METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ANTYOKSYDACYJNEJ

Do oznaczania aktywności antyoksydacyjnej flawonoidów stosowane są me­ tody oparte na różnych zasadach i określające różne właściwości badanych związ­ ków [7], Do porównania efektywności pojedynczych antyoksydantów, a także do oceny „pojemności” antyoksydacyjnej produktów o złożonym składzie, np. napo­ jów czy ekstraktów roślinnych, często wykorzystywane są metody określające sto­ pień zmiatania trwałych syntetycznych rodników: DPPH* (l,l-difenylo-2-pikrylo- hydrazyl), ABTS+‘ (kwas 2,2'-azynobis-(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy)) i DMPD* (dihydrochlorek N, W-dimetylo-p-fenylenodiaminy). Jednakże z punktu widzenia oceny aktywności antyoksydacyjnej badanych związków, w aspekcie prozdrowotnym, bardziej wiarygodne wydają się metody oparte na pomiarze efek­ tywności zmiatania rodników hydroksylowych ‘OH albo anionorodnika

ponad-994 J. WILSKA-JESZKA, A. PODSĘDEK.

tlenkowego 0 2" , powstających w organizmie człowieka. Podstawowe informacje o niektórych często stosowanych metodach podano w tab. 2.

Tabela 2. Metody oznaczania aktywności antyoksydacyjnej Rodnik

[Lit.] ^{Układ generujący Środowisko Metoda detekcji}

ABTS+* [8] metmioglobina/H202 nadsiarczan potasu bufor pH 7,4 etanol spektrofotometryczna DMPD* [9]

jony żelaza(III) bufor pH 5,2 spektrofotometryczna

DPPH‘

[10]

metanol, etanol spektrofotometryczna

o - ,-[11] ksantyna/oksydaza ksantynowa bufor pH 7,4-8,3 spekrrofotometryczna chemiluminescencj a polarografia “OH [12] jony żelaza(II)/H202 fotoliza H20 2 pr. UV woda spektrofotometryczna HPLC

Ze względu na to, że głównym miejscem ataku RFT w organizmie są niena­ sycone kwasy tłuszczowe, wchodzące w skład struktur lipidowych, opracowano również wiele metod oznaczania efektywności flawonoidów jako czynników ha­ mujących procesy autooksydacji lipidów. Stosowane są różne układy modelowe: emulsje kwasu linolowego [13, 14], liposomy [14-16], niskocząsteczkowe lipo- proteiny [14, 16, 17] oraz błony erytrocytame [15, 18]. Reakcje prowadzone są najczęściej w buforach o pH 7,4 w obecności jonów żelaza lub miedzi jako kata­ lizatorów. Przebieg procesu utleniania lipidów jest kontrolowany przez pomiar stężenia sprzężonych dienów, heksanalu lub dialdehydu malonowego.

Przy wyborze metody oznaczania i ocenie wyników trzeba brać pod uwagę fakt, że efektywność antyoksydacyjna flawonoidów zależy od ich polamości, stopnia dysocjacji oraz od trwałości w środowisku reakcji badanego związku i powstających rodników.

STRUKTURA

A AKTYWNOŚĆ ANTYOKSYDACYJNA FLAWONOIDÓW

Rola antyoksydantów w hamowaniu procesów oksydacyjnych zachodzących w organizmach żywych, a także w produktach spożywczych może polegać na:

• zmiataniu wolnych rodników i wygaszaniu tlenu singletowego, • przerywaniu, czyli terminacji reakcji rodnikowych,

• wiązaniu metali katalizujących procesy utleniania, • inhibicji enzymów z grupy oksydaz.

Flawonoidy są aktywne we wszystkich wymienionych procesach, ale ich efektywność w tych reakcjach zależy od bardzo wielu czynników.

Efektywność zmiatania wolnych rodników i przerywania łańcucha reakcji ro­ dnikowych zależy głównie od występowania w pierścieniu B flawonoidów przy­ najmniej dwóch grup o-hydroksylowych, gdyż umożliwia to tworzenie się intra- molekulamego wiązania wodorowego między tymi grupami, co zwiększa stabil­ ność rodników fenoksylowych [19].

Istotny wpływ ma również obecność podwójnego wiązania w pozycji 2-3, sprzężonego z grupą karbonylową w pozycji 4. Taka konfiguracja umożliwia de- lokalizacje elektronów pomiędzy pierścieniami i przez efekt rezonansowy zwiększa stabilność rodników. Z punktu widzenia zdolności do wiązania metali istotne jest występowanie grup hydroksylowych przy C-3 i C-5 oraz grupy kar- bonylowej w pozycji 4. Taki układ umożliwia chelatowanie metali w pięcio- lub sześcioczłonowych pierścieniach.

W zakresie inhibicji enzymów flawonoidy mogą działać jako kompetycyj- ne lub niekompetycyjne inhibitory. Cotelle i in. [20] stwierdzili, że 7-hydroksy- flawony są silnymi kompetycyjnymi inhibitorami oksydazy ksantanowej, a ich działanie polega prawdopodobnie na tym, że w centrum aktywnym enzymu za­ stępują hydroksyksantynę. Z punktu widzenia prozdrowotnej aktywności flawo­ noidów ważne jest ich działanie inhibicyjne w stosunku do 15-lipoksygenazy - enzymu katalizującego utlenianie LDL. Terao i in. [21] stwierdzili, że najwięk­ szą skuteczność inhibicyjną wykazywała kwercetyna, niewiele mniejszą 3- i 7- -glukozydy, natomiast glukozylacja grupy hydroksylowej w pozycji 4' powodo­ wała trzykrotny spadek aktywności inhibicyjnej. Dobrymi inhibitorami 15-lipo­ ksygenazy są także, wyizolowane ze skórek pomarańczy, zmetoksylowane fla- wony, przy czym o ich aktywności decydowało miejsce metoksylacji, a nie licz­ ba grup —OCH3 [22].

Aktywność antyoksydacyjna związków flawonoidowych była wielokrotnie przedmiotem badań, ale duże różnice w metodyce oraz w sposobie przedstawie­ nia wyników utrudniają obiektywną ocenę efektywności antyoksydacyjnej po­ szczególnych związków. Dla przykładu w tab. 3 zestawiono strukturę kilkunastu związków z różnych grup oraz ich aktywność antyoksydacyjną, oznaczaną przez autorów stosujących inne metody badania i inny sposób wyrażania wyników.

Wartość współczynnika IC50 oznacza ilość związku potrzebną do 50% reduk­ cji stężenia produktów utleniania LDL, a więc im niższa liczba, tym wyższa ak­ tywność antyoksydacyjna. Wartość TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capa­

city’) natomiast wyraża liczbę milimoli Troloxu (pochodna tokoferolu rozpu­

szczalna w wodzie) odpowiadającą aktywności 1 milimola badanego związku w reakcji zmiatania rodników ABTS. Im wyższa wartość TEAC, tym większa efektywność antyoksydacyjna związku.

Porównując wartości IC50 dla flawonoidów o różnej strukturze można zau­ ważyć, że istotny wpływ na aktywność antyoksydacyjną ma obecność w pierście­ niu B grup orto-dihydroksy przy C3' i C4\ Np. katechina, kwercetyna i

cyjani-996 J. wilska-jeszka. a. podse.dek

Tabela 3. Porównanie aktywności antyoksydacyjnej flawonoidów [17, 23]

Związek Pozycja grup —OH IC50 [pM] TEAC [mM]

Flawan-3-oIe _4,9 Galusan epikatechiny 5,7,3',4', 3",4",5" 0,07 4,8 Galusan epigalokatechiny 5,7,3',4',5'. 3".4",5" 0,10 3,8 Epigalokatechina 3,5,7,3',4', 5' _2,5 Epikatechina 3,5,7,3',4' 0,18 2,4 Katechina 3,5,7,3',-4' Flawon-3-ole 0,22 4.7 Kwercetyna 3,5,7,3', 4' 0,51 2,4 Rutyna 5,7,3',4' 3,1 Mirycetyna 3,5,7,3',4',5' _{1 3} Kempferol 3,5,7,4' Flawanony > 16 1,5 Naringenina 5,7,4' 1 4 Hesperetyna 5.7,3' > 16 1 1 Hesperydyna 5,3' Antocyjany _{4 4} Delfinidyna 3,5,7,3',4',5' 0 21 4 4 Cyjanidyna 3,5,7,3',4' 1 3 Pelargonidyna 3,5,7,4' 0 95 ? 1 Malwidyna 3,5,7,4'

dyna, związki o różnej strukturze pierścienia C, ale identycznym usytuowaniu w cząsteczce grup hydroksylowych, wykazują zbliżone, niskie wartości IC50 (0,18-0,22 pM), co wskazuje na ich relatywnie wysoką aktywność antyoksyda- cyjną, ok. 10 razy wyższą niż dla kwasu askorbinowego. Natomiast występujące w owocach cytrusowych flawanony - hesperydyna i naringenina, które w pier­ ścieniu B mają tylko jedną grupę hydroksylową i nie mają podwójnego wiązania w pierścieniu C, wykazywały w tym teście wielokrotnie niższą aktywność (IC50 ok. 100-krotnie wyższe).

Aktywności antyoksydacyjne tych samych związków, oznaczane metodą z ABTS i wyrażone jako TEAC, są mniej zróżnicowane, ale ogólne tendencje są takie same. Wysoką efektywność zmiatania kationorodników ABTS (TEAC 4,5-4,9 mM) wykazywały galusany epikatechiny, kwercetyna i cyjanidyna, a niską (1,1-1,5 mM) flawanony.

Ciekawe są wyniki badań aktywności antyoksydacyjnej flawan-3-oli. Jest to grupa flawonoidów występujących w wielu gatunkach owoców i w nasionach ro­ ślin strączkowych, ale szczególnie bogate we flawanole są herbata oraz czerwo­ ne wino [24-26].

Charakterystyczną cechą struktury flawan-3-oli jest brak podwójnego wiąza­ nia między C2 a C3 i tlenu przy C4 oraz występowanie dwóch centrów asyme­ trii przy C2 i C3. Poza tym, w odróżnieniu od flawonoli, flawanole nie występu­ ją w formie glikozydów, ale tworzą oligomery i polimery nazywane

proantocy-janidynami lub taninami skondensowanymi, w których cząsteczki katechin połą­ czone są wiązaniami C4—C8 lub rzadziej wiązaniami C4—C6 (rys. 3).

OH _OH R i = H ( + )k a te c h in a R , = O H (+ )g a lo k a te c h in a OH R i = H (-)e p ik a te c h in a R , = O H ( -)e p ig a lo k a te c h in a OH p ro c y ja n id y n a B 2 e p ik a te c h in o ( 4 P -8 ) e p ik a te c h in a p ro c y ja n id y n a B 5 e p ik a te c h in o (4 P -6 )e p ik a te c h in a Rys. 3. Wzory strukturalne monomerów i dimerów flawan-3-oli

Nanjo i wsp. [27], badając efektywność monomerów flawanoli jako zmiata- czy rodników DPPH\ stwierdzili, że ich aktywność antyoksydacyjna nie zależy od struktury przestrzennej, natomiast estryfikacja kwasem galusowym grupy OH przy C3 ok. 2 razy podwyższa aktywność antyoksydacyjną. W przypadku reak­ cji utleniania lipoprotein galusan epigalokatechiny był jedynie o 20% lepszym inhibitorem w porównaniu z epigallokatechiną [17].

Zależność między strukturą przestrzenną a aktywnością antyoksydacyjną fla­ wanoli w stosunku do anionorodnika ponadtlenkowego badali Saint-Cricq de Gaulejac i in. [11]. Stwierdzili oni, że (-)epikatechina (2R : 3R) ma wyższą ak­ tywność antyoksydacyjną niż (+)katechina (2R : 35). Badania Plumba i in. [28] natomiast, w których efektywność antyoksydacyjną katechin i proantocyjanidyn oznaczano na podstawie ich zdolności do opóźniania peroksydacji lipidów w mo­ delowych układach liposomów, dały wyniki odwrotne - katechina wykazywała wyższą aktywność niż epikatechina.

998 J. WILSKA-JESZKA, A. PODSĘDEK

W oligomerach flawanoli istotne znaczenie ma nie tylko skład, ale i sposób wiązania monomerów, decydujący o strukturze przestrzennej. Procyjanidyny z serii B5 do B8, w których cząsteczki katechin połączone są wiązaniem C 4 -C 6 wykazywały wyższą aktywność niż częściej występujące w roślinach procyjani­ dyny BI do B4, w których cząsteczki katechin połączone są wiązaniami C 4-C 8. Autorzy [11] tłumaczą to bardziej zwartą strukturą dimerów, w których występu­ je wiązanie C4—C8 (rys. 4).

Rys. 4. Wpływ struktury przestrzennej flawanoli na efektywność zmiatania anionorodnika ponad-tlenkowego

Ci sami autorzy wykazali również, że efektywność zmiatania rodników 0 2 ‘ przez oligomery procyjanidyn rośnie od monomeru do tetrameru, a powyżej spa­ da ze wzrostem stopnia polimeryzacji. Jest to o tyle ważne, że w owocach flawa- nole występują głównie jako proantocyjanidyny.

SKŁAD I AKTYWNOŚĆ ANTYOKSYDACYJNA FLAWONOIDÓW