Znakowanie oligonukleotydów
Istnieją trzy sposoby znakow ania oligonukleotydów , które ilustruje rysunek 2:
A. Z nakow anie na 3 ’-końcu. Do 3 ’-końca oligonukleotydów (o długości 14-100 nukleotydów ) przy udziale term inalnej transferazy dodaw ana jest tylko 1 reszta
B. dodawanie ogonka na 3'-końcu
Rys. 2. Sposoby nieradioaktywnego znakowania oligonukleotydów (w g [20]): gwiazdką (*) oznaczono położenie pojedynczych reszt digoksygeninow ych
A. znakowanie na 3'-końcu
C. znakowanie na 5'-końcu
http://rcin.org.pl
128 E. W Y R O B A , J. W IEJAK, A. C Y W IŃ S K A , L. SU R M A C Z
ddU TP w yznakow ana digoksygeniną [DIG-ddUTP] (zastosow anie dideoksynukleo- tydu w tej reakcji uniem ożliw ia dołączanie następnych nukłeotydów ) (tab. 2). Sondy te zachow ują wysoki stopień specyficzności i m ogą być używ ane do hybrydyzacji znakow anych nukłeotydów i digoksygenino-11-dU TP. Pow staje ogonek zaw ierający w iele reszt digoksygeniny. Takie sondy są 10 razy bardziej czułe niż znakow ane na 3 ’-końcu, m ogą jednak daw ać niespecyficzne tło, np. jeżeli nie znakow anym nukleotydem użytym do reakcji jest dATP, sonda może m ieć pow inow actw o do regionów bogatych w T. Takie niespecyficzne sygnały m ogą być zm inim alizow ane przez zastosow anie różnych nie znakowanych nukłeotydów do reakcji tw orzenia ogonka lub przez prehybrydyzację z odpow iednim i sekw encjam i (np. poły dA) albo przez ścisłe dostosow anie warunków reakcji. Sondy znakow ane w ten sposób są odpow iednie do dośw iadczeń wym agających optym alnej czułości, takich jak hybrydyzacje typu Southern i N orthern [17].
M etody A. i B. um ożliw iają nieradioaktyw ne znakow anie konw encjonalnie zsyn- tetyzow anych oligonukleotydów .
C. Z nakow anie oligonukleotydów na 5 ’-końcu. W ykonyw ane jest przy użyciu estrów N H S-digoksygeniny. Oligonukleotydy są znakow ane przez dodanie DIG na 5 ’-końcu w dw uetapow ym procesie. Pierw szym etapem jest synteza
oligonu-http://rcin.org.pl
D IG O K SY G E N IN A - Z N A K O W A N IE SO N D M O L EK U L A R N Y C H 129
kleotydu z resztą am inow ą (A m inolink) na 5 ’-końcu. Po oczyszczeniu syntetycznego nukleotydu następuje drugi etap - tw orzenie wiązań kow alencyjnych m iędzy estrem N H S-digoksygeniny i 5 ’-końcow ą resztą am inow ą oligonukleotydu.
Sondy są specyficzne, m ają czułość porów nyw alną z sondam i znakow anym i na 3 ’-końcu i są odpow iednie do przeszukiw ania bibliotek genom ow ych i do t blot (tab. 2) [2].
Inną istotną cechą tak znakow anych sond jest wolny 3 ’-koniec, który m oże stać się starterem w reakcji syntezy DNA m etodą PCR. Ilość w yznakow anych sond je st 1000 razy w iększa niż przy znakowaniu na 3 ’-końcu. M ogą być one w ykryw ane i oczyszczane m etodą chrom atografii pow inow actw a z użyciem przeciw ciał anty- digoksygeninow ych [25].
Znakow anie kwasów nukleinowych
P rzem ieszczan ie pęknięć. Sondy DNA m ogą być znakow ane DIG m etodą p rze
m ieszczania pęknięć (nick translation). M etoda ta jest szczególnie korzystna w przypadku badań in situ, poniew aż wielkość pow stałych sond m oże być określana przez zm ianę m ieszaniny używ anych enzym ów (polim eraza I DN A i D N A -za I).
U zyskiw ane tą m etodą m ałe ilości zsyntetyzow anego produktu są w ystarczające w dośw iadczeniach in situ. O statnio w prow adzono gotowy do użycia roztw ór za
w ierający w szystkie składniki niezbędne do w ytw orzenia sond (2 00 -50 0 bp) zna
kow anych DIG, które są optym alne in situ. R oztw ór ten m oże być używ any w przypadku m atryc liniow ych i kołow ych włącznie z produktam i PCR [7].
W ydłużanie starterów (primer extension). M etoda polega na syntezie nici D N A kom plem entarnej do matrycy zaczynając od wolnej grupy 3-OH startera i je st p o lecana do enzym atycznej syntezy plazm idów i fragm entów DN A znakow anych DIG (rys. 3). M a ona przew agę nad innymi m etodam i, ponieważ:
- jest bardzo skuteczna, działa z różnym i typami DNA niezależnie od w ielkości cząsteczki i nie w ym aga DNA wysoko oczyszczonego;
w ym agana jest m ała ilość m atrycow ego DNA (10 ng);
w m etodzie tej starterowy DNA działa tylko jako m atryca, a reakcja znakow a
nia je st reakcją syntezy de novo.
W przypadku znakow ania DNA digoksygeniną stężenie nukleotydów nie je st czynnikiem ograniczającym (w przeciw ieństw ie do znakow ania radioaktyw nego), dlatego m ikrogram ow a ilość znakow anego DNA m oże pow stać z kilku nanogram ów m atrycow ego DNA. Ostatnio ulepszono warunki znakow ania DNA pochodnym i digoksygeniny, by poprawić skuteczność i niezaw odność tej reakcji. W szystkie w ym agane składniki, tj. nukleotydy, w tym DIG -dU TP, polim erazę K lenow a, he- ksanukleotydy i stabilizatory są przygotow ane w optym alnym dla reakcji buforze zaw ierającym 50% glicerol. Używ ając tej m ieszaniny znakującej, zwanej D IG
High-http://rcin.org.pl
130 E. W Y R O B A , J. W IEJAK, A. C Y W IŃ SK A , L. SU R M A C Z
zdenaturowane liniowe DNA służące jako m atryca do syntezy sondy
synteza znakow anego DNA - sondy przez polim erazę Klenowa przy użyciu startera, m ieszaniny dNTP i DIG-dUTP
hybrydyzacja
w iązanie przeciwciał anty-DIG połączonych z alkaliczną fosfatazą
Rys. 3. Znakowanie sondy D N A pochodną digoksygeniny (DIG-dUTP) metodą wydłużania startera i jej detekcja po hybrydyzacji typu Southern (w g [20])
Prime (B oehringer M annheim ), wym agane jest tylko jedno pipetow anie, a ilość otrzym anej sondy jest znacznie w iększa (1 -3 mg znakow anego DIG DNA w stand
ardowej reakcji znakowania).
badane DNA związane z biotem + sonda DNA
reakcja z substratem chem ilum inescencyjnym (np. CDP-Star)
starter DIG-dUTP
przeciwciało anty-DIG połączone z alkaliczną fosfatazą
http://rcin.org.pl
D 1 G 0K S Y G E N IN A - Z N A K O W A N IE SO N D M O L E K U L A R N Y C H 131
Z nakow anie m etodą w ydłużania startera m oże być stosowane po traw ieniu DNA - azą, która zm niejsza wielkość znakow anego DNA [7, 14].
Z nakow anie w trakcie reakcji PCR. DIG -dU TP może być także w budow yw any podczas am plifikacji DNA w trakcie reakcji łańcuchowej polim erazy (PCR). Zw ykle do syntezy czułych sond hybrydyzacyjnych wym agana jest duża ilość zw iązku znakującego, jak np. w m etodzie w ydłużania starterów. N atom iast sondy uzyskiw ane m etodą PCR m ogą być syntetyzow ane z minimalnej ilości m atrycow ego D N A i zaw ierają tylko oczekiw ane sekwencje bez sekwencji w ektorowych [12]. Zależnie od m atrycy w ydajność PCR może być obniżona wskutek w ysokiego stężenia DIG- dU TP, niem niej jednak jest ona w ystarczająca dla różnych typów hybrydyzacji.
Produkty PCR m ogą być rozdzielane na żelu, przenoszone na filtry i w ykryw ane przeciw ciałam i anty-D IG [1, 3, 4, 6, 8, 15, 24].
Z nakow anie RNA. Sondy RNA znakowane DIG są syntetyzow ane z wektorów plazm idow ych lub fagowych zawierających odpowiednie prom otory polim erazy RNA bakteriofaga SP6, T3 lub T7. Jest to najbardziej w ydajna m etoda enzym aty
cznego znakow ania. R eakcja transkrypcji in vitro z użyciem jednej z tych polim eraz RNA i m ieszaniny trifosforanów rybonukleozydów oraz D IG -U TP doprow adza do pow stania bardzo dużej ilości (1 0 -2 0 mg z 1 mg plazm idow ego DNA) R N A w yznakow anego DIG, podczas gdy znakow anie PCR lub m etodą w ydłużania startera daje 1-3 mg znakow anego DIG DN A w reakcji standardowej.
Sondy RNA znakow ane DIG wykazują znacznie w iększą czułość w m etodzie N orthern w porów naniu z sondami DNA. Ponadto sondy RNA dają lepszy sygnał w hybrydyzacji in situ z mRNA. Inną korzyścią jest m ożliw ość użycia znakow anego sensow nego R N A jako kontroli negatywnej [5, 7, 16].
Z nakow anie w ew nętrzne do sekw encjonow ania DNA . W znakow aniu tym stosuje się D IG -dA TP. M etoda ta wykorzystuje fakt, że nukleotydy purynow e są rzadziej w łączane przez niektóre polim erazy DNA niż pirym idynow e. I tak, w pierw szym etapie elongacji z użyciem polim erazy DNA T7 i określonych stężeń dN TP w budow yw ana jest tylko jedna reszta DIG -dATP, co prowadzi do pow stania produktów o identycznej masie cząsteczkow ej i jest wstępnym warunkiem pow stania drabinki sekw encyjnej [7].
Ilościow ość reakcji znakow ania. Bezpośredni pom iar ilościowy reakcji zn a
kow ania i pow stałego produktu nie jest możliwy. O cenę ilościową m ożna prze
prow adzić przez porów nanie z w yznakow anym DNA standardow ym . O statnio są dostępne ilościow e prążki DNA, które um ożliw iają szybsze określenie w zględnej ilości pow stałych kw asów nukleinow ych znakow anych DIG [7]. Ponadto dokonać m ożna porów nania stopnia w yznakow ania oligonukleotydów stosując elektroforezę na żelu poliakrylam idow ym i barw ienie brom kiem etydyny [23]: w yznakow any oligonukleotyd m igruje wolniej niż nieznakow any i jest wyraźnie widoczny [19].
O czyszczanie i stabilność sond. Sondy po wyznakow aniu DIG zasadniczo nie w ym agają oczyszczania i m ogą być bezpośrednio dodaw ane do reakcji hybrydyzacji
http://rcin.org.pl
132 E. W Y R O B A , J. W IEJAK, A. C Y W IŃ SK A , L. SU R M A C Z
oraz są stabilne naw et przez kilka lat przy odpowiednim przechow yw aniu. W y znakow ane oligonukleotydy m ożna oczyszczać na kolum ienkach chro m atog rafi
cznych typu B io-Spin 6 [18, 19, 23]. M ożliw ość syntezy dużej ilości znakow anych
D IG O K SY G E N IN A - Z N A K O W A N IE SO N D M O L EK U L A R N Y C H 133
2 ’-d eo x y u rid in e 5 'triphosphates and a photoactivatable analog o f d ig o x ig en in (p h o to d ig o x ig e- nin). Biol Chem H oppe-S eyler 1990; 371: 9 5 3 - 9 6 5 .
[1 5 ] P O W E L L EE, K R O O N PA . M easurem ent o f m R N A by quantitative PC R w ith a n on rad io
a ctiv e label. J L ipid Res 1992; 33: 6 0 9 - 6 1 4 .
[1 6 ] R O S E M E Y E R V , L A U B R O C K A , SE IB L R. N on rad ioactive 3 ’-en d -lab elin g o f R N A m o le c u le s o f d ifferent len gth s by term inal deoxyn u cleotid yltran sferase. A nal Biochem 1995;
224: 4 4 6 —449.
[1 7 ] S C H M IT Z G G , W A L T E R T, SE IB L R, K E SS L E R C. N on rad ioactive lab ellin g o f o lig o n u c leo tid e s in vitro w ith the hapten d ig o x ig en in by tailing w ith term inal transferase. A nal Biochem 1991; 192: 2 2 2 - 2 3 1 .
[ 18] S U B R A M A N IA N S V , W Y R O B A E, A N D E R S E N A P, SA T IR BH . C lon in g and seq u en cin g o f parafusin, a ca lciu m -d ep en d en t e x o cy to sis-rela ted ph osp h oglycop rotein . P roc N atl A cad Sci USA 1994; 91: 9 8 3 2 - 9 8 3 6 .
[19] S U R M A C Z L, K R A W C Z Y K K, W Y R O B A E. D ifferent (3-adenergic sp ec ific m olecu lar probes reveal the sam e D N A sp ecies in Paramecium hybridization analysis. 1997. -w y sła n e do druku.
[2 0 ] T IZ A R D R, C A T E RL, R A M A C H A N D R A N KL, W Y S K M , V O Y T A C, M U R P H Y OJ, B R O N S T E IN I. Im agin g o f D N A seq u en ces w ith ch em ilu m in escen ce. Proc N atl A ca d Sci USA
1990; 8 7 : 4 5 1 4 - 4 5 1 8 .
[21] T he G en iu s S y stem U sers G uide for Filter H ybridization. V ersion 2.0. B oehrin ger-M an nh eim C orp., In d ian ap olis, IN . 1992: 5 -2 9 .
[2 2 ] W Y R O B A E, S U B R A M A N IA N SV , S A T IR BH . Southern blot an alysis o f Param ecium D N A usin g parafusin and p h o sp h o g lu co m u ta se sp ec ific probes. M ol B iol Cell (Suppl) 1992; 3: 6 2 a.
[23] W Y R O B A E, W ID D IN G H O Y E R A , S T O R G A A R D PS, SA T IR BH . M am m alian ho m o lo g u e o f the ca lc iu m -se n sitiv e p h osp hoglycop rotein, parafusin. Eur J C ell Biol 1995; 68: 4 1 9 —426.
[24] Z A B E L M ., C IE S IE L S K A M ., W Y S O C K A T. L ocalization o f calciton in m R N A u sing in situ la b elin g w ith reverse transcriptase PCR. Folia Histochem C ytobiol (Suppl 1) 1996; 34: 7 - 8 . [25] Z IS C H L E R H, N A N D A I, SC H A F E R R, SC H M ID M , E PPL E N JT. D ig o x ig en a ted o lig o n u c
leo tid e probes sp ec ific for sim p le repeats in D N A fingerprinting and hybridization in situ. Hum G en et 1989; 82: 2 2 7 - 2 3 3 .
R edaktor prow adzący - M. Z abel
O trzym ano: 10.09. 1997 r.
Przyjęto: 17.10. 1997 r.
A dres autora: 02-093 W arszawa, ul. Pasteura 3
http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 25, NR 1, 1997 (1 3 5 -1 4 6 )
D IG O K SY G E N IN A - N IE R A D IO A K T Y W N Y M A R K E R W B A D A N IA C H K W A SÓ W N U K L E IN O W Y C H . C ZĘŚĆ II. Z A ST O SO W A N IE W Y Z N A K O W A N Y C H
SO ND M O L E K U L A R N Y C H *
D IGO X IG EN IN - NON -RA DIO A CTIVE M ARKER IN NUCLEIC ACIDS RESEARCH. PART II. APPLICATION AND DETECTION
OF THE LA BELLED PROBES
Jolanta W IEJA K , Anna CY W IŃ SK A , Liliana SURM ACZ, Elżbieta W Y RO B A Zakład Biologii Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego
PAN, W arszaw a
Streszczenie: O pisano różnorodne techniki detekcji sond molekularnych w yznakowanych digoksygeniną (DIG) przy użyciu przeciw ciał anty-DIG sprzężonych ze związkami fluorescencyjnym i, enzym ami (fosfataza alkaliczna i peroksydaza) lub złotem koloidalnym . S zegółow o scharakteryzowano kilkanaście substratów chem ilum inescencyjnych um ożliw iających najszybszą i najdokładniejszą detekcję sond.
Następnie om ów iono rozmaite zastosow ania wyznakowanych oligonukleotydów i kw asów nukleino
w ych w hybrydyzacji typu Southern, Northern, in situ oraz EM SA, PRINS i sekw encjonowaniu DN A.
Słowa kluczowe: digoksygeniną, przeciw ciała anty-DIG, hybrydyzacja, detekcja kw asów nukleinowych, fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa, złoto koloidalne, związki fluorescencyjne.
Summary. Different techniques o f detection o f digoxigenin-labelled oligonucleotides and nucleic acids with anti-DIG antibodies coupled to fluorescent dyes, enzym es (alkaline phosphatase and horseradish peroxidase) or colloidal gold are discussed. Several chem ilum inescent substrates - enabling the most efficient, rapid and sensitive detection o f the labelled probes - have been described. A variety o f application o f D IG -labelled probes in Southern, Northern and in situ hybridization as w ell as in EM SA, PRINS and D N A sequencing are presented.
Key w ords: digoxigenin, anty-DIG antibodies, hybridization, detection o f nucleic acids, alkaline phos
phatase, horseradish peroxidase, coloidal gold, fluorescent dyes.
*Praca fin a n so w a n a z funduszy statu tow ych IB D oraz Grantu K B N Nr 6 P 0 4 A 0 5 9 1 0 .
http://rcin.org.pl
136 J. W IEJAK, A. C Y W IŃ S K A , L. SU R M A C Z , E. W Y R O B A
Stosowane skróty: DIG - digoksygenina, anty-DIG - przeciw ciało anty-dioksygeninow e, FISH (ang.
fluorescent in situ hybridization) - hybrydyzacja fluorescencyjna in situ, PRINS (ang. prim ed in situ synthesis) - synteza in situ przy udziale startera, EMSA (ang. electrophoretic mobility shift assay) - test opóźnienia migracji, AP - alkaliczna fosfataza, dUTP - deoksyurydynotrójfosforan, dCTP - d eok sy- cytydynotrójfosforan, PCR (ang. polym erase chain reaction) - reakcja łańcuchowa polimerazy, BC IP - 5-brom o-4-chloro-3-indolilofosforan, NBT - chlorek nitrobłękitu tetrazolu, HNPP - fosforan hydro- ksynaftylofenylu, HNP - hydroksynaftylofenyl, PNP - fosforan 4-nitrofenylu, TM B (3 ,3 ’-5 ,5 ’-tetra- m ethylbenzidinej-tetram etylobenzydyna, ABTS (ang. 2 ,2 ’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic) acid), DN P - dinitrofenol.
I. WSTĘP
Subpikogram ow e ilości DNA i RNA m ogą być w ykryte precyzyjnie, szybko i bezpiecznie dzięki zastosow aniu nieradioaktyw nego m arkera - digoksygeniny [10], którą scharakteryzow ano w pierw szej części tego szkicu. K ilkanaście sposobów detekcji sond m olekularnych wyznakow anych digoksygeniną oraz ich różnorodne zastosow ania przyczyniły się do rozpow szechnienia tej metody wśród biologów m olekularnych.
II. ZASTOSOWANIA
O m ów im y tutaj kilka typowych i bardziej interesujących przykładów zastosow ań oligonukleotydów i kwasów nukleinow ych znakow anych DIG, z których w iększość opiera się na analizie hybrydyzacyjnej.
Hybrydyzacja
H ybrydyzacja kw asów nukleinowych jest m etodą pow szechnie używ aną w bio
logii m olekularnej. Kinetyka i warunki hybrydyzacji z użyciem sond nieradioaktyw - nych [ 10] nie różnią się istotnie od metod radioaktyw nych [25]. Do transferu używ ane są filtry nylonow e lub nitrocelulozow e. Filtry nylonow e są prostsze w użyciu, trw al
sze, silniej w iążą kwasy nukleinowe, w ykazują większą czułość detekcyjną i silniej w zm acniają sygnał chem ilum inescencyjny. D la układu DIG przygotow ano filtry zaw ierające ściśle określoną ilość ładunków dodatnich, dające w ysoką czułość i niskie tło (zbyt duży ładunek dodatni pow oduje bow iem pow stanie w ysokiego tła wskutek niespecyficznego w iązania się białek, szczególnie przeciw ciał używ anych do detekcji, natom iast filtry nie naładow ane w ykazują m niejszą czułość) [10, 30].
Po przeprow adzeniu hybrydyzacji filtry w ym agają zablokow ania czynnikiem blo
kującym (np. sterylnym roztw orem kazeiny lub firm ow ym Boehringer-M annheim ).
H ybrydyzacja typu S outh ern. Filtry m ogą być hybrydyzow ane z sondam i DNA, RNA lub oligonukleotydow ym i [28] znakow anym i DIG [20] i w ykryw ane reakcją kolorow ą, fluorescencyjną lub chem ilum inescencyjną [20, 35-37]. M etody zna
http://rcin.org.pl
D IG O K SY G E N IN Ą - DETEKCJA I Z A ST O SO W A N IE W BIOLOGII M OLEK ULARNEJ
137
kow ania i detekcji zależą od konkretnych wym agań dotyczących czułości i szybkości reakcji.
Sondy D N A i RNA charakteryzują się wyższą czułością niż sondy oligonu- kleotydow e. Stosow anie detekcji fluorescencyjnej lub chem ilum inescencyjnej um o
żliw ia „o d erw an ie” (stripping) zw iązanej sondy np. w w yniku 30-m inutow ej inkubacji w 0,2 M NaOH i ponow ne użycie biotów do kolejnej hybrydyzacji. P ro
cedura ta je st trudniejsza, gdy detekcja odbyw a się przy użyciu reakcji kolorowej, poniew aż pow stały w tej reakcji osad trudno jest usunąć z filtra. Z drugiej jednak strony detekcja kolorow a um ożliw ia względnie najlepszy rozdział blisko położonych prążków i dlatego preferow ana jest ona w takich zastosow aniach, jak np. fin ger- printing DN A [10, 27].
H ybrydyzacja typu N orthern. H ybrydyzacja typu N orthern jest jed n ą z naj
bardziej w ygodnych metod w ykryw ania mRNA. Stosow ane są tutaj głów nie sondy antysensow nego RNA, poniew aż w ykazują one znacznie w yższą czułość niż sondy cD N A czy oligonukleotydow e [7]. M etodą nieradioaktyw ną m ożna wykryć naw et śladow e ilości m RNA, co jest trudne przy zastosow aniu sond znakow anych ra
dioaktyw nie [26, 31].
H ybrydyzacja in situ w m ikroskopie św ietlnym . H ybrydyzacja m olekularna in situ stosow ana jest do uw idaczniania kwasów nukleinow ych (D N A lub RNA) w utrw alonych kom órkach [29] lub tkankach, co um ożliw ia badanie ekspresji genów na poziom ie histologicznym [9]. H ybrydyzacje in situ m ogą być wykonyw ane z użyciem sond D N A [32], RNA [13, 34] lub oligonukleotydow ych.
O becnie coraz częściej stosowane są sondy znakow ane nieradioaktyw nie, szcze
gólnie digoksygeniną, poniew aż są łatw iejsze i szybsze w użyciu [1] niż sondy radioaktyw ne, pom im o że istnieją trudności w ilościowej ocenie sygnału zlokali
zow anego w ew nątrz komórki [9, 29]. Użycie digoksygeniny elim inuje problem y zw iązane zarów no z użyciem sond znakowanych radioaktyw nym fosforem (np.
krótka trw ałość, konieczność ochrony radiologicznej), jak i biotyną, która występuje endogennie w dużych ilościach w wątrobie i nerkach [9, 29].
D etekcja D IG -sond odbyw a się przy zastosow aniu anty-D IG fosfatazy alkalicznej i reakcji kolorow ej z użyciem substratu kolorow ego B CIP/N B T lub przeciw ciał anty-D IG połączonych z cząsteczkam i złota [10, 38].
H ybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH = flu o rescen t in situ hybridization).
W m etodzie tej stosow ane są głów nie sondy DNA znakow ane DIG, chociaż znane są rów nież przypadki stosow ania sond RNA znakowanych DIG, a także znakow anych oligonukleotydów . D etekcja jest bezpośrednia z użyciem przeciw ciał anty-D IG zna
kow anych fluoresceiną, rodam iną lub am inokum aryną. M oże być ona wzm ocniona przez podanie pierw szorzędow ego m ono- lub poliklonalnego przeciw ciała anty-DIG, a następnie przeciw ciała drugorzędow ego w yznakow anego fluoresceiną. Jest to czę
sto stosow ana m etoda w zm acniania sygnału [6, 23].
http://rcin.org.pl
138 J. W1EJAK, A. C Y W IŃ S K A , L. SU R M A C Z, E. W Y R O B A
M ożna rów nież zastosow ać detekcję pośrednią, używ ając przeciw ciał anty-fluo- resceinow ych znakowanych fosfatazą alkaliczną i jej substratu - H N PP, który zw ię
ksza dodatkow o czułość detekcji FISH przez am plifikację sygnału enzym atycznego fosfatazy alkalicznej. Używając tego substratu m ożna nawet wykryć jednokopijne geny na chrom osom ie m etafazow ym [5, 14].
Synteza i znakowanie iti situ przy udziale startera (PRINS = p rim ed in situ synthesis). Technika ta opiera się na hybrydyzacji nie znakow anych fragm entów DNA do sekwencji docelow ych (DNA) in situ. Dalsza reakcja zachodzi po dodaniu m ieszaniny zawierającej polim erazę DNA (np. Taq), buforu i dN TPs (m ieszaniny dezoksynukleotydów ) zaw ierającej DIG-dUTP. Nie znakow ana sonda działa jako starter, a sekw encja docelow a jako m atryca do syntezy DNA znakow anego DIG.
Produkt jest wykrywany podobnie jak w standardowej m etodzie FISH [10].
T echnika PRINS jest prosta, czuła i znacznie szybsza niż inne techniki (np.
FISH), gdyż w ym aga tylko nieznakow anego oligonukleotydu um ożliw iającego hy
brydyzację. Ponadto zaletą tej metody jest lepsze zachow anie struktury chrom o
som ów, kom órek i tkanek. Sonda jest nieznakow ana i dlatego jej niespecyficzne w iązanie z próbką nie pow oduje dużego tła, co pozw ala na stosow anie jej w w ysokim stężeniu. M etoda PRINS jest używ ana do analizy szczegółow ych substruktur w pow tarzalnym DNA, organizacji sekwencji DNA w centrom erze oraz w genetyce klinicznej do badań ekspresji genów i aberracji chrom osom ow ych. Ponadto technika ta pozw ala na lokalizację sklonow anego cDNA podczas badania niepraw idłow ego składania pre-m RN A i występujących w nim mutacji oraz do w ykryw ania sekwencji jednokopijnych w interfazow ym jądrze. PRINS um ożliw ia także badanie utrw a
lonych fragm entów chrom osom ów m etafazowych i jądra [10, 15].
Test opóźnienia migracji - EM SA
M etoda EM SA (electrophoretic m obility shift assay) jest stosow ana do detekcji lub kontroli białek w iążących określone sekwencje DNA. Jako sond używ a się przede w szystkim dwuniciow ych oligonukleotydów znakow anych DIG. C zułość m etody z zastosow aniem DIG jest porów nyw alna z m etodą radioaktyw ną, lecz daje lepszy rozdział prążków, który jest szczególnie istotny w analizach ekstraktów jądrow ych. Aby być pew nym , że digoksygenina nie przyłączy się do m iejsca w ią
żącego białko, dołączana jest ona na końcu dideoksynukleotydu, np. przez w y
pełnienie tępych końców przez polim erazę Klenowa i D IG -dU TP lub D IG -dC TP lub też przez w yznakow anie 3 ’-końca przy użyciu term inalnej transferazy [10].
Sekwencjonowanie DNA
Starterem w reakcji sekw encjonow ania DNA jest oligonukleotyd znakowany digoksygeniną na 5 ’-końcu. Produkty reakcji są rozdzielane na standardow ym żelu
http://rcin.org.pl
D 1G O K SY G EN IN A - DETEKCJA I Z A ST O SO W A N IE W BIOLOGII M OLEKULARNEJ
139
sekw encjonującym DNA i po elektroforezie są przenoszone na filtry nylonow e (m oże się to rów nież odbyw ać przez bezpośrednią elektroforezę na filtrze) [10].
D etekcja drabinki sekwencyjnej opiera się na reakcji m iędzy DIG na 5 ’-końcu startera i przeciw ciałem anty-D IG sprzężonym z fosfatazą alkaliczną, która prze
prow adza reakcję kolorow ą, fluorescencyjną lub chem ilum inescencyjną. Z jed neg o
prow adza reakcję kolorow ą, fluorescencyjną lub chem ilum inescencyjną. Z jed neg o