Jedną z zalet roślinnych kultur in vitro jest możliwość wpływania na zwiększanie akumulacji metabolitów wtórnych w biomasie roślinnej. Do zabiegów biotechnologicznych stosowanych w celu zwiększenia wydajności biosyntezy tych związków zalicza się: dodatek prekursorów biosyntetycznych do pożywki, agregację komórek, immobilizację komórek, skierowanie gromadzenia substancji do określonych przedziałów komórkowych czy zmianę parametrów kultury. W odpowiedzi na różne czynniki środowiskowe, które odbiegają od optymalnych warunków życiowych roślin, organizmy te rozpoczynają syntezę de novo lub zwiększają produkcję związków obronnych np. metabolitów wtórnych (antrachinony, benzoksazyny, kumaryny, furanokumaryny, furanoacetyleny, furanoseskwiterpeny, seskwiterpeny, izoflawony, pięciocykliczne triterpeny i poliacetyleny). Ze względu na fakt, że szlaki metabolizmu wtórnego wielu związków są aktywowane przez czynniki stresowe, w kulturach in vitro stosuje się zabiegi biotechnologiczne np. elicytory lub czynniki sygnalne, nazywane także elicytorami endogennymi. Elicytory to substancje będące fizycznymi lub chemicznymi czynnikami wyzwalającymi odpowiedź obronną komórek. Poprzez zastosowanie zabiegów biotechnologicznych, komórki rozpoczynają lub zwiększają produkcję metabolitów wtórnych, a także mogą być stymulowane do uwalniania wytworzonych substancji do pożywki [Goyal i wsp. 2012; Sharma, Shahzad 2013]. Ze względu na pochodzenie elicytory dzieli się na :
- biotyczne endogenne - produkowane w roślinach i uczestniczące w przekazywaniu sygnałów w organach roślinnych (kwas jasmonowy i jego pochodne, kwas salicylowy) - biotyczne egzogenne - wytwarzane przez grzyby, bakterie
- abiotyczne
- chemiczne np. sole metali ciężkich, jony wapnia, kadmu, miedzi, fluorek sodu, cyjanek potasu, detergenty, antybiotyki, peptydy syntetyczne oraz jady pszczół i węży - fizyczne np. mechaniczne uszkodzenie, promieniowanie UV czy stres osmotyczny [Szpitter, Królicka 2005; Goyal i wsp. 2012; Sharma, Shahzad 2013]
83
Wpływ jasmonianu metylu (MeJa) na podwyższenie akumulacji metabolitów wtórnych w kulturach in vitro
Najczęściej stosowanym elicytorem w kulturach organów roślin leczniczych jest pochodna kwasu jasmonowego - jasmonian metylu.
Kwas jasmonowy i jego pochodne zalicza się do endogennych regulatorów wzrostu i rozwoju roślin - w tkankach roślinnych występują w niewielkich ilościach, są syntetyzowane pod wpływem czynników takich jak stres osmotyczny lub susza. Rola jasmonianów w procesie elicytacji polega na przekazywaniu sygnału do indukowania transkrypcji genów związanych z produkcją metabolitów wtórnych [Białecka, Kępczyński 1998; Zhang, Memelink 2009].
W piśmiennictwie istnieje wiele przykładów różnych kultur in vitro roślin leczniczych elicytowanych jasmonianami, zwykle w stężeniach od 50 do 200 µM przez okres 12 – 72 godz. Produkcja glicyryzyny - saponiny triterpenowej typu oleananu - w korzeniach
Glycyrrhiza gabra L., pod wpływem elicytacji jasmonianem metylu (0,1-2 mM) roślin
hodowanych w kulturach in vitro, wzrosła 3,8-krotnie [Shabani i wsp. 2009]. Natomiast zawartość glicyryzyny w kulturach korzeni transformowanych Glycyrrhiza inflata Bat. wzrastała w zależności od stężenia MeJa i czasu trwania elicytacji - najwyższa akumulacja tej saponiny (100 µM, 5 dni) była 5,7-krotnie wyższa niż w korzeniach kontrolnych [Wongwicha i wsp. 2011]. Elicytacja MeJa (50 mM) przez 48 godz. korzeni transformowanych Plumbago indica L. podwyższyła 5-krotnie akumulację plumbaginy - naftochinonu o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym [Martin i wsp. 2011]. Traktowanie kultur pędowych Bacopa monnieri (L.) Pennell MeJa (50 µM) przez 7 dni, skutkowało podwyższeniem zawartości bakozydu A - saponiny triterpenowej - 1,8-krotnie [Sharma i wsp. 2013]. Elicytacja MeJa (10 µM) kultur pędowych Mitragyna speciosa (Roxb.) Korth. przez 24 godz. wpływała na podwyższenie mitragyniny - alkaloidu indolowego, której zawartość w elicytowanych pędach wynosiła 0,11 mg g-1
[Wungsintaweekul i wsp. 2012]. Jasmonian metylu (50 µM) aplikowany do kultur roślinnych Drosera burmanii Vahl. przez 6 dni podwyższył stężenie naftochinonu plumbaginy 3-krotnie w porównaniu z kontrolą [Putalun i wsp. 2010]. Z kolei 0,1 mM MeJa stymulował 1,53-krotnie wyższą produkcję azjatykozydu w kulturach in vitro roślin Centella asiatica (L.) Urban [Kim i wsp. 2004].
84
Wpływ sacharozy (S) na podwyższenie akumulacji metabolitów wtórnych w kulturach in vitro
W szeregu pracach zaobserwowano, że zmiana ciśnienia osmotycznego pożywki generująca warunki stresu wpływa na podwyższenie syntezy niektórych metabolitów wtórnych. W tym celu stosuje się przeważnie cukry lub alkohole polihydroksylowe. Najczęściej stosowanym cukrem w kulturach organów roślin leczniczych jest sacharoza w stężeniu wyższym od standardowego, czyli od 40 do 90 mg g-1
.
Najwyższą produkcję kwasu rozmarynowego w kulturach korzeni Salvia fruticosa Mill., uzyskano gdy stężenie sacharozy w pożywce zostało podniesione do 40 mg g-1 [Karam i wsp. 2003]. W kulturach korzeniowych Periploca sepium Bunge otrzymano najwyższą akumulację peryplocyny (101,56 µg g-1
) w obecności 50 mg g-1 sacharozy [Zhang i wsp. 2012]. Najwyższa zawartość glicyryzyny (76,07 µg g-1
) w kulturach korzeni transformowanych G. inflata, 2,19- krotnie wyższa niż w kulturach kontrolnych, uzyskana została poprzez suplementowanie pożywki 60 mg g-1
sacharozy [Wongwicha i wsp. 2011]. Innym przykładem zwiększania akumulacji metabolitu wtórnego są w kultury pędowe C. asiatica, gdzie wzrost stężenia sacharozy do 50 i 70 mg g-1 skutkował 1,64 i 1,18-krotnie podwyższoną akumulacją azjatykozydu (odpowiednio 7,2 mg g-1 i 5,2 mg g-1) [Prasad i wsp. 2011]. W kulturze pędowej
Narcissus confusus Pugsley sacharoza w stężeniu 90 mg g-1 powodowała wydzielanie do pożywki podwyższonych ilości galantaminy [Sellés i wsp. 1997].
Wpływ ekstraktu drożdżowego (YE) na podwyższenie akumulacji metabolitów wtórnych w kulturach in vitro
Elicytory grzybowe to homogenaty lub filtraty z kultur różnych gatunków grzybów, będących patogenami roślin. Ich wpływ na komórki roślinne może być różny, w większości przypadków stymulują uwalnianie metabolitów do pożywki. Aktywność elicytorowa ekstraktu drożdżowego z gatunku Saccharomyces cerevisiae została wykazana dla wielu kultur roślinnych. Stwierdzono, że substancją odpowiedzialną za tę aktywność jest obecny w ścianie komórek drożdży beta-(1->3,1->6)glukan. Sugerowany jest także udział frakcji oligoglukanowej ściany drożdży oraz mieszaniny glikoprotein z komórek drożdży. Przypuszcza się też, że obecne w ich komórkach jony cynku, wapnia i kobaltu działają jako elicytory abiotyczne.
85 Sześciodniowa elicytacja kultur korzeniowych D. burmanii ekstraktem drożdżowym w stężeniu 0,5 mg l-1
wpłynęła na 3,5-krotne podwyższenie stężenie plumbaginy w korzeniach rosiczki [Putalun i wsp. 2010]. Ekstrakt drożdżowy w stężeniach 0,5 g l-1 i 1,0 g l-1 wpływał na podwyższenie stężenia hioscyjaminy 1,28 i 1,05-krotnie oraz 1,6 i 1,28-krotnie skopolaminy w kulturach korzeniowych Hyoscyamus niger L. [Hong i wsp. 2012]. W kulturach korzeniowych Scutellaria lateriflora L. YE o stężeniu 50 µg ml-1 podwyższył zawartość akteozydu 1,4-krotnie (7dni) i produkcję flawonów 1,7-krotnie (14 dni) [Wilczyńska-Barska i wsp. 2012]. Natomiast w kulturach in vitro całych roślin Centella asiatica (L.) Urban YE 1,41-krotnie podwyższał akumulację azjakozydu [Kim i wsp. 2004]. Zawartość glicyryzyny w kulturach korzeni transformowanych Glycyrrhiza inflata wzrosła 1,4-krotnie pod wpływem 7-dniowej elicytacji YE (1,0 mg ml-1) [Wongwicha i wsp. 2011].
Na skuteczność procesu elicytacji, oprócz rodzaju elicytora, wpływ mają także inne czynniki, jak gatunek rośliny, wybrana linia komórkowa, rodzaj kultury, stężenie elicytora i czas elicytacji.
W zależności od poziomu organizacji komórkowej (zawiesina komórek, kalus, kultura organów lub całych roślin) kultury różnią się odpowiedzią na czynniki stresowe, zawartość hormonów wzrostu i produkcją metabolitów wtórnych. Ponadto stan fizjologiczny komórek podlega zmianom na różnych etapach hodowli i z tego względu kultury wykazują odmienną aktywność obronną w różnych fazach wzrostu. Z reguły im wyższe stężenie elicytora, tym silniejsza odpowiedź komórkowa. Jednak produkowane metabolity po przekroczeniu pewnych stężeń mogą być toksyczne dla komórek, które je wytwarzają. Na odpowiedź komórkową w wyniku elicytacji ma wpływ stres biotyczny, o którego poziomie decyduje czas działania elicytora na komórki. Jeśli okres elicytacji będzie zbyt długi może nastąpić śmierć komórek [Szpitter, Królicka 2005; Goyal i wsp. 2012; Sharma, Shahzad 2013].
86