Metody wykrywania GMO

Oznaczenia jakościowe i ilościowe elementów transgenicznych przeprowadza się dwoma metodami – poprzez analizę kwasu nukleinowego oraz analizę białkowych produktów ekspresji transgenu. Zastosowanie danej metody zależy od stopnia przetworzenia badanej próby i przewidywanego stanu kwasów nukleinowych i białek. Metody wykrywania organizmów zmodyfikowanych genetycznie opierają się na detekcji sekwencji

54

regulatorowych – promotora i terminatora, markerów selekcyjnych oraz sekwencji kodujących [113].

4.2.13.2.1. Metody oparte o analizę DNA

Bezpośrednią metodą detekcji GMO jest wykrywanie obecności zmodyfikowanego DNA. Obecnie najczęściej wykorzystywaną metodą analizy jakościowej opartą o analizę DNA jest reakcja PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy, ang. polymerase chain reaction) [114]. Reakcja ta jest bardzo czuła i umożliwia wykrycie nawet śladowych ilości DNA w analizowanej próbce żywności. Efektywność reakcji PCR zależy od jakości i czystości DNA wykorzystanego w reakcji. Przydatność DNA do testów ograniczona jest wielkością fragmentów i stopniem uszkodzenia cząsteczek, zależnym od ekspozycji na wysoką temperaturę, niskie pH, działaniem nukleaz i wynika ze stopnia przetworzenia żywności [115]. Reakcja PCR umożliwia selektywną amplifikację in vitro poszczególnych fragmentów DNA. W krótkim czasie uzyskuje się powielenie ponad milion razy fragmentu genu, który w genomie występuje w jednej kopii [116].

W przypadku pozytywnego wyniku analizy jakościowej kolejnym etapem badania jest analiza ilościowa. Najczęściej wykorzystywaną metodą oceny ilościowej GMO jest PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR, RT-PCR), która pozwala na monitorowanie reakcji w czasie, w którym ona rzeczywiście zachodzi. Ilość syntetyzowanego produktu podczas reakcji PCR jest mierzona poprzez detekcję sygnału fluorescencji, powstałego jako produkt specyficznej amplifikacji. Intensywność sygnału fluorescencji jest proporcjonalna do ilości produktu reakcji [117].

Zawartość GMO w próbce może być wyrażona jako ilość materiału genetycznie zmodyfikowanego w stosunku do całkowitej ilości materiału. Przy określaniu tej wartości konieczne jest określenie ilości sekwencji endogennego genu referencyjnego, specyficznego dla rośliny, np. lektyny dla soi i inwertazy lub zeiny dla kukurydzy. W praktyce przeprowadza się więc dwie równoległe reakcje PCR – jedna dla genu charakteryzującego analizowane GMO i druga dla genu referencyjnego. Wyliczony w ten sposób procent GMO wyrażony jest następująco [118]:

55

Strategie detekcji GMO oparte o reakcję PCR zależą od posiadanej informacji na temat wprowadzonego transgenu – jego sekwencji i struktury konstruktu i mogą być podzielone na cztery grupy ze względu na poziom specyficzności testu [119]. Każda grupa specyficzności związana jest z typem fragmentu DNA, który jest amplifikowany w reakcji. Najmniej specyficzną metodą, dającą wstępną informację, jest metoda screeningowa (ang. screening

metod), dotycząca detekcji sekwencji regulatorowych DNA. Metoda najczęściej obejmuje

detekcję promotora P-35S, pochodzącego z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) i terminatora T-nos z Agrobacterium tumefaciens, elementów konstruktu najszerzej wykorzystywanych do transformacji. Wynik tego badania wskazuje jedynie na obecność w analizowanej próbce DNA pochodzącego z rośliny GM, ale nie dostarcza informacji jaki jest to rodzaj modyfikacji [120]. Drugi poziom specyficzności to metoda PCR specyficzna dla genu (ang. gene-specific

method). Przykładem jest gen Bt lub gen EPSPS. Metoda ta dostarcza informacji o rodzaju

modyfikacji badanego GMO, ale nie wyjaśnia czy dane GMO jest autoryzowane czy nieautoryzowane. Metody powyższe bazują na wykrywaniu sekwencji występujących naturalnie, co może zwiększać ryzyko otrzymania fałszywie pozytywnych wyników analizy. Trzeci poziom specyficzności dotyczy metody specyficznej dla konstruktu (ang.

construct-specific method), opartej na wykrywaniu połączenia sekwencji promotora i genu

funkcjonalnego. Wynik analizy nie powinien dawać pozytywnie fałszywych wyników, ponieważ połączenie obu sekwencji nie występuje w przyrodzie naturalnie. Jednak różne GMO mogą zawierać te same elementy (promotor i gen). Najwyższy poziom specyficzności cechuje metodę PCR specyficzną dla zdarzenia transformacyjnego (ang. event-specific

method), opartą na detekcji regionów granicznych – połączenia pomiędzy sekwencjami DNA

insertu i DNA komórki gospodarza. Sekwencje połączenia są unikatowe i charakterystyczne dla danego GMO [115, 121] .

Detekcja i oznaczenia ilościowe posiadają ograniczenia. Limit detekcji i limit oznaczenia ilościowego są definiowane jak najmniejsza ilość, która może być w sposób wiarygodny wykryta i oznaczona ilościowo. Wielkości te zależą od metody analizy i analizowanej próbki. Można wyróżnić 3 typy limitów detekcji i oznaczenia ilościowego:

limit absolutny (ang. absolute limit) dotyczy metody PCR i oznacza najmniejszą liczbę kopii sekwencji wykrywanego DNA, która musi być obecna w analizowanej próbce na początku pierwszego cyklu reakcji PCR, aby otrzymać prawdopodobieństwo prawidłowego wyniku detekcji i oznaczenia ilościowego na poziomie co najmniej 95%, limit względny (ang. relative limit) oznacza najmniejszy względny udział procentowy GMO w próbce, który jest wykrywalny i możliwy do oznaczenia ilościowego,

56

limit praktyczny (ang. practical limit) tj. limit zależny od analizowanej próbki (ilości DNA w próbce) i limitu absolutnego, dotyczącego metody PCR [119, 122].

Obecnie światowa baza zawiera ponad 100 GMO, autoryzowanych przez kompetentne jednostki, do wykorzystania w celach żywieniowych i paszowych, w większości przypadków na etapie doświadczeń. Dane dotyczące modyfikacji genetycznych są opatentowane, a przez to jawne. Ponadto dopuszczenie do komercjalizacji w UE wymaga dostarczenia wzorca DNA dla ENGL.

Tylko niewielka liczba GMO jest skomercjalizowana i obecna w produktach żywnościowych na rynku światowym. Niektóre dane są zamieszczone w publicznie dostępnych bazach danych np. bazy Agbios, EMBL, NCBI [119].

4.2.13.2.2. Metody oparte o analizę białka

Początki wykorzystania metod immunometrycznych w badaniach żywności przypadają na lata siedemdziesiąte XX wieku. Metody te rozwinęły się dzięki dużej selektywności i czułości detekcji. Do analizy wykorzystuje się przeciwciała i ich fragmenty, które tworzą specyficzne wiązanie z antygenem, którym jest białko syntetyzowane przez wprowadzony gen. Technologia produkcji przeciwciał monoklonalnych pozwoliła na hodowlę in vitro pojedynczych klonów, co w konsekwencji stworzyło możliwości produkcji chemicznie identycznych przeciwciał o określonej specyficzności i powinowactwie w stosunku do antygenów spotykanych w żywności [123]. Metody oparte o analizę białek wykorzystuje się w oznaczeniach ilościowych i jakościowych.

Metoda ma ograniczone zastosowanie w przypadku wysoko przetworzonej żywności, ze względu na denaturację białka. Ponadto metoda ta nie znajduje zastosowania w przypadku, gdy zmodyfikowany gen jest nieaktywny w komórkach, które stanowią analizowaną próbkę, bądź białko nie osiąga wystarczająco wysokiego poziomu ekspresji, umożliwiającego jego wykrycie. Ponadto metoda ta nie może być wykorzystana do rozróżnienia pomiędzy GMO autoryzowanym a nieautoryzowanym, w przypadku ekspresji tego samego białka [119]. Najczęściej wykorzystywanymi metodami opartymi o analizę białek są: ELISA i paski z przepływem bocznym.

Najczęstszą metodą immunometryczną wykorzystywaną w wykrywaniu i ocenie nowych białek produkowanych przez rośliny GM jest metoda ELISA (ang. Enzyme Linked

Immuno Sorbent Assay). W metodzie tej badaną próbę dodaje się do podłoża z przeciwciałem.

57

enzymu przekształcającego bezbarwny lub niefluoryzujący substrat w barwny lub fluoryzujący produkt. Ilość związanego przeciwciała, a więc ilość białkowego antygenu wyznaczana jest przez określenie intensywności powstającej barwy lub fluorescencji [124].

Metoda detekcji GMO wykorzystująca paski z przepływem bocznym (wyłącznie detekcja jakościowa) opiera się na zastosowaniu membrany z przeciwciałami. W trakcie przeprowadzania analizy antygeny – białka, będące produktem ekspresji wprowadzonego genu łączą się z kompleksem przeciwciało-odczynnik barwny. Membrana posiada dwie strefy wychwytywania kompleksów. Jedna wiąże kompleks antygen-przeciwciało-odczynnik barwny, druga ukazuje się na pasku jako prążek kontrolny, informujący o prawidłowym przeprowadzeniu analizy. Strefy wiązania antygenu i tworzenia kompleksu widoczne są na membranie jako czerwone prążki. Pojawienie się na pasku obu prążków informuje o pozytywnym wyniku, czyli obecności GMO w analizowanej próbce [115].

Testy paskowe są łatwe i szybkie w użyciu, mogą być wykorzystywane przez niewykwalifikowany personel, również poza laboratorium. Próbka przeznaczona do badania jest rozcierana i miksowana z wodą lub buforem. W tym roztworze zanurzany jest pasek testowy, a wynik odczytywany po kilku minutach.

Pomimo zalet użytkowania, paski mają ograniczenia – ich czułość nie jest zbyt wysoka, znajdują zastosowanie głównie w przypadku analiz surowców takich jak nasiona i liście roślin GM. W produktach żywnościowych i paszowych ich zastosowanie limitowane jest wystarczającą ilością składnika GM w próbce oraz właściwościami fizyko-chemicznymi białek. Paski można stosować tylko w przypadku konkretnych białek. Na rynku dostępne są testy służące do wykrywania białka CP4-EPSPS odpowiadającego za tolerancję na glifosat (Roundup), białka PAT/pat i PAT/bar odpowiadające za tolerancję na glufosynat (Liberty/BASTA) oraz białka Cry1A(b) i Cry9C z B.thuringiensis (Bt) związane z odpornością na omacnicę prosowiankę [125].

4.2.13.2.3. Biosensory

Obecnie stosowane metody analityczne są kosztowne i czasochłonne, poszukuje się więc metod alternatywnych. Wykorzystanie biosensorów stwarza możliwość szybkiej i taniej analizy materiału genetycznego [126]. Do tej pory jednak na rynku nie ma komercyjnych biosensorów do detekcji GMO. Biosensor to instrument analityczny zawierający biocząsteczkę, która spełnia rolę czujnika, będąca w kontakcie z fizykochemicznym przetwornikiem. Analiza z użyciem biosensora składa się z trzech etapów:

58

specyficzne rozpoznanie badanego związku i reakcja,

przekształcenie fizykochemicznego efektu reakcji w mierzalny sygnał za pomocą przetrwalnika,

wzmocnienie sygnału i jego rejestracja.

Biosensory mogą służyć do analiz jakościowych i ilościowych. Substancjami biologicznie czynnymi, selektywnie wiążącymi badaną substancję są enzymy (w czystej postaci, obecne w komórkach mikroorganizmów, w mitochondriach lub w tkankach roślinnych i zwierzęcych), przeciwciała, membranowe receptory białkowe, kwasy nukleinowe [127, 128]. Biosensory, w którym elementem biologicznym jest kwas deoksyrybonukleinowy to genosensory. Jednoniciowy DNA umieszcza się na stałym nośniku, pomiędzy DNA biosensora a DNA w analizowanym materiale następuje połączenie – hybrydyzacja odcinków komplementarnych. Proces hybrydyzacji zostaje zarejestrowany przez miernik dzięki wskaźnikom, które reagują na powstanie dwuniciowego DNA [127].