PODSUMOWANIE

Przedstawione w niniejszej rozprawie wyniki można podzielić na dwie części: (i) badania na związkach modelowych w roztworze,

(ii) funkcjonalizacja i znakowanie oligonukleotydów na podłożu stałym.

Reagenty i metody w badaniach na związkach modelowych dobrano tak, by później można było je stosować do funkcjonalizacji oligonukleotydów związanych z podłożem stałym. Okazało się, że w większości przypadków wyniki tych badań mają bardziej ogólny charakter i poszerzają dotychczasową wiedzę na temat właściwości chemicznych H-fosfonianów, a także mogą być podstawą do rozwinięcia nowych kierunków badawczych tej klasy związków. Znalazło to wyraz w pracach opublikowanych w trakcie realizacji niniejszej rozprawy. W mojej ocenie najistotniejsze osiągnięcia tego etapu są następujące:

– opracowanie metody syntezy H-fosfonianów aminoalkilo – nukleozydowych z wolną funkcją aminową na reszcie aminoalkilowej w bezpośredniej kondensacji H-fosfonianów nukleozydów z nieblokowanymi aminoalkoholami¹³⁴,

– wyniki prac nad czynnikami wpływającymi na transestryfikację diestrów H-fosfonia-nowych, w tym alkilo- i arylo-H-fosfonianów nukleozydów ^137,138,

– w oparciu o transestryfikację fosforynu difenylowego – opracowanie nowych metod syntezy H-fosfonianów nukleozydów¹⁰² i wielu, jak dotąd trudno dostępnych, H-fos-fonianów alkilowych⁸⁹,

– opracowanie nowej metody syntezy fosforanotriestrów aminoalkilowych na drodze kondensacji oksydatywnej¹⁴⁶,

– opracowanie nowej metody syntezy N-chronionych H-fosfonianów aminoalkilowych (syntonów nienukleotydowych)¹⁴⁵,

– stwierdzenie i dowiedzenie występowania reakcji amin pierwszorzędowych z akrylo-nitrylem w niektórych warunkach odblokowania oligonukleotydów¹⁴⁷.

Jednym z najważniejszych założeń proponowanych metod funkcjonalizacji oligomerów było ograniczenie lub wyeliminowanie stosowania grup blokujących w reagentach modyfikujących. Okazało się, że protonowanie funkcji aminowej aminoalkoholi na tyle skutecznie obniżało nukleofilowość atomu azotu, że nie obserwowano jego udziału w większości badanych reakcji substytucji nukleofilowej na centrum fosforowym. Ten prosty zabieg pozwolił na wykorzystanie nieblokowanych (a jedynie protonowanych) aminoalkoholi w następujących reakcjach:

– chemoselektywna synteza aminoalkilo-H-fosfonianodiestrów wobec NEP-Cl jako czynnika kondensującego,

PODSUMOWANIE 107

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

– transestryfikacja H-fosfonianów arylowych z pełną chemoselektywnością w kierunku diestrów,

– uniknięcie transestryfikacji internukleotydowych wiązań H-fosfonianodiestrowych podczas funkcjonalizacji oligonukleotydu otrzymanego metodą H-fosfonianową. – całkowicie chemoselektywna kondensacja oksydatywna H-fosfonianodiestrów do

aminoalkilofosforotriestrów.

Wykorzystując wyniki otrzymane na związkach modelowych w roztworze, zgodnie z trzema planowanymi na początku wariantami (Schemat 16), opracowałem warunki funkcjona-lizacji oligonukleotydów związanych z podłożem stałym. Dodatkowo, opracowałem nowy wariant (Wariant Ib) funkcjonalizacji oligonukleotydów, w którym wykorzystałem aktywność fosfonianu difenylowego i jego produktów w reakcjach transestryfikacji. Tak więc, końcowym efektem badań nad funkcjonalizacją są cztery warianty przedstawione na Schemacie 45. Z wyjątkiem Wariantu II, opracowane podejścia można stosować do funkcjonalizacji oligonukleotydów otrzymanych zarówno metodą H-fosfonianową jak i amidofosforynową.

W trójetapowym Wariancie Ia, zastosowanie do fosfonylacji łatwego do otrzymania kwasu pirofosfonowego gwarantowało praktycznie ilościową fosfonylację oligonukleotydu. Kondensacja z chlorowodorkiem aminoalkoholu wobec NEP-Cl także zachodziła niemalże ilościowo i po utlenieniu jodem w warunkach standardowych otrzymywano sfunkcjonalizo-wany oligonukleotyd jako zdecydowanie główny produkt.

Wariant Ib to również modyfikacja stopniowa, w której do fosfonylacji stosowano odpowiedni nadmiar handlowego fosfonianu difenylowego. Powstający ilościowo w tej szybkiej reakcji, 5'-fenylo-H-fosfonian oligonukleotydu traktowany chlorowodorkiem amino-alkoholu, ulegał ilościowej transestryfikacji do 5'-aminoalilo-H-fosfonianu oligomeru. Po jego utlenieniu (I2/H2O) otrzymywano końcowy pożądany produkt – sfunkcjonalizowany oligonu-kleotyd, jako niemalże jedyny produkt trzech etapów modyfikacji.

W Wariancie Ib otrzymany na pierwszym etapie 5'-fenylo-H-fosfonian oligonukleotydu można wykorzystać do syntezy innych pochodnych np. zhydrolizować do 5'-H-fosfonianu oligomeru lub w reakcji z 2-cyjanoetanolem przekształcić w 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonian oligonukleotydu. Utlenienie i odblokowanie tego ostatniego prowadzi do 5'-fosforanów oligo-nukleotydów, z możliwością ich wykorzystania do katalizowanej enzymatycznie (T4 DNA ligaza) syntezy dłuższych fragmentów DNA, np. biologicznie funkcjonalnych jednostek gene-tycznych (promotory, geny struktury i wiele innych).

Ponadto, oprócz cech uniwersalności, Wariant Ib jest podejściem szczególnym, gdyż na żadnym etapie jego realizacji nie używa się czynników kondensujących, co może mieć decy-dujące znaczenie w przypadkach gdy modyfikacji poddaje się oligonukleotyd niosący ugrupo-wania podatne na acylowanie chlorkami acylowymi lub fosforylację chlorofosforanami.

Wariant II S 5' 3' O P O -O H ODN S 5' 3' O P O H₂N(CH₂)_nO H ODN HO S 5' 3' ODN S 5' 3' O P O O H CE ODN 3' 5' S O P O O (CH₂)_n H2N O -ODN H₂N(CH₂)_nO CE O O P O ODN S 5' 3' Usunięcie reszty alkilowej Wariant I S 5' 3' O P O PhO H ODN a b H₄P₂O₅ (PhO)₂P(O)H H₂O ^CN(CH2)₂OH HO(CH₂)_nNH₂.HCl HO(CH₂)_nNH₂.HCl NEP-Cl I₂ / H₂O PivCl HO(CH₂)nNH₂.HCl tetrazol / I₂ CN(CH₂)₂O P O H O -S 5' 3' O P O H NH(CH2)nO DMTr ODN S 5' 3' O P O O -DMTrHN(CH₂)_nO ODN I₂ / H₂O Wariant III DMTrNH(CH2)_nO P O H O -PivCl DCA a SCHEMAT 45

PODSUMOWANIE 109

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Funkcjonalizacja oligonukleotydów wg Wariantu II przebiegała zadowalająco jedynie na pierwszym etapie tj. generowania na końcu 5' oligomeru reszty 2-cyjanoetylo-H-fosfonianowej. Do otrzymywania 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonianów oligonukleotydów można było stosować dwie, równie wydajne metody, tj. transestryfikację 5'-fenylo-H-fosfonianu oligonukleotydu 2-cyjanoetanolem lub bezpośrednią kondensację 5'-HO-oligomeru z H-fosfo-nianem 2-cyjanoetylowym wobec PivCl. Natomiast na etapie oksydatywnej kondensacji 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonianu oligonukleotydu z chlorowodorkami aminoalkoholi, pożądany sfunkcjonalizowany oligonukleotyd otrzymywano z wydajnościami nie przekraczającymi 50%. Ponieważ analogiczne reakcje prowadzone na związkach modelowych w roztworze zachodziły ilościowo, sądzę, że niepowodzenia w tym przypadku związane są z układem heterogennym, w którym reagenty są w roztworze, a modyfikowany oligonukleotyd w fazie stałej. Niestety, nie miałem technicznych możliwości (³¹P NMR) śledzenia poszczególnych etapów modyfikacji centrum 5' fosforowego oligonukleotydu związanego z fazą stałą i z konieczności tę sprawę pozostawiłem nie do końca wyjaśnioną.

Jak można było się spodziewać, funkcjonalizacja oligonukleotydów wg Wariantu III, w którym oligomer fosfonylowano odpowiednio zablokowanym aminoalkilo-H-fosfonianem, zachodziła szybko i wydajnie. Ponieważ reakcje kondensacji i następnie utleniania prowadzi się w standardowych warunkach syntezy oligonukleotydów (metodą H-fosfonianową), to można cały proces funkcjonalizacji traktować jako dodatkowy cykl syntezy łańcucha oligonukleotydowego.

W niniejszej rozprawie opracowano trzy nowe, stosunkowo proste i jednocześnie efek-tywne metody funkcjonalizacji oligonukleotydów związanych z podłożem stałym. Wszystkie z nich spełniają stawiane w rozprawie kryteria metodyczne i ekonomiczne. Każda z prezentowanych w rozprawie metod funkcjonalizacji oligonukleotydów oparta jest na różnego typu reakcjach chemicznych i stosuje różne reagenty. Pozwala to na optymalny wybór jednej z nich w zależności od potrzeb i praktycznych możliwości realizacji.

Sfunkcjonalizowane oligonukleotydy znakowano różnymi grupami reporterowymi na podłożu stałym lub w roztworze, wykorzystując handlowo dostępne, aktywne pochodne fluoresceiny, rodaminy i biotyny. Przydatność otrzymanych nieradioizotopowych oligonukle-otydowych sond molekularnych została sprawdzona z wynikiem pozytywnym w testach analitycznych wykonanych w niezależnych laboratoriach.

Na koniec, mając na uwadze uzyskane wyniki, pozwalam sobie wyrazić pogląd, że w mojej ocenie cele stawiane w niniejszej rozprawie zostały osiągnięte.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA 110

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________