Fosforylacja 5'-końca oligonukleotydu

Fosforylacja 5' - końca oligonukleotydu nie jest reakcją modyfikacji, gdyż wprowadze-nie reszty fosforanowej w tę pozycję jest wydłużewprowadze-niem naturalnego szkieletu oligomeru. Jed-nakże, 5' - końcowa grupa fosforynowa czy fosforanowa może być dogodnym substratem do dalszych modyfikacji. Dlatego też ująłem w tej części mojej pracy reakcje fosforylacji jako istotny fragment potencjalnej metody funkcjonalizacji końca 5' - oligonukleotydów.

Jednymi z pierwszych reagentów zastosowanych z powodzeniem do fosforylacji oligo-nukleotydu związanego z podłożem stałym były

N,N-diizopropyloamidofosforyny dialkilowe typu 77⁸⁰. Pro-duktem reakcji fosforynacji był 5'-dialkilofosforyn oligonukleotydu, utleniany następnie do fosforanu. Grupy alkilowe usuwano działaniem: tiofenolanu

(R=Me), amoniaku (R=CE) lub DBU (R=Npe), uzyskując 5'-fosforylowany oligomer.

Przykładem innego czynnika fosforylującego, który prowadził do analogicznego 5'-fos-forylowanego oligonukleotydu jest N,N-diizopropyloamidofosforyn 2-cyjanoetylowo – 2-[2'-(4,4'-dimetoksytrytyloksy)etylosulfonylo]etylowy (78)⁸¹. Obok „aktywnego” ugrupowania amidofosforynowego i ochronnej grupy 2-cyjanoetylowej

zastoso-wano ugrupowanie 2-(2'-hydroksyetylosulfonylo)etylowe. To osta-tnie zawierało grupę dimetoksytrytylową, co umożliwiało moni-torowanie (test barwny) reakcji fosforynacji. Obydwie grupy

fosfo-ranoalkilowe [2-cyjanoetylową i 2-(2'-hydroksyetylosulfonylo)etylową] usuwano w reakcji β-eliminacji w środowisku zasadowym.

W innym podejściu, do fosforylacji oligomeru zastosowano N,N-diizopropyloamidofos-foryn 2-cyjanoetylowo – 2-(trifenylosililo)etylowy (79)⁸². Po utlenieniu i

odblokowaniu roztworem amoniaku, grupa 2-(trifenylosililo)etylowa wciąż pozostawała związana z resztą 5'-fosforanową. Dzięki temu

moż-liwe było łatwe oczyszczenie (za pomocą RP-HPLC) pożądanego produktu od zanieczyszczeń nie niosących tego silnie lipofilowego ugrupowania. Grupę 2-(trifenylosililo)etylową usuwano następnie jonami fluorkowymi, uzyskując 5'-fosforan oligonukleotydu.

N P

OR₁ OR₂

R1 = Me, CE, Npe

R2 = CE, Npe 77 P N(iPr)₂ OCE O S DMTrO O O 78 P N(iPr)₂ OCE O Ph₃Si 79

PRZEGLĄD LITERATUROWY. 3.Modyfikacje 5'-końca oligonukleotydu 35

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Kolejnym amidofosforynem stosowanym do fosforylacji oligonukleotydów jest związek 80⁸³. Otrzymano go z 2,2-bis(hydroksymetylo)malonianu dietylowego poprzez dimetoksytrytylowanie i fosfitylację. Zastosowanie tego amidofosforynu umożliwia dwutorowe wykorzystanie właściwości grupy dimetoksytrytylowej:

kontrolowanie wydajności reakcji fosforylacji dzięki uwalnianiu barwnego kationu dimetoksytrytylowego (metoda „trityl off”) lub wydajne oczyszczanie oligomeru dzięki lipofilowym właściwościom tej

grupy (metoda „trityl on”). To drugie podejście jest możliwe dzięki nieoczekiwanej trwałości estru 2,2-bis(etoksykarbonylo)-3-(4,4'-dimetoksytrytyloksy)propylowego w stężonym roztworze amoniaku. Natomiast po usunięciu grupy dimetoksytrytylowej, ugrupowanie to staje się nietrwałe w warunkach zasadowych i traktowanie oligomeru wodnym roztworem amoniaku lub aminy pozwala na uzyskanie 5'-fosforanu oligonukleotydu (Schemat 9).

+ HCHO + B: O P O -O O EtO O O OEt O H OH ODN EtO O O OEt O P O -O O EtO O O OEt OH ODN O P O -O -O OH ODN SCHEMAT 9

Opisane powyżej podejścia z wykorzystaniem amidofosforynów prowadziły do 5'-fosfo-ranów oligonukleotydów. Lepsze możliwości przyłączania innych reagentów modyfikujących czy grup reporterowych na końcu 5' wydaje się stwarzać ugrupowanie wodorofosforynowe. Może być też ono traktowane jako modyfikacja oligomerów służąca np. do badań aktywności substratowej w reakcjach enzymatycznych.

Najprostsze reagenty służące do otrzymania 5'-wodorofosforynów oligonukleotydów to opisane wcześniej (str. 22) PCl₃ i salicylochlorofosfina⁴⁶. Ze względu na dużą reaktywność stwarzają one jednak zagrożenie modyfikacji zasad azotowych łańcucha oligonukleotydowego.

Bardziej odpowiednia dla selektywnego modyfikowania 5'-końcowej reszty hydroksy-lowej oligonukleotydów jest metoda z użyciem monoestrów H-fosfonianowych 81⁸⁴ lub 82⁸⁵, zawierających podatne na β-eliminację reszty alkilowe.

-O P O H O NO₂ -O P O H OCE 81 82

Związek 81 [H-fosfonian 2-(p-nitrofenylo)etylowy] otrzymano przeprowadzając PCl3 w tris(1,2,4-triazoilo)fosforyn, który poddawano reakcji z 2-(p-nitrofenylo)etanolem. Po hydroli-zie powstałego p-nitrofenylofosforoditriazolidu, produkt 81 oczyszczano na żelu krzemionko-wym. H-Fosfonian 2-cyjanoetylowy 82 otrzymano przez hydrolizę dichlorofosforynu 2-cyja-noetylowego i stosowano bez oczyszczania. Związki powyższe umożliwiają fosfonylację

DMTrO O OEt O O EtO P OCE N(iPr)₂ 80

PRZEGLĄD LITERATUROWY. 3.Modyfikacje 5'-końca oligonukleotydu 36

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

oligonukleotydów w reakcji standardowej kondensacji z chlorkiem piwaloilu. β-Eliminacja reszty 2-(p-nitrofenylo)etylowej następuje w wyniku działania DBU, reszta 2-cyjanoetylowa zaś ulega β-eliminacji w trakcie końcowego działania amoniakiem. W obu przypadkach uzyskuje się 5'-wodorofosforyny oligonukleotydów.

W powyższych podejściach zastrzeżenia może budzić brak zadowalającej procedury uzyskiwania czystych monoestrów. Opisana została jednak inna, prosta metoda otrzymywania wodorofosforynów monoalkilowych poprzez transestryfikację H-fosfonianu difenylowego odpowiednim alkoholem. Powstający na pierwszym etapie H-fosfonian dialkilowy hydrolizuje się do monoestru, który wydziela się jako produkt krystaliczny⁸⁶.

Marsters i wsp.⁸⁷ opublikowali metodę bezpośredniej fosfonylacji oligonukleotydu kwasem fosforawym z użyciem chlorku piwaloilu jako czynnika aktywującego. Przy propo-nowanym sposobie aktywacji kwasu fosforawego i stosowanych nadmiarach reagentów produktem głównym (~90%) reakcji był symetryczny H-fosfonian 5'-5' dioligonukleotydowy (83). Zwiększenie ilości kwasu fosforawego względem chlorku piwaloilu w roztworze fosfonylującym poprawiło wydajność 5'-H-fosfonianu oligonukleotydu (84), jednakże 5'-5' symetryczny dimer był nadal jednym z głównych (~40 %) produktów reakcji (Schemat 10). Przy dalszym wzroście nadmiaru H3PO3 fosfonylacja zachodziła ze zdecydowanie mniejszą wydajnością.

W zamierzeniach autorów metody, jej głównym walorem miało być stosowanie prostych i tanich reagentów, a także prostej chemii prowadzącej bezpośrednio do pożądanego produktu. Otrzymane wyniki negatywnie zweryfikowały te oczekiwania. Według mojej oceny podejście to nadal zasługuje na uwagę, jednakże wymaga dopracowania metodycznego. Uważam, że warunkiem koniecznym kontroli procesu fosfonylacji w proponowanym systemie jest identyfikacja czynnika fosfonylującego. Bez większego ryzyka można postulować, że układ produktów opisany przez Mastersa i wsp. wiąże się nie z samą reakcją fosfonylacji, lecz ze sposobem aktywacji kwasu fosforawego chlorkiem piwaloilu i kontrola tej ostatniej reakcji może znacznie poprawić chemoselektywność procesu.

H₃PO₃ / PvCl ODN HO ODN HO ODN O P O ODN O H ODN H₂PO₃ ODN H₂PO₃ 83 84 SCHEMAT 10

PRZEGLĄD LITERATUROWY. 4. Modyfikacje w pozycjach 1', 2' i 4' szkieletu cukrowego 37

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. M

1',2'

4'

Idea modyfikacji reszty cukrowej (C-1', C-4' i 2'-OH) oparta jest na założeniu, że reszta ta nie jest bezpośrednio uwikłana w proces hybrydyzacji, w związku z czym jej modyfikacje nie powinny w istotny sposób wpływać na trwałość dupleksu. Wybór takiego sposobu modyfi-kacji z reguły wymaga przygotowania w pierwszej kolejności odpowiednio zmodyfikowanego nukleozydu, następnie jego amidofosforynu lub H-fosfonianu i wprowadzenie go do oligo-meru. Syntony tego typu można wprowadzać w dowolnej pozycji łańcucha oligonukleotydo-wego. Możliwe jest też wprowadzanie do oligomeru wielu tego typu jednostek.