występowanie: wszystkie organizmy eukariotyczne
Wiązane sekwencje: oligoprolinowe i/lub zawierające fosfoserynę bądź fos-fotreoninę, dzielone na cztery klasy: I (PPXY), II (PPLP), III (oligo-P[R/K]), IV (XXX[pS/pT]P)
Do domen wiążących motywy prolinowe należą także domeny EH rozpoznające krótkie sekwencje -Asn-Pro-Phe- i domeny EVH1, wiążące sekwencje kilkuproli-nowe. Przykładowo, domena EVH1 białka Akt rozpoznaje i wiąże sekwencje amino-kwasowe (E/D)FPPPPX(D/E). Domeny tego typu kompleksują białka cytoszkieletu, takie jak zyksyna i winkulina.
Jak już wspomniano, domeny WW wiążą także białka zawierające fosfoserynę lub fosfotreoninę, a liczba tego typu domen jest prawdopodobnie znacznie większa.
Do motywów wiążących fosfoserynę i fosfotreoninę należą m.in. zbudowane z około 75 aminokwasów domeny FHA (ang. Forkhead-associated), występujące głównie w kinazach i fosfatazach białkowych oraz w niektórych czynnikach transkrypcyjnych.
Charakterystyczną cechą domen PDZ (ang. postsynaptic density protein, disc-large, zo-1) jest rozpoznawanie krótkich sekwencji aminokwasowych zawierających serynę lub treoninę, usytuowanych w pozycji 2–4, licząc od C-końca łańcucha peptydowe-go wiązanepeptydowe-go białka. Przykładowo, białka wielu kanałów jonowych mają sekwencję -E-(S/T)-D-V. Oddziaływanie tej sekwencji z domeną PDZ innych białek może być regulowane na drodze fosforylacji, ponieważ aminokwasem w pozycji 2 jest hydro-ksyaminokwas. Inną właściwością domen PDZ jest zdolność do wzajemnej asocjacji, co pozwala zaliczyć te domeny także do grupy domen rozpoznających domeny. Znane są białka mające kilka (do 7) domen PDZ, co ma określone konsekwencje funkcjonalne.
Po pierwsze, pozwala na homotropowe oddziaływania pomiędzy domenami PDZ jed-nego białka, jak i heterotropowe pomiędzy domenami PDZ różnych białek. Umożliwia to tworzenie funkcjonalnych kompleksów białkowych w określonych przestrzeniach komórki. Po drugie, białka zawierające domeny PDZ mają często także inne domeny wiążące (np. SH3) lub katalityczne (np. fosfatazy tyrozynowej lub syntazy NO), co ma podstawowe znaczenie w przenoszeniu sygnału wewnątrzkomórkowego.
Dlatego interakcja domen PDZ może zarówno koordynować lokalizację subko-mórkową, pośredniczyć w wiązaniu określonych białek do receptorów i kanałów jonowych, uczestniczyć w tworzeniu połączeń z cytoszkieletem, jak i brać udział w sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Funkcjonalną swoistość wybranych domen rozpoznających określone sekwencje aminokwasowe przedstawia rysunek 3.1.
Jedną z najbardziej charakterystycznych i najlepiej poznanych domen wiążących podobne domeny w innych białkach jest superrodzina domen DD (Tabela 6). Naj-wcześniej zostały scharakteryzowane sekwencje zbudowane z około 80 aminokwa-sów i nazywane „domenami śmierci” (DD, ang. death domain). Uzasadnieniem ich nazwy była obserwacja, że obecność tych domen jest konieczna i wystarczająca do przekazania sygnału do apoptozy. Z funkcjonalnego punktu widzenia domeny te są przykładem struktur białkowych odpowiedzialnych za autoasocjację (wzajemną aso-cjację podobnych domen). Podstawową rolą DD jest umożliwienie asocjacji białek mających podobne domeny, uczestniczących w przekazaniu sygnału od receptora do odpowiednich układów efektorowych, głównie białek adaptorowych FADD (ang.
Fas associated death domain), TRADD (ang. TNFR associated death domain) i RIP (ang. receptor interacting protein).
Tabela 6. Superrodzina „domen śmierci”
Nazwa domeny Akronim Liczba
białek* Przykładowe białka
Domena śmierci DD >220 TNFR1, Fas, FADD, MyD88
Efektorowa domena śmierci DED > 40 Kaspazy 8, 10, FADD, FLIPs Domena wiążąca kaspazy CARD >130 Kaspazy 1, 2, 4, 9, 12, APAF1 Domena białka piryny PYD > 60 Białko piryn, NALP-12, ASC
* liczba znanych białek zawierających tę domenę
-pY-X-X-
hy-SH2 PTB SH3 WW
EH
-X-N-P-X-pY- -P-X-X-P-
-P-P-X-Y--N-P-F-
-S/Ar-B-pS-X-P-14-3-3 14-3-3
-X/Ar-B-pS-X-P-Rys. 3.1. Domeny białkowe (SH2, PTB, SH3, WW, EH) wiążące przykładowe krótkie sekwencje aminokwasowe oraz sekwencje wiązane przez białka 14-3-3
Domeny DED (ang. death effector domain), czyli efektorowe domeny śmierci, są podobnie jak domeny DD odpowiedzialne za asocjację białek uczestniczących w przekazie sygnału do apoptozy. Występują w białkach adaptorowych, takich jak FADD. DED są swoistym przykładem domen określanych skrótem CARD (ang.
caspase recriutment domain), które znaleziono w wielu kaspazach (2, 8, 9 i 10).
Rola biologiczna tego typu domen polega na ich udziale w asocjacji białek ada-ptorowych z kaspazami w przekazie sygnału do apoptozy. Superrodzinę białek z domeną śmierci uzupełniają białka zawierające domenę PYD, znalezioną po raz pierwszy w białku pirynie.
Fosfolipidy zbudowane z diacyloglicerolu (DAG) i polarnej głowy: fosfatydy-locholina (PtdChol), fosfatydyloseryna (PtdSer), fosfatydyloetanoloamina (PtdEt), fosfatydyloinozytole (PtdIns) i kwas fosfatydowy (PA) reprezentują większość składników lipidowych błony komórkowej. Fosfoinozytydy (mono- i oligofosfora-ny fosfatydyloinozytoli PtdInsPn) odgrywają istotną rolę w przeniesieniu sygnału wewnątrzkomórkowego, przede wszystkim dlatego, że wiele białek posiada domeny wiążące te lipidy. Głównie, ale nie jedynie, za oddziaływania białko–fosfolipid od-powiadają domeny PH, FYVE i PX.
PH – plecstrin homology (homologiczna do około 100 aa w plekstrynie) Wiązane lipidy: różne fosforany fosfatydyloinozytoli
FYVE – Fab1, YOTB, Vac1, EEA (białka eukariotyczne zawierające pal-ce cynkowe, uczestnicząpal-ce w metabolizmie fosfoinozytydów), zbudowana z około 70 aa
Wiązane lipidy: fosfatydyloinozytolo-3-fosforan (PtdIns(3)P)
PX – phagocyte oxidase NADPH (Phox): podobna do dwóch podjednostek oksydazy NADPH (p40phox i p47phox), zbudowana z około 130 aa
Wiązane lipidy: rozpoznająca głównie PtdIns(3)P, ale także: PtdIns(3,4)P2, Ptdins(3,5)P2, PtdIns(3,4,5)P3
Obecność domeny PH stwierdzono w różnych białkach sygnałowych i nazwano poprzez podobieństwo sekwencji tej domeny z około 100-aminokwasowym rejonem plekstryny, głównego substratu PLC w płytkach krwi. Rodzina domen PH jest duża i liczy u człowieka 288 domen stwierdzonych w 247 białkach. Swoistość wiązania nie jest absolutna. Znane ligandy domeny PH to nie tylko różne fosfoinozytydy, lecz także białka. Ponadto wiąże się słabo i nieswoiście z kwasem fosfatydowym. Wybra-ne ligandy i powinowactwo do nich przedstawia tabela 7.
Wiele białek mających domeny PH zawiera także domeny SH2 i SH3, co umoż-liwia im uczestnictwo w przekazie sygnału od receptorów o aktywności kinaz ty-rozynowych na wewnątrzkomórkowe układy efektorowe. Podobnie domeny FYVE wiążą swoiście fosfoinozytydy i pośredniczą głównie w działaniu kinaz fosfatydy-loinozytoli. W przypadku produktów kinazy 3-fosfoinozytydów (PI3K) domena PH wykazuje większe powinowactwo do PI-3,4-P2 lub PI-3,4,5-P3, a domena FYVE do PI-3-P. W komórkach ssaków fosfatydem występującym w największych ilościach jest PI-3-P, na którym mogą zakotwiczać się białka mające domenę FYVE. Taki
motyw mają także niektóre białka funkcjonalnie związane z wewnętrzną powierzch-nią błony komórkowej, np. białko SARA, uczestniczące w aktywacji czynników transkrypcyjnych Smad (rozdział 3.3).
Tabela 7. Przykładowe ligandy wiązane swoiście przez domenę PH
Białko Wiązany ligand Plekstryna Ins(1,3,4)P3
Grp1 Ins(1,4,5)P3
Ins(1,3,4,5)P4
PDK1 PtdIns(3)P
PtdIns(3,4)P2 PtdIns(3,4,5)P3 PKB/Akt Ins(1,4,5)P3
PtdIns(3,4,5)P3 DAPP1 Ins(1,3,4)P3
Ins(1,3,4,5)P4
Molekularny mechanizm wiązania fosfoinozytydów przez domeny PH i FYVE nie jest do końca jasny. Przyjmuje się, że główną rolę odrywają oddziaływania ujem-nie naładowanych reszt fosforanowych fosfoinozytolu z obdarzonymi dodatnim ła-dunkiem grupami aminowymi, amidowymi i iminowymi aminokwasów zasadowych (Lys, His, Arg) ww. domen białkowych.