Metabolomika – przyszłość diagnostyki medycznej
3.1 Metodologia badań metabolomicznych
Każde badanie metabolomiczne składa się z kilku etapów, jednak w zależności od eksperymentu mogą być one modyfikowane. Bardzo ważnym elementem jest wykorzystanie innych dziedzin nauki takich jak chemia analityczna, biochemia i bioinformatyka. Próbki, biofluidy pochodzące od pacjentów (krew, mocz) mogą być poddawane analizie, na przykład za pomocą metody NMR, bez żmudnego uprzedniego przygotowania (np. użycia procesów ekstrakcji).
Natomiast podstawowy przebieg typowego eksperymentu metabolomicznego, w którym analizowane są hodowle komórkowe lub mikrobiologiczne, to w kolejności: zebranie materiału biologicznego, dezintegracja, ekstrakcja, pomiar NMR/MS, obróbka i analiza danych (Rys. 4.) (Varshavi i in. 2016).
Pierwszym i najważniejszym etapem każdego badania metabolomicznego jest zebranie materiału do analiz. Pochodzenie próbek, które mogą zostać poddane badaniu metabolomicznemu jest bardzo różnorodne – mogą to być zarówno płyny ustrojowe ludzi (krew, mocz, ślina), hodowle komórkowe, hodowle mikrobiologiczne, a nawet różnego rodzaju produkty spożywcze (tj. wina czy jaja). W tym sposobie analiz za każdym razem porównuje się dwie grupy próbek. Jedna grupa to grupa kontrolna/referencyjna (np. osoby zdrowe), a druga to grupa badana (np. osoby chore).
W przypadku analizy wewnątrzkomórkowych metabolitów niezbędnym etapem eksperymentu jest dezintegracja komórek. Polega ona na zniszczeniu błon i ścian komórkowych, w celu uzyskania zawartości. Istnieje wiele metod dezintegracji (np. dezintegracja mechaniczna, chemiczna, sonifikacja). Dobranie prawidłowej metody dezintegracji pozwala na uzyskanie wysokich stężeń metabolitów wewnątrzkomórkowych. W przypadku analiz metabolitów zewnątrzkomórkowych etap ten jest pomijany Co więcej istotny wpływ na jakość wyników ma odpowiednio dobrana metoda ekstrakcji. W zależności od potrzeb można analizować grupy
metabolitów – np. polarne lub niepolarne, albo rozdzielić grupy związków, którą chcemy pominąć w naszym eksperymencie. (Kosmides i in. 2013; Varshavi i in. 2016).
Rys. 4. Metodologia badań metabolomicznych (Varshavi i in. 2016).
Podstawowymi metodami pomiarowymi wykorzystywanymi w badaniach metabolomicznych są spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR – ang. nuclear magnetic resonance) oraz spektrometria mas (MS – ang. mass spectrometry).
NMR jest to technika spektroskopowa, w której wykorzystuje się zjawisko rezonansu magnetycznego wybranych jąder. Pomiary za pomocą metody NMR pozwalają uzyskać informacje o strukturze związku. Najpowszechniej wykorzystywane są pomiary jednowymiarowe jąder 1H i 13C, jednak w celu zaawansowanych analiz wykonuje się pomiary typu 2D. Każdy sygnał posiada charakterystyczne parametry, które zawierają informacje o strukturze cząsteczki. Są to: przesunięcie chemiczne, multipletowość, stała sprzężenia oraz integrację. Każdy z nich wpływa na jakość i wygląd sygnałów i musi być uwzględniony przy analizie i identyfikacji związków (Hemminga i Visser 2000).
MS jest zaliczana do metod spektrometrycznych. Podstawą tej techniki jest pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego jonów. Każda próbka poddawana jest jonizacji przy użyciu odpowiedniej techniki (np. jonizacja chemiczna, jonizacja elektronowa, elektrorozpylanie etc.), a następnie analizowana za pomocą analizatora mas (np. czasu przelotu, pułapki jonowej, analizatora kwadrupolowego, etc.), skąd trafia do odpowiedniego detektora Ze względu na identyfikację mieszanin związków, bardzo ważne jest zastosowanie technik rozdziału substancji. Z tego powodu MS jest najczęściej połączona jest z chromatografią gazową (GC – ang. gas chromatography) lub cieczową (LC – ang. liquid chromatography). Jest to metoda bardzo czuła (możliwe oznaczenia związków na poziomie nanomolowym) i bardzo wydajna (Domon i Aebersold 2006)
Każda z wymienionych metod ma swoje wady i zalety, dlatego bardzo ważne jest wykorzystanie obu i stworzenie badań komplementarnych, co pozwala na dokładniejsze analizy. Obie metody mają zastosowanie zarówno w jakościowej jak i ilościowej analizie metabolomu i stanowią nawzajem się uzupełniają (Markley i in. 2017).
W celu eliminacji błędów, w każdym eksperymencie stosuje się standaryzację. Jednakowe przygotowywanie próbek, takie samo pH, stężenie wzorca i buforu, waga lub objętość badanego materiału oraz temperatura, te parametry mają ogromne znaczenie i wpływają na powtarzalność
wyników. Jest to niemiernie ważny element, ponieważ pozwala na otrzymanie wiarygodnych wyników oraz ułatwia analizę i interpretację różnic pomiędzy grupami (Varshavi i in. 2016).
Analiza i obróbka danych wymaga wykorzystania metod bioinformatycznych i statystycznych oraz odpowiednich baz danych. Bardzo przydatne mogą być programy, których funkcje są ciągle rozwijane, dzięki czemu mogą być bardziej praktyczne. Informacje zawarte w bazach danych mogą być niezbędne do analizy sygnałów – to właśnie na ich podstawie często rozstrzyga się jakości identyfikacji konkretnego związku. Najbardziej powszechną bazą danych pomocną w analizie badań metabolomicznych jest The Human Metabolome Database (HMDB), w której znajdziemy informację o właściwościach fizykochemicznych związków, a także przykładowe widma NMR czy MS (Wishart i in. 2013).
W celu identyfikacji potencjalnych biomarkerów oraz wizualizacji danych wykorzystuje się metody statystyczne oraz chemometryczne. Podstawową metodą chemometryczną, która jest podstawą dalszych analiz jest analiza głównych składowych (PCA). Jest to metoda nienadzorowana, która pozwala na identyfikację różnic we wszystkich obserwowanych próbkach. Służy ona znalezieniu relacji pomiędzy grupami oraz metabolitów różnicujących obie grupy. W celu opracowania dokładniejszych modeli stosuje się dwie inne metody – metoda częściowych najmniejszych kwadratów (PLS) oraz ortogonalna metoda najmniejszych kwadratów (OPLS). Obie metody są przykładem metod nadzorowanych, które pozwalają na dyskryminację próbek w oparciu o dodatkowy parametr (jakim może być np. wiek, płeć, stan choroby) oraz pozwalają na znalezienie istotnych biomarkerów (Worley i Powers 2013).
3.2 Metabolomika a diagnostyka medyczna
Równowaga układu biologicznego jest wyznacznikiem jego prawidłowego funkcjonowania.
To właśnie zaburzenia homeostazy organizmu są początkiem zaburzeń i rozwoju procesu chorobotwórczego. Wykrycie choroby przed pojawieniem się widocznych objawów daje ogromną szansę na skuteczne leczenie.
Rozwój choroby może być związany z uwarunkowaniami genetycznymi, jednak to pojawianie się objawów daje bodziec skłaniający do przeprowadzenia badań. Konsultacje i rozpoznanie choroby to proces wymagający wielu testów diagnostycznych, badań oraz wizyt u lekarzy, dlatego przyjęcie do szpitala i wdrożenie leczenia to proces długotrwały, który może zajmować nawet 10-15 lat. W tym czasie objawy choroby nasilają się, sama choroba się rozwija, co więcej pojawiają się choroby towarzyszące, a szanse na wyleczenie maleją (Rys. 5.). Podstawowe markery diagnostyczne pełnią swoją funkcję w momencie zaobserwowania pierwszych symptomów choroby i mogą służyć w podstawowej oraz zaawansowanej diagnostyce medycznej (Słowikowska i in. 2016).
Rys. 5. Schemat przebiegu choroby z zaznaczonymi markerami (Bujak i in. 2015).
Podstawą do oceny możliwości choroby mogą być cechy metabolomiczne. Są to wszystkie zmiany, które występują w organizmie, jednak są bezobjawowe. Jeżeli rozpoznanie choroby nastąpi w momencie początku rozwoju stanu patologicznego, wdrożenie leczenia nastąpi szybciej, tym samym będzie bardziej skuteczne, a być może nawet niepotrzebne (np. skreening osób z grup ryzyka), ponieważ niektórym chorobom można zapobiegać poprzez różnego rodzaju zmiany takich czynników jak dieta lub tryb życia (Bujak i in. 2015, Słowikowska i in. 2016).
Wykorzystanie analiz metabolomu ma wiele zalet. Najważniejszą jest możliwość bardzo szybkiego zdiagnozowania. Samo badanie jest badaniem szybkim i tanim, co zwiększa jego szansę na wdrożenie do ogólnej diagnostyki pacjentów. Dodatkowo po dokładnym opracowaniu protokołów i sposobów analizy danych metoda ta może być w pełni zautomatyzowana i wysokoprzepustowa.
Ogromną zaletą jest nieinwazyjność – pobieranie od pacjentów próbek krwi, moczu czy śliny, nie stanowi żadnego zagrożenia i jest stosunkowo łatwym procesem pobierania materiału biologicznego.
Metoda ta może być wykorzystywana również w medycynie personalizowanej, gdzie leczenie jest dobierane pod indywidualnego pacjenta, z uwzględnieniem chorób towarzyszących (Johnson, Ivanisevic i Siuzdak 2016).
4. Podsumowanie
Badania metabolomiczne są innowacyjną technologią, która ma ogromne szanse na wykorzystanie w wielu dziadzinach nauki takich jak biologia, medycyna i wielu innych. Bardzo ważne jest spojrzenie na analizę danych z wielu stron – to właśnie część badań nad metabolomem i widocznymi zmianami w komórkach, tkankach czy całych organizmach daje szansę na uzupełnienie wiedzy zdobytej wcześniej dzięki genomice, transkryptomice czy proteomice. Złożoność procesów jakie zachodzą w każdej komórce jest tak ogromna, że tylko dzięki kompleksowym badaniom jesteśmy w stanie pogłębiać wiedzę. Metabolomika może stać się istotnym elementem współczesnej medycyny i diagnostyki medycznej.
5. Literatura
Armitage EG, Barbas C, Metabolomics in cancer biomarker discovery: Current trends and future perspectives, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 87: 1-11.
Bujak R, Struck-Lewicka W, Markuszewski M i in. (2015) Metabolomics for laboratory diagnostics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 113: 108–120.
Domon B, Aebersold R (2006) Mass Spectrometry and Protein Analysis. Science 312(5771): 212–
217.
Fairfax MR, Bluth MH, Salimnia H (2018) Diagnostic Molecular Microbiology: A 2018 Snapshot. Clinics in Laboratory Medicine 38(2): 253–276.
Fiehn O. (2001) Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks, Comparative and Functional Genomics 2(3): 155-168 Hemminga MA, Visser J (2000) NMR in Biotechnology. Journal of Biotechnology 77(1): 1–3.
Horning EC, Horning MG (1971) Human metabolic profiles obteined by GC and GC/MS, Journal of Chromatography Science 9: 129-140.
Johnson CH, Ivanisevic J, Siuzdak G (2016) Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology 17(7): 451–459.
Kosmides AK, Kamisoglu K, Calvano SE i in. (2013) Metabolomic fingerprinting: challenges and opportunities. Critical Reviews in Biomedical Engineering 41(3): 205–221.
Liu X, Locasale JW (2017) Metabolomics: A Primer. Trends in Biochemical Sciences 42(4): 274–
284.
Markley JL, Brüschweiler R, Edison AS i in. (2017) The future of NMR-based metabolomics.
Current Opinion in Biotechnology 43: 34–40.
Nicholson JK, Lindon JC (2008) Systems biology: Metabonomics. Nature 455(7216): 1054–1056.
Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E (1999) Metabonomics: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data, Xenobiotica 29(11): 1181-1189.
Oliver SG, Winson MK, Kell DB i in. (1998), Systematic functional analysis of the yeast genome, Trends in Biotechnology, 16(9): 373-378.
Patti GJ, Yanes O, Siuzdak G (2003) Metabolomics: the apogee of the omic triology NIH Public Access. Nature Rebiews Molecular Cell Biology 13(4): 263–269.
Słowikowska A, Toczyłowska B, Cichoń R i in. (2016) Metabolomika — chemiczny „odcisk palca”
i istotny element medycyny spersonalizowanej. Folia Cardiologica 11(4): 353–358.
Stobiecki M (2009) Metabolomika - narzédzie w genomice funkcjonalnej i biologii systemów.
Biotechnologia (2): 54–64.
Varshavi D, Shephard EA, Kyriakides M i in. (2016) A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural
Biotechnology Journal 14: 135–153.
Wishart DS, Jewison T, Guo AC i in. (2013) HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Research 41: 801-807.
Worley B, Powers R (2013) Multivariate Analysis in Metabolomics. Current Metabolomics 1(1):
92–107.