GRANICA WYKRYWALNOŒCI

Powy¿ej opisana metoda zosta³a poddana walidacji zgodnie z protoko³em zapro-ponowanym przez EURACHEM Working Group [31]. Ze wzglêdu na fakt, ¿e diu-retyki s¹ substancjami, dla których Œwiatowa Agencja Antydopinowa (WADA) nie okreœli³a stê¿eñ progowych, których przekroczenie powoduje uznanie wyniku ana-lizy za pozytywny [32], kluczowym parametrem, który nale¿a³o zbadaæ w procesie walidacji by³a granica wykrywalnoœci. Nale¿a³o sprawdziæ czy zaproponowana metoda umo¿liwia wykrycie badanych substancji przynajmniej na poziomie MRPL (ang. Minimum Required Performance Limit – minimalna wymagana wartoœæ gra-nicznej wykrywalnoœci) [32]. Wartoœci MRPL ustalone przez WADA oznaczaj¹ mini-malne stê¿enie analitu w próbce, które winno byæ wykryte i potwierdzone w labora-toriach posiadaj¹cych akredytacjê Œwiatowej Agencji Antydopingowej.

W celu sprawdzenia przydatnoœci metody do badañ antydopingowych przygo-towano próbki mieszaniny wzorców diuretyków i innych zwi¹zków (wymienionych w Tabeli 2) o stê¿eniach: 30, 50, 100, 250 ng/ml. Próbki badanych substancji pod-dano procesowi ekstrakcji. Równolegle, w uk³adzie UPLC/MS/MS, analizowano próbki kontrolne przygotowane z mieszaniny wzorców (o stê¿eniach identycznych jak te podane powy¿ej), które nie zosta³y poddane procesowi ekstrakcji. Stopieñ odzysku okreœlono na podstawie stosunku powierzchni pików badanych substancji dla próbek po ekstrakcji do powierzchni pików wzorców (próbek testowych) bez-poœrednio wprowadzonych do uk³adu analitycznego. Dla przewa¿aj¹cej wiêkszoœci zwi¹zków wykazano odzysk z ekstrakcji na poziomie powy¿ej 80%. Granicê wykry-walnoœci okreœlono na podstawie stosunku sygna³u do szumu (ang. signal to noise, S/N), przyjmuj¹c, ¿e wartoœæ tego stosunku dla jonu o najmniejszej odpowiedzi powinna wynosiæ nie mniej ni¿ 3. Dla wiêkszoœci diuretyków uzyskano granice wykrywalnoœci na poziomie 1/5 MRPL tj. 50 ng/ml moczu (wyznaczone granice

wykrywalnoœci poszczególnych zwi¹zków zestawiono w Tabeli 2). Dla porówna-nia, stosowana wczeœniej w Zak³adzie Badañ Antydopingowych procedura wykry-wania diuretyków technik¹ GC/MS tak¿e spe³nia³a kryteria WADA, ale nie pozwa-la³a na oznaczanie wiêkszoœci diuretyków w próbkach moczu na tak niskich pozio-mach.

Tabela 2. Granice wykrywalnoœci diuretyków i innych substancji dopinguj¹cych w moczu w metodzie wykorzystuj¹cej uk³ad UPLC/MS/MS

Table 2. Limits of detection for diuretics and other doping agents in the analytical method with use of UPLC/MS/MS

PODSUMOWANIE

Opracowana w Zak³adzie Badañ Antydopingowych procedura analityczna wykrywania diuretyków technik¹ UPLC/MS/MS spe³nia wymagania stawiane meto-dom detekcji substancji zabronionych w sporcie, zarówno pod wzglêdem poziomu wykrywalnoœci, jak równie¿ zakresu badanych zwi¹zków. Stosunkowo prosta pro-cedura ekstrakcji oraz nied³ugi etap oznaczania pozwalaj¹ na przeprowadzenie ana-lizy próbki na obecnoœæ diuretyków w bardzo krótkim czasie oraz przedstawienie wyników badañ do 48 h od momentu przyjêcia próbki. Opisywana procedura mo¿e byæ rozszerzana o kolejne substancje zabronione w sporcie posiadaj¹ce podobne do diuretyków w³aœciwoœci chemiczne i fizyczne.

Aktualnie w laboratoriach antydopingowych testuje siê mo¿liwoœæ analizowa-nia próbek na obecnoœæ diuretyków wykorzystuj¹c bezpoœredni nastrzyk moczu na kolumnê chromatograficzn¹. Badoud i in. [33] zastosowali tak¹ uproszczon¹ proce-durê z wykorzystaniem uk³adu chromatografii cieczowej po³¹czonej ze spektrome-tri¹ mas wysokiej rozdzielczoœci, wykorzystuj¹c¹ kwadrupol w po³¹czeniu z anali-zatorem czasu przelotu (Q-TOF).

PIŒMIENNICTWO CYTOWANE

[1] S. Koz³owski, W.J. Rewerski, Doping, PZWL, Warszawa, 1980. [2] W. Roeske, Arch. Hist. Med., 1968, 31, 167.

[3] D. Clasing, Doping und seine Wirkstoffe: verbotene Arzneimittel im Sport, Spitta Verlag, Balin-gen, 2004, 276.

[4] W. Granowska, Doping zabija sport, Towarzystwo Lekarskie Warszawskie, Warszawa, 2006, 83–95.

[5] H. Sarikaya, C. Peters, T. Schultz, M. Schoenfelder, H. Michna, Biomedical Side Effects of Doping, Uni-Druck OHG, Cologne, 2007, 34–44.

[6] World Anti-Doping Agency, The World Anti-Doping Code. The 2010 Prohibited List, [dostêp 10 stycznia 2010]. Dostêpny w Internecie: http://www.wada-ama.org/rtecontent/document/ 2010_Prohibited_List_FINAL_EN_Web.pdf.

[7] World Anti-Doping Agency, The World Anti-Doping Code 2009, [dostêp 10 stycznia 2010]. Dostêpny w Internecie http://www.wada-ama.org/rtecontent/document/code_v2009_En.pdf. [8] D. Thieme, J. Grosse, R. Lang, R.K. Mueller, A. Wahl, J. Chromatogr. B, 2001, 757, 49. [9] Y. Qin, X.B. Wang, C. Wang, M. Zhao, M.T. Wu, Y.X. Xu, S.Q. Peng, J. Chromatogr. B Analyt.

Technol. Biomed. Life Sci., 2003, 794, 193.

[10] C. Goebel, G.J. Trout, R. Kazlauskas, Anal. Chim. Act., 2004, 502, 65.

[11] K. Deventer, P. Van Eenoo, F.T. Delbeke, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2005, 19, 90. [12] K. Deventer, G. Baele, P. Van Eenoo, O.J. Pozo, F.T. Delbeke, J. Pharm. Biomed. Anal., 2009,

49, 519.

[13] W. Schaenzer, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck , Recent Adv. Doping Anal., 2003, 11, 13. [14] W. Kostowski, P. Kubikowski, Farmakologia – podstawy farmakoterapii i farmakologii

klinicz-nej, PZWL, Warszawa, 1994.

[15] A.C. Moffat, M.D. Osselton, B. Widdop, Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons in pharmaceuti-cals, body fluids and postmortem material, The Pharmaceutical Press, London, 2003.

[16] R. Ventura, T. Nadal, P. Alcalde, J.A. Pascual, J. Segura, J. Chromatogr. A, 1993, 655, 233. [17] K. Deventer, O.J. Pozo, P. Van Eenoo, F.T. Delbeke, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 5819. [18] L. Amendola, C. Colamonici, M. Mazzarino, F. Botre, Anal. Chim. Act., 2003, 475, 125. [19] V. Morra, P. Davit, P. Capra, M. Vincenti, A. Di Stilo, F. Botre, J. Chromatogr. A, 2006, 1135, 219. [20] R. Ventura, J. Segura, J. Chromatogr. B, Biomedical Sciences and Applications, 1996, 687, 127. [21] W. Schaenzer, H. Geyer, A. Gotzmann and U. Mareck, Recent Adv. Doping Anal., 2000, 8, 47. [22] K. Deventer, F.T. Delbeke, K. Roels, P. Van Eenoo, Biomed. Chromatogr., 2002, 16, 529. [23] K. Deventer, O.J. Pozo, P. Van Eenoo, F.T. Delbeke, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 2466. [24] W. Schaenzer, H. Geyer, A. Gotzmann and U. Mareck, Recent Adv. Doping Anal., 2001, 9, 321. [25] W. Schaenzer, H. Geyer, A. Gotzmann and U. Mareck, Recent Adv. Doping Anal., 2008, 16, 313. [26] L. Politi, L. Morini, A. Polettini, Clin. Chim. Act., 2007, 386, 46.

[27] B. Shao, J. Zhang, Y. Yang, J. Meng, Y. Wu, H. Duan, Rapid Commun. Mass Spectr., 2008, 22, 3427.

[28] G.J. Murray, J.P. Danaceau, J. Chromatogr. B, 2009, 877, 3857.

[29] W. Schaenzer, H. Geyer, A. Gotzmann and U. Mareck, Recent Adv. Doping Anal., 2005, 13, 21. [30] World Anti-Doping Agency, Technical Document TD2003IDCR - Identification Criteria For

Qualitative Assays Incorporating Chromatography And Mass Spectrometry, [dostêp 10 stycznia 2010]. Dostêpny w Internecie http://www.wada-ama.org/rtecontent/document/criteria_1_2.pdf. [31] EURACHEM Working Group, The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory

Guide to Method Validation and Related Topics,1998, Teddington, [dostêp 10 stycznia 2010]. Dostêpny w Internecie: http://www.eurachem.org/guides/valid.pdf.

[32] World Anti-Doping Agency, Technical Document TD2009MRPL - Minimum Required Perfor-mance Limits For Detection of Prohibited Substances, [dostêp 10 stycznia 2010]. Dostêpny w Internecie http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-IS-Laboratories/WADA_TD2009MRPL_EN.pdf.

[33] F. Badoud, E. Grata, L. Perrenoud, L. Avois, M. Saugy, S. Rudaz, J.L. Veuthey, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 4423.