Biosynteza i akumulacja wielu metabolitów wtórnych odbywa się tylko w kulturach zróżnicowanych, w określonych tkankach i organach. Kultury komórkowe posiadają często ograniczoną zdolność do biosyntezy niektórych metabolitów wtórnych. Niezróżnicowane komórki nie zawsze syntezują te same produkty, co rośliny, z których pochodzą, lub produkują jedynie związki pośrednie, nie przeprowadzając całkowitej, kompletnej biosyntezy. Przyczyną jest fakt, że biosynteza niektórych związków włączona jest w program specjalizacji, który nie może być uruchomiony w komórkach niewyspecjalizowanych. Jest to związane z izolacją komórek od naturalnej tkanki, w której normalnie rosną i w efekcie znacznym zmniejszeniem komunikacji międzykomórkowej odpowiedzialnej za procesy metaboliczne. Wiele szlaków biosyntezy metabolitów wtórnych jest tkankowo- i organospecyficzna. Ogólnie można powiedzieć, że prawdopodobieństwo wytwarzania metabolitu wtórnego w kulturze organu jest większe, gdy stopień organizacji organu zbliżony jest do stopnia jej organizacji w całej roślinie. Największy stopień organizacji wykazują kultury organów - korzeni i pędów. Ponadto kultury organów charakteryzują się większą stabilnością genetyczną niż kultury komórkowe. Kultury organów w płynnych pożywkach są dobrym systemem do zastosowania różnych zabiegów biotechnologicznych mających na celu podwyższenie akumulacji cennych metabolitów wtórnych w kulturach [Wysokińska, Chmiel 2006; Diettrich 2003].
76 4.2.1. Kultury korzeniowe
Częstym surowcem farmaceutycznym leków naturalnych jest korzeń roślin leczniczych. Rozwój metod in vitro, prowadzenie szybko wzrastających i nastawionych na zwiększoną produkcję kultur korzeni daje unikalną możliwość uniezależnienia od tradycyjnej, zwykle mniej wydajnej i ograniczonej uprawy gruntowej. W związku z tym kultury organów prowadzone w warunkach in vitro mogą stać się ważnym, alternatywnym źródłem substancji chemicznych, pozyskiwanych dotąd z bezpośredniej ekstrakcji z surowców roślinnych pochodzących z naturalnej uprawy [Wadegaonkar i wsp. 2006; Wysokińska, Chmiel 2006; Martin i wsp. 2008].
Indukcja korzeni normalnych w warunkach in vitro
Dzięki zastosowaniu optymalnego składu pożywki oraz zachowaniu odpowiednich warunków in vitro możliwe jest pobudzenie wytwarzania de novo korzeni przybyszowych z dowolnych eksplantatów. W zależności od wybranej metody, formowanie nowych korzeni może odbywać się na drodze bezpośredniej - poprzez rozwój korzeni siewki i ukorzenianie pędów wytworzonych w procesie mikrorozmnażania, lub pośrednio poprzez indukcję z kalusa w procesie organogenezy pośredniej. Eksplantatami wykorzystywanymi do założenia tego typu hodowli są odcinki korzeni głównych i bocznych siewek i roślin zawierające stożek wzrostu. Obejmują one zazwyczaj fragment z czapeczką i merystemem wierzchołkowym, niekiedy także strefę różnicowania się korzenia. Najczęściej w kulturach obserwuje się morfogenezę bezpośrednią - pobrany wierzchołek korzenia po przełożeniu na pożywkę z auksynami kontynuuje wzrost korzenia głównego i formuje korzenie boczne.
Początkowo kultury korzeniowe nastawione są na rozwój, umieszczone w płynnej pożywce fragmenty korzeni intensywnie się rozwijają, dochodzi do największego przyrostu biomasy i formowania korzonków bocznych. Produkcja metabolitów wtórnych na tym etapie jest znacznie zredukowana, gdyż kultura wykorzystuje większość dostępnych składników odżywczych głównie na intensywne powiększenie biomasy. Po osiągnięciu optymalnego stopnia rozwoju kultury korzeniowe znacznie zwiększają produktywność.
77
Czynniki wpływające na wzrost biomasy i produkcję metabolitów wtórnych w kulturach korzeniowych
Po etapie wzrostowym, kultury korzeniowe rozpoczynają zwiększoną biosyntezę metabolitów wtórnych [Baiza i wsp. 1998]. Pod tym względem najcenniejsze są kultury charakteryzujące się dużą liczbą korzonków bocznych, o znacznym potencjale produkcyjnym. Istotne jest opracowanie odpowiedniego protokołu szybko rosnących kultur, co znacznie zwiększa wydajność prowadzonej hodowli i jej skalę dzięki zastosowaniu bioreaktorów [Ekiert 2009].
Czynnikami wpływającymi na wzrost i produktywność kultur korzeniowych są: wybór najbardziej produktywnej linii oraz eksplantatu o dużym współczynniku indukcji korzeni bocznych, selekcja i optymalizacja składu pożywki, warunki prowadzenia hodowli (np. światło/ciemność) oraz zabiegi biotechnologiczne (np. elicytacja) [Rout i wsp. 2000; Georgiev i wsp. 2007; Matkowski 2008].
W procesie formowania korzeni w warunkach in vitro główną rolę odgrywają auksyny. W okresie inicjacji, wysokie stężenie auksyny może sprzyjać formowaniu większej liczby zawiązków korzeniowych. Do najczęściej stosowanych auksyn należą IAA, IBA, NAA, rzadziej 2,4-D. Ich wybór zależy od wielu czynników, jak: gatunek rośliny, warunki hodowli czy stężenie innych substancji w pożywce [Orlikowska 1997].
W kulturach roślinnych, jako źródło węgla i energii stosuje się cukry, głównie sacharozę. Związki te wpływają na ciśnienie osmotyczne oraz odgrywają zasadniczą rolę w regulacji metabolizmu komórek roślinnych. Udowodniono, że stężenie cukru w pożywce wpływa na rozwój korzeni i produkcję niektórych substancji czynnych [MacGregor i wsp. 2008]. Korzystne efekty daje prowadzenie kultury dwu- lub wielo-stopniowej, gdzie stężenie cukru jest stopniowo zwiększane. W pierwszym etapie stężenie jest niskie, dochodzi do intensywnego przyrostu biomasy, formowania i rozwoju korzeni bocznych, których powstawanie byłoby stłumione przy dużych stężeniach sacharozy. W kolejnych etapach zwiększa się stężenie cukru, co sprzyja dalszemu rozwojowi wytworzonych już korzeni bocznych i znacznie zwiększa wydajność produkcji metabolitów wtórnych [Kusakari 2000].
78
Produkcja metabolitów wtórnych w kulturach korzeniowych
W piśmiennictwie spotykane są prace świadczące o możliwościach otrzymywania wybranych metabolitów wtórnych z kultur korzeniowych szeregu gatunków roślin leczniczych. Przykłady wysokoproduktywnych kultur korzeniowych podano w tabeli 2. Tab. 2 Przykłady wysokoproduktywnych korzeniowych kultur in vitro
Gatunek Metabolity Wydajność produkcji
Pożywka + Fitohormony [mg l-1] Sacharoza [g l-1] Piśmiennictwo Bupleurum falcatum
saikosaponiny większa niż w k. gruntowych >2,5% s.m. B5 + 8,0 IBA + 40 S Kusakari i wsp. 2000 Decalepis hamiltonii 2-hydroksy-4- metoksy-benzaldehyd
2,7 x większa od k. gruntowych MS + 1,0 NAA + 30 S
Giridhar i wsp. 2005
Echinacea purpurea
kwas kawowy 3 x większa od k. gruntowych ½MS + 2,0 IBA + 50 S
Wu i wsp. 2007
Panax ginseng
ginsenozydy ponad 7 x większa niż w kalusie ¾ MS + 5,0 IBA + 40 S
Huang i wsp. 2010
Primula veris
saponiny ponad 8 x większa niż w kalusie i kulturze zawiesinowej Andersona + 10,0 2,4-D + 1,0 Kin Okršlar i wsp. 2007 Raphanus sativus
antocyjany większa niż w k. gruntowych 0,15 vs 0,11% s.m. ½MS + 0,5 IBA Betsui i wsp. 2004 Salvia fruticosa kwas rozmarynowy
ponad 3,5x większa niż k. gruntowe B5 + 0,5 NAA + 40 S Karam i wsp. 2003 Saussurea involucrata fenylo- propanoidy
ponad 6x większa niż k. gruntowe ½ MS + 0,5 IAA + 30 S Fu i wsp. 2006 Withania somnifera
witanolid ponad 30% większa niż k. gruntowe ½ MS + 0,5 IAA + 2,0 IBA Wadegaonkar i wsp. 2006 Withania somnifera
witanolid A 21x większa niż w roślinie donorowej
½ MS + 0,5 IBA + 30 S
Praveen, Murthy 2010 B5 – pożywka Gamborga; MS-pożywka Murashige i Skooga; 2,4-D - kwas dwuchlorofenoksyoctowy ; IAA – kwas indolo-3-octowy; IBA – kwas indolo-3-masłowy; NAA – kwas naftylo-1-octowy; Kin – kinetyna, S – sacharoza
79 Korzenie powstałe w wyniku transformacji szczepem bakterii glebowej Agrobacterium
rhizogenes posiadają zdolność do syntezy metabolitów naturalnie występujących
w korzeniach, a ich produkcja w biomasie może być nawet wielokrotnie wyższa i bardziej wydajna niż w innych kulturach lub w korzeniach roślin z tradycyjnej uprawy gruntowej. Ponadto korzenie transformowane niektórych gatunków posiadają zdolność do syntezy związków aktywnych, które nie występują w roślinie donorowej [Olszowska 2000; Guillon i wsp. 2006].
Gatunki roślin różnią się wrażliwością na zakażenia szczepami A. rhizogenes. Nie wszystkie taksony charakteryzują się jednakową odpowiedzią na tzw. agroinfekcję. Kultury korzeni transformowanych różnią się od korzeni gruntowych oraz od kultur korzeni normalnych prowadzonych w warunkach in vitro. Kultury korzeni włośnikowatych charakteryzuje szybsze tempo wzrostu na pożywkach bez auksyn, silny rozrost korzeni bocznych, brak przyrostu wtórnego i geotropizmu. Dodatkową cechą wyróżniającą korzenie włośnikowate jest stabilność genetyczna i długotrwała wydajność utrzymująca się na stałym poziomie. Daje to przewagę nad innymi kulturami
in vitro, jak kultury kalusa czy kultury komórkowe, w których może zachodzić
zmienność somaklonalna, co może rzutować obniżeniem wytwarzania cennych metabolitów wtórnych [Olszowska 2000; Guillon i wsp. 2006; Chandra, Chandra 2011]. 4.2.2. Kultury pędowe
Najważniejszym czynnikiem przemawiającym na korzyść kultur pędowych jest organospecyficzność, czyli produkcja metabolitów tylko w wyspecjalizowanych tkankach rośliny i brak możliwości uzyskania ich w pojedynczych, niezróżnicowanych
komórkach. Ma to związek z faktem, że komórki niezróżnicowane nie tworzą tkanek i nie zachodzi komunikacja międzykomórkowa, odpowiedzialna za procesy
metaboliczne. Najbardziej znanym przykładem jest produkcja hyperycyny i hyperforyny w gatunku Hypericum perforatum L. tylko w wyspecjalizowanej tkance liści, a akumulacja w zbiornikach olejkowych [Karuppusamy 2009]. Niektóre rośliny wytwarzają pożądane metabolity wtórne tylko w częściach nadziemnych, przy ich całkowitym braku w korzeniach czy niezróżnicowanych kulturach komórkowych. Do takich gatunków należy Artemisia annua L., w której biosynteza artemizyny zachodzi jedynie w pędach [Zhao, Liu 2007].
80
Założenie i hodowla kultur pędowych
Pędy do założenia kultury pędowej można uzyskać poprzez proces morfogenezy bezpośredniej – tzw. kulturę pąków bocznych (pachwinowych). W tym przypadku eksplantatem pierwotnym jest wierzchołkowa część pędu z pąkami kątowymi (bocznymi), która przeważnie zawiera merystem apikalny, zawiązki liści i merystemy boczne znajdujące się w kątach liści. Liczba merystemów w roślinie jest niewielka, więc wydajność procesu jest ograniczona. Zwykle w takiej kulturze, z jednego eksplantatu może rozwinąć się od 3 do 20 pędów [Bach, Pawłowska 2009].
Czynniki wpływające na wzrost biomasy i produkcję metabolitów wtórnych w pędach
Wyłożenie eksplantatu do pożywki bez regulatorów wzrostu i rozwoju skutkuje aktywnością endogennej auksyny wytwarzanej w wierzchołkach wzrostu i pąki boczne nie krzewią się lecz rozwijają w pojedynczą roślinę z merystemu apikalnego. Stąd też ważna jest obecność w pożywce cytokininy, która hamuje działanie auksyny i umożliwia rozwój pąków kątowych, co wpływa na powstawanie nowych pędów.
Produkcja metabolitów wtórnych w kulturach pędowych
W piśmiennictwie spotykane są prace świadczące o możliwościach otrzymywania wybranych metabolitów wtórnych z kultur pędowych szeregu gatunków roślin leczniczych. Przykłady wysokoproduktywnych kultur pędowych podano w tabeli 3. Tab. 3 Przykłady produkcji metabolitów wtórnych w kulturach pędów in vitro [wg Karuppusamy 2009]
Gatunek Metabolity Pożywka
Adhatoda vasica wazyna MS+BAP+IAA
Centella asiatica azatiakozyd MS+BAP+IAA
Corydalis cava kordialina MS+BAP+GA3
Cymbopogon citratus olejek eteryczny MS+IAA+GA3
Drosera rotundifolia 7-metylojuglon MS+NAA+BAP
Hemidesmus indicus lupeol, rutyna MS+NAA+BAP
Mentha arvensis terpenoidy MS+BAP+NAA
Opphiorrhiza rugosa kamptotecyna MS+BAP+Kin
Podophyllum hexandrum podofilotaksyna MS+BAP+GA3
Primula veris saponiny MS+BAP+GA3
Withania somnifera witaferyna A MS+BAP
MS-pożywka Murashige i Skooga, IAA – kwas indolo-3-octowy, IBA – kwas indolo-3-masłowy, NAA – kwas naftylo-1-octowy Kin – kinetyna, BAP – 6-benzyloaminopuryna, GA3 – kwas giberelowy
81 4.3. Kultury komórkowe
Kalus to niezróżnicowana morfologicznie i histologicznie masa komórek o charakterze parenchymatycznym, zdolna do ciągłych podziałów. W zależności od gatunku rośliny, rodzaju eksplantatu i składu pożywki indukcyjnej może wykazywać odmienne cechy morfologiczne. Kalus może mieć zwartą lub luźną strukturę, jednolitą bądź grudkowatą, różną barwę, może być suchy lub wilgotny, a jego struktura gładka lub nierówna. W kulturach in vitro można zainicjować proliferację kalusa morfogennego lub niemorfogennego. Pod wpływem pewnych regulatorów wzrostu i rozwoju roślin powstaje kalus morfogenny, w którym formują się zawiązki organów przybyszowych jednobiegunowych (pędy lub korzenie) lub dwubiegunowych (zawiązki zarodków somatycznych). Kalusy niemorfogenne nie posiadają zdolności do tworzenia nowych organów, zwiększają jedynie swoją masę poprzez proliferację komórek. Kompetencja lub jej brak nie jest cechą stałą kalusa i w dużej mierze zależy od pochodzenia i budowy eksplantatu, czasu trwania kultury, składu pożywki a w szczególności od rodzaju i stężenia regulatorów wzrostu i rozwoju roślin.
Kultury kalusa są wykorzystywane głównie do regeneracji roślin drogą morfogenezy przybyszowej oraz stanowią materiał wyjściowy do uzyskania kultury zawiesiny komórkowej [Mulabagal, Tsay 2004].
Prawidłowa, ustabilizowana zawiesina komórkowa to populacja pojedynczych komórek lub niewielkich agregatów komórkowych intensywnie rosnąca w rytmicznie wytrząsanej pożywce płynnej, charakteryzująca się powtarzalnymi parametrami wzrostu. Do inicjacji kultur zawiesinowych stosuje się najczęściej luźny, sypki, niezróżnicowany i podatny na rozbicie kalus. W praktyce kultury zawiesinowe stosuje się do uzyskiwania i namnażania komórek embriogennych oraz organogennych a następnie do regeneracji z nich roślin oraz do wytwarzania na dużą skalę metabolitów wtórnych [Mulabagal, Tsay 2004].
Kultury komórkowe in vitro udało się uzyskać z wielu gatunków roślin, ale często nie produkują one istotnych ilości wartościowych metabolitów wtórnych bądź nie wytwarzają związków charakterystycznych dla roślin naturalnych. Skuteczną metodą podniesienia syntetyzowanych produkcji w wielu systemach roślinnych jest elicytacja [Mulabagal, Tsay 2004].
82
1. Zabiegi biotechnologiczne stosowane w celu zwiększania akumulacji