PL ISSN 0324-833X
POLSKIE
TOWARZYSTWO ANATOMICZNE POLSKIE
TOWARZYSTWO BIOLOGII
KOMÓRKI
TOM 25 NR-1’98
( 1 - 152 )
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI A D V A N C E S IN CELL BIOLOGY
TOM 25, 1998 N R 1 (1 -1 5 2 ) VOL. 25, 1998 N o 1 (1 -1 5 2 )
Kwartalnik Polskiego Towarzystwa Anatomicznego, Polskiego Towarzystwa Biologii Komórki, Polskiej Sieci UNESCO oraz Fundacji Biologii Komórki i Biologii Molekularnej wydawany z częściową pomocą finansową Komitetu Badań Naukowych.
Quarterly of the Polish Anatomical Society, the Polish Society of Cell Biology, the Polish UNESCO Net, and the Foundation for Cell Biology and Molecular Biology, partialy supported by the Committee for Scientific Research (KBN)
Redaguje Kolegium - Editors:
Szczepan BILIŃSKI (biologia rozwoju, embriologia, cytoszkielet, połączenia międzykomórkowe - Instytut Z o o lo g ii UJ, 3 0 -0 6 0 K raków , ul. Ingardena 6),
Jerzy KAWIAK (immunologia, cytometria, hematologia, biologia nowotworów - Z akład C y to lo g ii K lin icznej CM KP, 0 1 -8 1 3 W arszaw a, ul. M arym oncka 99),
Wincenty KILARSKI (mięśnie, skurcz mięśniowy, ruchy komórek-I n s ty tu t Z o o lo g ii UJ, 3 0 - 0 6 0 K raków , ul.
In garden a 6),
JACEK KUŹNICKI (biologia molekularna, biochemia białek, cytoszkielet i ruch komórki - Instytut B io lo g ii D o św ia d c za ln e j P A N im. M. N enckiego, 0 2 -0 9 7 W arszaw a, ul. P asteu ra 3).
Jan MICHEJDA (szlaki informacyjne, błony komórek, energetyka komórki - Z akład B ioen ergetyki U AM, 61-7 0 1 Poznań, ul. F red ry 10),
Maria OLSZEWSKA (komórki roślinne, informacja genetyczna w komórkach roślinnych i zwierzęcych - Z a k ła d C y to lo g ii i C ytochem ii Roślin Instytutu F izjo lo g ii i C y to lo g ii UŁ, 9 0 -2 3 7 Łódź, ul. B anacha 12/16), Maciej ZABEL (histologia ogólna, endokrynologia, histochemia (immunocytochemia, hybrydocytochemia), ultrastruktura komórek - Z akład H isto lo g ii AM, 5 0 -3 6 8 W rocław, ul. C hałubińskiego 6a)
Rada Redakcyjna - Advisory Board:
Zofia OSUCHOWSKA - przewodnicząca, Mieczysław CHORĄŻY, Leszek CIECIURA, Antoni HORST, Aleksander KOJ, Włodzimierz KOROHODA, Leszek KUŹNICKI,
Olgierd NARKIEWICZ, Aleksandra PRZEŁĘCKA, Aleksandra STOJAŁOWSKA, Lech WOJTCZAK
A d r e s R e d a k c ji - E d ito r ia l O ffice: C en tru m M e d y czn e K s z ta łc e n ia P o d y p lo m o w e g o ul. M a r y m o n ck a 99, 0 1 -8 1 3 W a rsza w a , P o la n d , tel. 3 4 0 344, fax 3 4 0 4 7 0 .
R e c e n z e n c i r o c z n ik a P B K są p u b lik o w a n i w z e s z y c ie 4.
R e fe r e e s o f th e v o lu m e are p u b lish e d in is s u e 4.
© Fundacja Biologii Komórki i Biologii Molekularnej - Foundation for Cell Biology and Molecular Biology W szystkie p ra w a zastrzeżon e. Z abran ia się kopiow an ia części lub c a ło śc i b ez uprzedn iego p ise m n eg o ze zw o len ia F u n dacji B io lo g ii K om órki i B io lo g ii M olekularnej.
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced in any form or by any means without the prior written permission o f the publisher. Requests to the publisher for permission should be adressed to the Fundacja Biologii Komórki i Biologii Molekularnej.
Ark. w yd. 12 ,0 Ark. druk. 9,5. Podpisano do druku w grudniu 1997 r. Druk ukończono w styczniu 1998 r.
http://rcin.org.pl
W tym Zeszycie
Czytelnik znajdzie w tym zeszycie na stronie 3 artykuł o chorobach prionowych. Został on napisany w związku z tegoroczną nagrodą Nobla w dziedzinie medycyny, którą otrzymał amerykański uczony prof. Stan
ley Prusiner za odkrycie prionów.
Białka rodziny 14-3-3 są wysoce konserwatywne. Białka te w cytopla- zmie oddziałują z fosfatydyloseryną wielu białek wiążąc je i sekwestru- jąc. Funkcję białek 14-3-3 może zilustrować następujący przykład.
Rodzina białek Bcl-2 bierze udział w „decyzji” przeżycia komórki. Bcl-2 i BcIxlhamują apoptozę. Inni członkowie tej rodziny - Bad i Bax mogą zablokować aktywność Bcl-2 i BcIxlwiążąc się z nimi w niefunkcjonalne heterodimery. Czynniki zewnątrzkomórkowe konieczne do przeżycia komórek, takie jak IL3 dla pewnych linii komórkowych, powodują fosfo- rylację seryny w białkach Bad i Bax oraz dysocjację z kompleksu Bcl-2/Bad bądź Bcl-2/Bax. Oddysocjowane, ufosforylowane na serynie Bad i Bax są wiązane i sekwestrowane przez białka 14-3-3. Więcej o białkach 14-3-3 znajdzie Czytelnik na stronie 9.
Wzmiankę o apoptozie u roślin można znaleźć w artykule poświęconym starzeniu się roślin na stronie 63.
Poliaminy mogą tworzyć kompleksy z białkami i kwasami nukleinowymi oraz stymulować podstawowe procesy komórkowe. Informacje na te
mat syntezy i mechanizmów działania poliamin w komórce roślinnej znajdzie Czytelnik na stronie 33.
Rysbazy są to rybonukleazy o specjalnym działaniu biologicznym.
Zabijają one komórki docelowe przez specyficzną hydrolizę rRNA i blokowanie syntezy białka. Rysbazy biorą udział w zapobieganiu samo- zapyleniu niektórych gatunków roślin. O tych i innych funkcjach rysbaz można przeczytać na stronach 51 i 75.
O dodtkowym sygnale w procesie aktywacji limfocytów T napisano na stronie 111. Sygnał ten jest wynikiem interakcji receptorów CD28 i CTLA-4 na limfocytach z ligandami B 7.1 i B 7.2 na komórkach prezen
tujących antygen. Nieprawidłowościom ekspresji genów CD28 i CTLA-4 przypisuje się istotne znaczenie w patogenezie zaburzeń o podłożu immunologicznym, w tym w chorobach autoimmunologicznych.
Znakowanie sond molekularnych digoksygeniną i ich wykorzystanie opisano na stronach 125 i 135.
http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 25, NR 1 1998 (3 -8 )
W ŚC IE K Ł E K R O W Y I IN N E C H O R O BY P R IO N O W E A N A G R O D A N O B L A 1997 Z M E D Y C Y N Y
Kazimierz O STROW SKI Instytut Biostruktury AM, W arszaw a
Popłoch, jaki w yw ołało zjaw isko w ściekłych krów, spow odow ał pow ażne za
burzenia zarów no w sferze politycznej, jak i ekonom icznej. Należałoby się temu zjaw isku przyjrzeć od strony biom edycznej. Spraw a nie jest prosta, nie jest do końca w yjaśniona i co gorsza nie jest łatw a do zrozum ienia, bez pew nych pod
staw ow ych wiadom ości z dziedziny biologii kom órki. C horoba w ściekłych krów należy do chorób prionow ych, a objaw ia się zm ianam i degeneracyjnym i w m ózgow iu, które pod m ikroskopem przybiera wygląd gąbki. Stąd zaliczam y to schorzenie do gąbczastego zw yrodnienia m ózgowia, występującego zarów no u niektórych gatun
ków zw ierząt, jak i u człow ieka. Schorzenia prionow e nazw ane zostały w m ię
d z y n a ro d o w e j n o m e n k la tu rz e a k ro n im e m T S E — transm issible spongiform encephalopathies.
Priony są białkam i norm alnie występującym i w neuronach całego m ózgow ia, a gen kodujący priony, zwany genem PrP, jest norm alnym składnikiem genom u m yszy i ludzi. Nie znamy zupełnie roli, jak ą białko to spełnia w kom órce. N atom iast w iadom e jest, że spontaniczna zm iana konformacji tego białka albo zm iana in
dukow ana w targnięciem z zewnątrz zakaźnej postaci prionu pow oduje lawinowe przekształcenia konform acyjne tego białka, jego grom adzenie się w kom órce i jej obum ieranie.
Prion, czyli zakaźne białko, jest fenom enem biologicznym , który stał się przed
m iotem gorączkow ych, aby nie pow iedzieć burzliw ych badań i dyskusji ogólnobio- logicznych. Prion je st czynnikiem zakaźnym , ale nie zaw iera inform acji genetycznej w postaci kw asów nukleinow ych. W postaci zwykłej białko prionow e w ystępuje w kom órkach jako białko zw iązane z błoną kom órkow ą neuronów. Nie jest to jednak białko przezbłonow e i nie ma żadnej części wystającej ponad pow ierzchnię
http://rcin.org.pl
4 K. O STRO W SK I
kom órki. Nie bardzo wiemy jaka jest jego rola, natom iast w niektórych okolicz
nościach białko to zm ienia konform ację, przybierając inny kształt. Jego cechą za
sadniczą po dokonanej zm ianie konform acyjnej jest oporność na hydrolizę przez enzym y proteolityczne oraz to, że sw ą obecnością wpływa na zmiany konform acyjne norm alnych cząsteczek białka prionow ego. Choroby prionow e przechodzą z osobnika na osobnika, o czym najdobitniej świadczy schorzenie kuru-kuru, które w ystępow ało na M elanezji tak długo, jak długo istniało rytualne spożywanie m ózgów zm arłych przodków . W ściekłe krowy w Anglii, pojawiły się na skutek dodaw ania do ich pokarm u m ózgów owiec padłych na scrapie, będącą rów nież chorobą prionową.
W spółczesne metody biologii m olekularnej, zw ane m etodą knock-outu genety
cznego, pozw oliły na stworzenie szczepu myszy pozbaw ionych genu białka PrP.
Zw ierzęta pozbaw ione tego białka rodzą się zdrowe i nie chorują na choroby prio
nowe, naw et po zakażeniu ich aktyw nym preparatem zakaźnym tego białka. Za ten im m unitet drogo jednak płacą, poniew aż pozbaw ienie ich tego genu i jego produktu ujaw nia się po kilku tygodniach życia w postaci narastającej silnej ataksji.
N iezborność ruchów spow odow ana jest m asowym zanikaniem kom órek Purkiniego w ich m óżdżkach. M yszy te chorują na choroby pow odow ane prionam i dopiero wtedy, gdy w prow adzi się im za pom ocą manipulacji genetycznej ten gen z pow rotem do ich genom u. Nie znam y dzisiaj żadnego sposobu leczenia tych chorób neuro- degeneracyjnych. Istnieją projekty przyszłej terapii opartej na w prow adzeniu oligo- nukleotydów antysensow ych celem blokow ania syntezy białka prionowego.
U w aża się obecnie, że trzy dziedziczne schorzenia degeneracyjne układu ner
w ow ego typu TSE są pow odow ane przez priony, a m ianowicie rodzinna postać choroby C reutzfeldta-Jakoba (CJD), syndrom GSS, czyli G erstm anna-Strausslera- Scheinkera i rodzinna postać śmiertelnej bezsenności (F F I- fa ta lfa m ilia l insomnia).
D ziedziczenie tych schorzeń nie jest sprzeczne z zakaźnością. Jak ju ż pow iedziano pow yżej, białko prionow e jest norm alnym białkiem występującym w każdej kom órce zw ierząt i ludzi. Białka te czasem spontanicznie ulegają zm ianom konform acyjnym . Ta chorobotw órcza postać prionów może przenosić się z komórki do kom órki, a także z organizm u do organizm u. G ąbczastym zw yrodnieniem m ózgow ia krów (tzw. chorobą wściekłych krów) m oże zapewne zakażać się człow iek w wyniku spożyw ania ich mięsa. Dow odem pośrednim , poniew aż nikt takich dośw iadczeń św iadom ie nie wykonał i nie wykona, jest now a postać schorzenia C reutzfeldta- Jakoba, dotycząca ludzi m łodych. To schorzenie zostało opisane w ostatnich latach i jest postacią odm ienną od klasycznego przebiegu CJD (Creutzfeldt-Jakob D isease), dotyczącego ludzi w wieku ponad 60 lat. Istnieją także podejrzenia, że priony odgryw ają rolę w pow staniu choroby Alzheimera.
C hociaż ostatnio ukazało się sporo publikacji na tem at prionów i zagrożenia now ym rodzajem epidem ii, to warto może dorzucić kilka nowych inform acji, po
chodzących głów nie z źródeł brytyjskich, ostatnio najbardziej tym problem em zain
teresow anych [1-8].
http://rcin.org.pl
C H O R O B Y PRIO NO W E A N A G R O D A N O B LA 1997 Z M E D Y C Y N Y 5
C horoba wściekłych krów - BSE (bovine spongiform encephalopathy) i scho
rzenie dotyczące ludzi - Creutzfeld-Jakob disease (CJD) należą do tej samej grupy schorzeń degeneracyjnych, polegających na zaniku neuronów w m ózgowiu i bardzo jednoznacznym obrazie histopatologicznym tkanki m ózgowej, wykazującej liczne ogniska rozpadu, stw arzające w rażenie struktury gąbczastej.
W zeszycie N ature [214;746, 1967] wydanym 29!!! lat temu ukazała się praca na tem at czynnika zakaźnego, który pow oduje gąbczaste zw yrodnienie m ózgow ia, a który - jak ju ż wówczas stw ierdzono - nie zaw iera kwasów nukleinow ych. Istota tego czynnika zakaźnego stanowi nadal, po niem alże 30 latach intensyw nych badań - nierozw iązaną zagadkę. Początkow o sądzono, że jest to wirus. Ale niezw ykła odporność tego czynnika na prom ieniowanie jonizujące, w tym także prom ie
niow anie UV, oraz fakt, że jego zakaźność m ożna zm niejszyć jedynie działaniem bardzo wysokiej tem peratury lub przez przeprow adzenie czynnika zakaźnego w stan rozproszenia przy użyciu detergentów, uznano, że czynnik ten nie jest wirusem .
O statnio opisano w Anglii 10 przypadków odm iany schorzenia CJD, dotychczas nieznanej. To skłoniło rząd W ielkiej Brytanii do oficjalnego stw ierdzenia, że m oże istnieć zależność pom iędzy pojaw ieniem się tych przypadków , a gąbczastym zw y
rodnieniem m ózgow ia u tzw. wściekłych krów. Te 10 przypadków zostało u jaw nionych w ciągu ostatnich dwóch lat, przy czym średnia wieku chorych w ynosiła 2 6 -2 7 lat, a wśród nich było 2 chorych w wieku lat kilkunastu. Z tych 10 chorych dw óch jeszcze żyje. Objawy schorzenia u tych chorych różnią się od spontanicznie i sporadycznie w ystępującego CJD (1 przypadek/rok/m ilion populacji) tym, że przy
pom inają raczej schorzenie kuru-kuru z silniejszym i objawam i ataksji, czyli nie
zborności ruchowej niż dem encji, czyli otępienia psychicznego.
Nie je st nadal jasne, czy ta now a odm iana CJD jest w istocie spow odow ana zakażeniem BSE. Przem aw ia jednak za tym fakt, że odm iany tej nigdy przedtem nie obserw ow ano oraz że schorzenie to wystąpiło u bardzo m łodych ludzi, czego dotychczas rów nież nie stwierdzono. Pow ołana przez Rząd Brytyjski K om isja spe
cjalistów od zw yrodnienia gąbczastego mózgu doszła do wniosku, że ujaw nił się nowy czynnik ryzyka zachorow ania na to schorzenie.
O becnie pow szechnie przyjęta jest hipoteza zakażenia białkiem zakaźnym - prio- nami. Priony zakaźne są cząsteczkam i białka norm alnie w ystępującego w kom órkach ssaków, ale zm ienionego pod względem konform acji. Białko to, które norm alnie niczym nie zagraża, ulega zm ianie w prion zakaźny, który jest oporny na traw ienie proteazam i i który pow oduje lawinowe zm iany konform acyjne w norm alnych czą
steczkach tego białka. Tak zm ienione białko nie ulega proteolizie i stąd grom adzi się w kom órce pow odując jej obum arcie.
N orm alne białko prionow e jest niezbędne do zaistnienia zakażenia. U m yszy, u których białko prionow e nie w ystępuje na skutek m anipulacji genetycznej, zwanej knock-outem genu białka prionow ego, nie dochodzi do zakażenia prionam i, albow iem nie m a substratu dla następow ych zm ian konform acyjnych.
http://rcin.org.pl
6 K. O STRO W SK I
M echanizm kom órkow y działania prionów schem atycznie w ygląda następująco.
N a skutek spontanicznej mutacji w genom ie kom órki, najczęściej nerw ow ej, dochodzi do punktow ej zm iany w genie białka prionowego, dotyczącej jednego tylko kodonu.
Do dziś poznano kilka lokalizacji takich m utacji z dokładną lokalizacją w genie białka prionowego. N a skutek takiej m utacji dochodzi do syntezy białka nieco odm iennego od białka norm alnego, które nie różni się w zasadzie od białka nor
m alnego sekw encją am inokw asow ą, ale ma inne właściwości fizyko-chem iczne.
Zm utow ane białko jest oporne na traw ienie enzym am i proteolitycznym i, jego czą
steczki zbijają się w agregaty wypełniające cytoplazm ę kom órki. Gdy agregaty te nagrom adzą się także w jądrze kom órkowym , kom órka obum iera, a agregaty białka prionow ego pojaw iają się w substancji m iędzykom órkow ej. Białko prionow e m a odm ienną od norm alnej strukturę przestrzenną. Jej obecność pow oduje, że nor
malne cząsteczki tego białka zaw arte w cytoplazm ie ulegają konw ersji i zm ieniają się w białko prionow e. Nie istnieje jasne wyjaśnienie tego m echanizm u.
Ostatnio podano drugą inform ację o norm alnej funkcji niezm ienionego białka kodow anego przez gen PrP. U m yszy pozbawionych tego genu stw ierdzono wyraźne zaburzenia rytm u okołodobow ego, polegające głównie na zaburzeniach snu. Z a
burzenia te polegające m.in. na fragm entacji okresu snu, przypom inają schorzenie o genezie prionow ej, w ystępujące u ludzi. Jest to w ystępująca spontanicznie w niektórych rodzinach bezsenność kończąca się śm iercią, tzw. bezsenność rodzinna śm iertelna - FFI - fa ta l fa m ilia l insomnia.
Co do zakaźnego charakteru zm ienionego konform acyjnie białka prionow ego nie m a dziś wątpliw ości. Zakażenie m ożna dośw iadczalnie przekazyw ać z myszy na m ysz preparatam i nie zawierającym i żadnych elem entów kom órkow ych. Nawet pew ne w łaściw ości przebiegu schorzenia charakterystyczne dla poszczególnych szczepów m yszy zostają w ten sposób przekazywane. Zw iększenie ilości zm ienionego konform acyjnie zakaźnego białka opornego na działanie proteaz m ożna uzyskać przez zm ianę konform acji in vitro, w warunkach, w których nie m a żadnych kom órek w naczynku hodow lanym .
Problem ów oczekujących rozw iązania jest mnóstwo. Nie wiem y m ianowicie, jak w ędruje czynnik zakaźny u krów karm ionych pożyw ieniem zaw ierającym priony (dom ieszka m ózgów owiec padłych na kołow aciznę - scrapie) z przew odu po
karm ow ego do m ózgow ia. Istnieje uzasadniona hipoteza, że zakaźne białko jest resorbow ane i przenika przez ścianę jelita, a następnie jest przenoszone naczyniam i lim fatycznym i do śledziony, skąd przez nerwy unerw iające śledzionę do rdzenia kręgow ego i m ózgowia. Istnieje m ożliwość, że układ im m unologiczny odgryw a rolę w zakażeniu, poniew aż stw ierdza się aktyw ność kom órek m ikrogleju.
Podstaw ow ym zagadnieniem jest jednak to, czy człow iek m oże się zakazić schorzeniem BSE po zjedzeniu zakażonego mięsa, a więc czy ostatnio odkryte zm odyfikow ane postaci CJD pow stały w ten właśnie sposób. Zaplanow ane jest przeprow adzenie dośw iadczenia, polegającego na w strzyknięciu m ateriału uzyska
http://rcin.org.pl
C H O R O B Y PRIO NO W E A N A G R O D A N O B LA 1997 Z M E D Y C Y N Y 7
nego od pacjentów chorych na CJD myszom. Jeżeli myszy zachorują, porów na się ich objaw y z dobrze opisanymi objawami schorzenia m yszy po wstrzyknięciu prionów BSE.
O czyw istym problem em jest znalezienie sposobu leczenia zakażonych chorych.
Próby użycia leków grzybobójczych i polianionów wym agały użycia dużych stężeń do leczenia chorych myszy, ale dały tak silne objawy uboczne, że ich przydatność w terapii człow ieka okazała się nierealna.
N ie istnieje też żadna spraw dzona m etoda diagnostyczna św iadcząca o zakażeniu.
M etoda Western blotting próbow ana na m yszach okazała się mało przydatna ze w zględu na słabą czułość. Bariera m iędzygatunkow a w ym aga w strzyknięcia m yszy daw ki białka 10 000 razy większej niż daw ka pow odująca zakażenie krowy. P o
szukiw ania nowych technik diagnostycznych są w toku.
Prow adzi się usilne badania, których celem jest stwierdzenie, czy w zm iankow ane na początku 10 przypadków CJD są rzeczyw iście zw iązane z zakażeniem BSE, co pom oże w przew idyw aniu pojaw ienia się większej ilości takich przypadków w przyszłości.
Istnieje filogenetyczna m apa struktury biochem icznej białka prionow ego uzy
skanego od 33 gatunków kręgowców. Drzewo genealogiczne tych białek jest ułożone na podstaw ie różnic w sekwencjach am inokw asow ych. Zaledw ie u 6 gatunków (w tym u człow ieka) z w ym ienionych 33 w ystępują choroby prionow e spontanicznie.
Nie w iem y, czy nie stoim y u progu pojaw ienia się na Ziem i łańcucha nowych dotąd nie znanych schorzeń, do których zw alczania nie jesteśm y zupełnie przy
gotow ani.
O dkrycie prionów indukuje poszukiw ania sposobu ew entualnego leczenia cho
rób degeracyjnych układu nerwowego. U kazała się praca dośw iadczalna [2] w y
konana na m yszach pozbaw ionych genu białka prionowego. Są one oznakow ane jak o m yszy Prnp - / - . M yszy takie są oporne na zakażenie prionam i. Gdy m yszom takim w prow adzi się do tkanki m ózgowej przeszczep fragm entu m ózgu pobranego od m yszy Prnp +/+ i zakazi się dom ózgow o prionam i kołow acizny owiec (priony scrapie), to przeszczep ulegnie zakażeniu, ale otaczająca go tkanka m ózgow a po
zostaje oporna na zakażenie. Okazuje się, że w tym m odelu dośw iadczalnym prze
szczep Prnp + /+ nie ulegnie zakażeniu, gdy priony w prow adzi się zw ierzęciu dożylnie lub dootrzew now o. Jeśli takim m yszom w prow adzono dożylnie kom órki szpiku od zw ierzęcia w ykazującego ekspresję genu prionow ego, to po zakażeniu prionam i drogą dożylną lub dootrzew now ą, znajdow ano ich znaczne stężenie w śledzionie, ale nie w przeszczepie Prnp + /+ w m ózgu. W ydaje się, że ekspresja norm alnego białka prionow ego w tkankach zw ierzęcia jest niezbędna dla zaistnienia infekcji. B rak tego białka w tkankach peryferyjnych nie pozw ala na zakażenie przeszczepu tkanki nerw ow ej w m ózgu, naw et po podaniu prionów drogą dożylną czy dootrzew now ą. R ozw ażane są m ożliwości w ykorzystania tej inform acji w za
pobieganiu, a m oże naw et leczeniu chorób neurodegeneracyjnych.
http://rcin.org.pl
8 K. O STRO W SK I
M ożna mieć nadzieję, że nagroda N obla za priony nie jest pom yłką. W każdym razie odkrycie zakaźnego białka uruchom iło lawinę badań i stw orzyło cień nadziei na leczenie nieuleczalnych dotąd schorzeń degeneracyjnych układu nerw ow ego.
W niew ielu przypadkach zagadnienia ekonom iczne i polityczne tak ściśle po
wiązały się z problem am i czysto m edycznym i. M ożna m ieć pew ność, że problem prionów w ielokrotnie jeszcze powróci na łamy prasy i to nie tylko fachow ej.
LITERATURA
[1] A G U Z Z I A , W E IS S M A N N C. Sp ongiform encephalopathies: a su sp icio u s signature. N a tu re 1996; 383: 6 6 6 - 6 6 7 .
[2] B L A T T L E R T, B R A N D N E R S, R A E B E R AJ, K LEIN M C, V O IG T L A N D E R T, W E IS S M A N N C , A G U Z Z I A . P rP -exp ressin g tissu e required for transfer o f scrapie in fe ctiv ity from sp leen to brain. N a tu re 1997; 389: 6 9 - 7 3 .
[3] C O L L IN G E J, SID L E KC, M E A D S J, IR O N SID E J, H ILL A F. M olecu lar an a ly sis o f prion strain variation and the a etio lo g y o f n ew variant CJD. N atu re. 1996; 3 8 3 : 6 8 5 - 6 9 0 .
[4] H U N T E R N , C A IR N S D , F O S T E R JD, SM IT H G, G O L D M A N N W , D O N N E L L Y K. Is scrapie s o le ly a g en etic d isease? N a tu re 1997; 3 8 6 : 137.
[5] M A S T E R S CL, B E Y R E U T H E R K. S p on giform en cep h alop ath ies. T racking turncoat prion proteins. N a tu re 1997; 388: 2 2 8 - 2 2 9 .
[6] P A R C H I P , C A P E L L A R I S, C H E N SG , P E T E R S E N R B , G A M B E T T I P, K O PP N , B R O W N P, K IT A M O T O T , T A T E IS H I J, G IE S E A , K R E T Z S C H M A R H. T yp in g prion iso fo rm s. N a tu re 1997; 3 8 6 : 2 3 2 - 2 3 4 .
[7] R A Y M O N D GJ, H O PE J, K O C ISK O D A , P R IO L A S A , R A Y M O N D L D , B O S S E R S A, IR O N S ID E J, W IL L RG , C H E N SG , P E T E R SE N R„ G A M B E T T I P, R U B E N S T E IN R, SM IT S M A , L A N S B U R Y PT, jr. C A U G H E Y B. M olecu lar assessm en t o f the potential transm issib i- lities o f B S E and scrapie to hum ans. N a tu re 1997; 3 8 8 : 2 8 5 - 2 8 8 .
[8] S C H E L L E K E N S H. Sp en ding on B S E research. N a tu re 1996; 3 8 3 : 2 1 1 .
Redaktor prow adzący - Jerzy K aw iak
O trzym a n o : 2 4 .1 0 . 1 9 9 7 r.
P r z y ję to : 0 4 .1 1 . 1 9 9 7 r.
A d r e s a u to ra : ul. C h a łu b iń sk ieg o 5, 0 2 -0 0 4 W a rszaw a
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 25, NR 1, 1998 (9 -3 2 )
B IA ŁK A R O D Z IN Y 14-3-3, W Y ST Ę P O W A N IE I W Ł A ŚC IW O ŚC I*
T H E 14-3-3 F A M IL Y O F P R O T E IN S , D IS T R IB U T IO N A N D P R O P E R T IE S
G rzegorz W ILCZY Ń SK I, Ew a M A R K IEW IC Z, A nna KULM A, Jan SZO PA Instytut B iochem ii i Biologii M olekularnej Uniw ersytetu W rocław skiego, W rocław
S treszczen ie: L icznie reprezentowane, w ysoce konserwatywne białka rodziny 14-3-3 po raz pierw szy w yizolow an o z m ózgów bydlęcych jako grupę kwaśnych białek o m asie cząsteczkow ej około 30 kDa i punkcie izoelektrycznym około 5. Od czasu odkrycia, w iele hom ologicznych białek o zróżnicowanej funkcji w yd zielon o z licznych organizm ów włączając ssaki, owady, drożdże i rośliny. Ostatnie donie
sienia wskazują na udział tych białek w kontroli cyklu kom órkow ego i regulacji ekspresji genów . P oszczególn e izoform y białek 14-3-3 aktywują syntezę neurotransmiterów i A D P-rybozylację białek, regulują aktyw ność kinazy C i endonukleazy macierzy jądrowej, asocjują z produktami protoonkoge- nów , onk ogen ów i genu cdc25. Szerokie spektrum aktywności sugeruje, że białka 14-3-3 mają w iele izoform i każda izoform a wykazuje unikalną funkcję. Zidentyfikowano co najmniej siedem izoform białka 14-3-3 ssaków i w iele takich izoform odnaleziono w w iększości komórek. C hociaż liczba ostatnio publikowanych prac na temat białek 14-3-3 zw iększa się niemal eksponencjalnie, to jednak ich funkcja pozostaje nadal nie w pełni wyjaśniona. W tej pracy podkreślono ważniejsze funkcje białek 14-3-3 i szczeg ó ln ie skupiono się na ich roślinnych hom ologach.
Słow a kluczow e: białka 14-3-3, ekspresja genu, roślinne hom ologi 14-3-3
Sum mary: The abundant, highly conserved 14-3-3 family o f proteins were originally isolated from bovine brain as a series o f acidic proteins that had molecular m asses o f around 30 kDa and an isoelectric point o f around 5. Since discovery several related proteins with different functions have been found in a w ide variety o f organism s including mammals, insects, yeast and plants. Recent findings point to a participation o f these proteins in the control o f the cell cycle and the regulation o f gene expression. Members o f the 14-3-3 protein fam ily activate neurotransmitter synthesis and ADP-ribosylation o f proteins, regulate protein kinase C and nuclear matrix endonuclease, associate with the products o f proto-oncogenes, oncogenes and cdc25 gene. The broad spectrum o f activities suggests that the 14-3-3 proteins have several isoform s and that each isoform has its own unique function. At least seven mammalian isoform s o f 14-3-3
* Praca fin a n so w a n a z grantu K B N nr 6 P 0 4 A 0 4 3 10 oraz badań w łasn ych .
http://rcin.org.pl
10 G. W ILC Z Y Ń SK I, E. M ARK IEW ICZ, A. K U L M A , J. SZO PA
have been identified, and multiple isoforms are present in most cells. Although the number o f recent pulications on 14-3-3 proteins increase near exponentially their biological function is as yet far frorr.
clear. Here, w e highlight m ost important functions o f the 14-3-3 proteins, and in particular discuss plant 14-3-3 hom ologs.
K ey w ords: 14-3-3 proteins, gene expression, plants hom ologs 14-3-3
WPROWADZENIE
Polipeptydy 14-3-3 zostały po raz pierw szy zidentyfikow ane przez M oora i Pereza w wyniku system atycznej analizy białek mózgu wołu w elektroforezie dw ukie
runkow ej jako grupa kwaśnych białek o masach cząsteczkow ych od 27 kD a dc 30 kD a i punkcie izoelektrycznym w przedziale 4,3—4,9. O znakow anie symbolerr.
14-3-3 pochodzi od pozycji, jak ą białka te przyjm ują po zakończeniu rozdziału dw ukierunkow ego [61].
D otychczas z mózgu ssaków wyizolow ano osiem izoform białka 14-3-3 oz
naczonych kolejnym i literam i alfabetu greckiego na podstaw ie ich rozdziału podczas HPLC [37]. W ystępow anie białek 14-3-3 jest pow szechne. Ich hom ologi ziden
tyfikow ano w wielu organizm ach eukariotycznych, takich jak: drożdże (S accha■
rom yces cerevisiae [34] i Saccharom yces pom be [24]), nicienie, ow ady (D rosophilc m elanogaster) [78], płazy (Xenopus laevis) [75], ryby, ptaki oraz ssaki. Obecne są rów nież w wielu organizm ach roślinnych, w tym w A rabidopsis thaliana [51 71] i Solarium tuberosum [88].
W ydzielono i scharakteryzow ano kilkanaście, pochodzących z różnych źródeł białek 14-3-3. W iele z nich zostało sklonow anych i zsekw encjonow anych. Porów nanie sekwencji zarów no nukleotydow ej, jak i am inokw asow ej pozw ala stwierdzić wysoki stopień podobieństw a (60-90% ) w ystępujący pom iędzy różnym i homolo- gam i. W poszczególnych izoform ach zidentyfikow ano wysoce konserw atyw ne, iden
tyczne regiony niezm ienne w całej rodzinie tych polipeptydów.
B iałkom tym przypisyw ano szereg różnorodnych funkcji, np: aktyw acja hydro- ksylaz tyrozyny i tryptofanu, regulacja aktywności kinaz białkow ych R af-1, Ber oraz kinazy białkowej C, udział w egzocytozie i cyklu kom órkow ym . Obecnie w ydaje się, że białka te pełnią raczej rolę adaptacyjną w stosunku do białek biorących udział w przenoszeniu sygnałów w ew nątrzkom órkow ych m odulując ich aktyw ność [3, 43].
STRUKTURA DRUGORZĘDOWA BIAŁEK 14-3-3
A nalizą m ieszaniny izoform polipeptydów 14-3-3 z owiec m etodą dichroizm u kołow ego stwierdzono, że białka te zaw ierają 63,7% a - h e lis y i tylko 5,3% (3- struktury [69]. Badaniam i krystalograficznym i wykazano, że białka 14-3-3 w ystępują w form ie dim erycznej. M onom er stanowi układ dziew ięciu anty rów noległych a-h elis.
http://rcin.org.pl
B IA Ł K A 14-3-3 II
zorganizow anych w dwie domeny. C -końcow a dom ena ma charakter kw aśny, na
tom iast cechą charakterystyczną dom eny N-końcowej jest jej w ysoka konserw a- tyw ność. D om ena N -term inalna bierze udział w dim eryzacji białka, am inokw asy od 5 do 21 jednego m onom eru oddziałują z resztam i am inokw asow ym i Ser58 i G lu89 drugiego m onom eru [89,49]. M ożliw e jest także tw orzenie się heterodim erów w szędzie tam, gdzie następuje ekspresja więcej niż jednej izoformy [43], a ich skład m oże odgryw ać kluczow ą rolę w fizjologicznej funkcji tych białek. Poniew aż reszty am inokw asow e od 9 do 16 dom eny dim eryzacji są wysoce zm ienne (rys.
1 i 2), to praw dopodobnie jest ograniczona liczba m ożliw ych hom o- lub hetero
dim erów , co m oże być przyczyną pewnej swoistości ich tworzenia. D im eryzacja prow adzi do utw orzenia dużego kanału, w którego skład w chodzą niezm ienne, negatyw nie naładow ane, reszty am inokw asow e N -końca polipeptydu, podczas gdy jeg o pow ierzchnię zew nętrzną budują am inokw asy zm ienne. Fakt, że w iększość am inokw asów budujących kanał jest konserw atyw na oraz że drożdżow y 14-3-3 m oże regulow ać aktyw ność białek ssaków, sugeruje, że jest to m iejsce w iązania w ielu różnorodnych białek regulow anych przez 14-3-3. W konserw atyw nym kanale rozpoznaw ane są wspólne cechy stm kturalne oddziałujących z 14-3-3 białek, na
tom iast specyficzność tych oddziaływań przypuszczalnie jest regulow ana przez zew nętrzną pow ierzchnię kanału lub/i skład dim erów [39].
BIAŁKA 14-3-3 ULEGAJĄ FOSFORYLACJI
W ystępujące w m ózgu ssaków izoformy a i 8 są fosforylow anym i form am i izoform P i ę K inaza białkow a fosforylująca m ózgowe izoformy 14-3-3 na reszcie S e rl8 5 w m otyw ie Ser-Pro-G lu-Lys (SPEK) nie jest jeszcze dokładnie scharakte
ryzow ana, aczkolw iek najbardziej praw dopodobnym i enzym am i w ydają się być M A PK kinaza i kinaza zależna od cyklin [5]. Struktura krystaliczna białka 14-3-3 w skazuje, że m iejsce fosforylacji w dystalnym regionie C -końcow ej pętli jest eks
ponow ane do środow iska zew nętrznego [89]. U ssaków głów nym m iejscem w y
stępow ania fosfoizoform jest tkanka m ózgowa, w innych tkankach ich poziom jest znacznie niższy [5]. Białka 14-3-3 są fosforylow ane nie tylko na reszcie Ser 185 i nie tylko przez M A PK kinazę i kinazę zależną od cyklin. Izoform a T z lim focytów
Rys. 1. Struktura dom enow a białek 14-3-3
http://rcin.org.pl
12 G. W ILC Z Y Ń SK I, E. M ARK IEW ICZ, A. K U LM A , J. SZO PA
Rys. 2. Porównanie sekw encji am inokwasowej wybranych białek 14-3-3. L 0 9 1 10 - A ra b id o p sis thalia- na, J03868 - Dos taurus, U 05038 - C aenorhabditis elegans, X 79445 - Chlam ydom onas reinhardi, X 76086 - C u cu rbitap ep o , M 7 7 5 18 - D ro so p h ila m elanogaster, U 13419 - E ntam oeba h isto lica , X 80536 - H om o sapiens, L 29150 - L ycopersicon esculentum, S76737 - N icotiana tabacum , S23305 - O vis orien talis, U 15036 - Pisum sativum , D 17445 - R at rattus, X 66206 - Saccharom yces cerevisiae, X 79206 - Saccharom yces pom be, U 24281 - Schistosom a mansoni, X 97724 - Solanum tuberosum , M 86928 -
Xenopus laevis, M 96856 - Zea m ays
http://rcin.org.pl
BIA Ł K A 14-3-3 13
cd. rys. 2
http://rcin.org.pl
14 G. W ILC Z Y Ń SK I, E. M ARK IEW ICZ, A. K U L M A , J. SZO PA
T jest fosforylow ana przez serynow o-treoninow ą kinazę Ber. S fingozyno-zależna kinaza m oże fosfory lować izoform y 14-3-3 (3, C, oraz x [59]. Postuluje się rów nież fosfory lację 14-3-3 przez kinazę inną niż ta, która fosfory luje m otyw SPEK , poniew aż w nerkow ej izoform ie w m iejscu m otywu SPEK w ystępuje fosforylow any m otyw N PEL [3].
LOKALIZACJA KOMÓRKOWA I TKANKOWA
B adania nad lokalizacją mózgowych białek rodziny 14-3-3 pozw oliły stw ierdzić, że pom im o zdecydow anie cytosolow ego w ystępow ania znaczna ich część (40% ) w ykazuje silną i selektyw ną asocjację z błonami. Za w iązanie z błonam i odpo w iedzialny jest N -końcow y fragm ent izoformy T o m asie cząsteczkow ej 12 kD a [44]. U dokum entow ano oddziaływ anie niektórych izoform białka 14-3-3 z fosfo
lipidami [73]. K otw iczenie w błonach m ogłoby nadaw ać tym białkom now ą lub m odyfikow ać posiadaną funkcję. Błonowe izoformy ulegają ekspresji w zróżni
cow any sposób w różnych typach neuronów i rozłożone są w swoistych kom - partm entach błonowych. Izoform y e, r|, y, p i C, są obecne w błonach synaptycznych, brak ich natom iast w błonach m itochondrialnych i otoczkach m ielinow ych. D o
datkow o izoform y r), 8, y są zw iązane z połączeniam i synaptycznym i, a izoform y (3 i ę w ykazują lokalizację presynaptyczną. Te różnice w dystrybucji izoform sugerują, że pełnią one odrębne funkcje w różnych regionach synapsy. T aka lokalizacja białek 14-3-3 w skazuje na ich m ożliwy udział w kontrolow aniu przekaźnictw a nerw ow ego [57].
Udział 14-3-3 w procesie syntezy neurotransmiterów
Pierw szą funkcją przypisaną białkom 14-3-3 była aktyw acja hydroksylaz tyrozyny i tryptofanu, enzym ów biorących udział w syntezie neurotransm iterów , odpow iednio katecholam in i serotoniny [37]. Enzym y te są aktyw ow ane w wyniku fosforylacji przez kinazy białkowe: cA M P-zależną, cG M P-zależną i zależną od jonów w apnia i diacyloglicerolu. Pełną aktyw ność osiągają jednak dopiero po związaniu się z białkami 14-3-3. Region zawierający reszty am inokw asow e od 171 do 213 w izo
form ie T) 14-3-3 oraz sekw encje am inokw asow e od 167 do 209 izoform t i ^ oddziałują z ufosforylow aną hydroksylazą tryptofanu [38]. H ydroksylazy są strukturalnym i hom ologam i składającym i się z dwóch domen, C-końcow ej - katalitycznej i N- końcow ej - regulatorowej. Praw dopodobnie 14-3-3 wiąże się do regulatorow ej do
meny hydroksylazy i aktywuje enzym przez indukcję zm iany konform acji. Tw orzenie kom pleksu hydroksylaza - 14-3-3 m ożliwe jest dopiero po uprzedniej fosforylacji hydroksylazy na reszcie seryny. Form ow anie kom pleksu nie ma jed nak wpływu ani na zakres, ani na swoistość fosforylacji hydroksylazy [28, 37].
http://rcin.org.pl
B IA ŁK A 14-3-3 15
MODULACJA AKTYWNOŚCI KINAZY BIAŁKOWEJ C (PKC)
O statnio wykazano, że polipeptydy 14-3-3 oddziałują z konserw atyw nym m o
tyw em znajdującym się w wielu białkach biorących udział w w ew nątrzkom órkow ym przenoszeniu sygnałów, co w pew nym stopniu wyjaśnia tak szerokie spektrum funkcji przypisyw anych tym polipeptydom . M otyw ten o sekwencji R (S)X 1,2S(P)X (P), gdzie S(P) oznacza fosfoserynę, funkcjonuje praw dopodobnie na zasadzie podobnej do dom en SH2 (ang. Src hom ology2) w iążących się w sposób zależny od sekwencji do reszt fosfotyrozynow ych. Głów nym składnikiem m otywu R (S)X 1,2S(P)X (P) jest reszta fosfoseryny z Arg w pozycjach -3 lub -4 oraz Pro w pozycji +2 i Ser w pozycjach -2 lub -3 [65]. N iezbędność takiego motywu w oddziaływ aniu i aktywacji białek przez polipeptydy 14-3-3 m oże tłum aczyć sprzeczne doniesienia dotyczące regulacji aktywności PKC przez 14-3-3. W ykazano zarów no stym ulujący, jak i ham ujący wpływ 14-3-3 na aktywność enzym atyczną PKC, zależnie od izoform PKC i 14-3-3 użytych do eksperym entów [1, 6, 40, 41, 44, 81,83, 89]. R odzina kinaz białkow ych C składa się co najm niej z 10 izoenzym ów, a ich rozm ieszczenie w różnych tkankach ssaków pokryw a się z dystrybucją 14-3-3 [1]. Izoform a T ham uje PKC w nieobecności klasycznych jej stym ulatorów, takich ja k diacylglicerol i estry forbolu [44]. Obecność tych czynników m oże obniżyć ham ujący efekt po- lipeptydu 14-3-3 do ok. 60%, co sugeruje, że region wiążący diacylglicerol i estry forbolu w PKC (bogata w cysteinę dom ena palców cynkow ych) odgryw a istotną rolę w oddziaływ aniu z 14-3-3. Fosforylacja reszty S erl8 5 w 14-3-3 w zm acnia jego pow inow actw o do PKC in vitro [6]. Izoform a 14-3-3 w ydzielona z mózgu owcy (K CIP1) ma dom enę pseudosubstratow ą dla PKC (rys. 1) pom iędzy am i
nokw asam i od 54 do 57 i wykazuje zdolność ham ow ania aktywności kinazy C.
D om ena ta o sekwencji G ly-A la-A rg-A rg jest rozpoznaw ana przez PKC [34], ale nie ulega fosforylacji, poniew aż w m iejsce Ser lub Thr, znajdujących się w pra
w idłow ym fosforylow anym substracie znajduje się reszta A la [4, 82].
F ragm ent N -końcowy białka 14-3-3 (rys. 1) wykazuje wysoki stopień hom ologii do konserw atyw nego, C -końcow ego odcinka zależnych od jonów w apnia i DAG białek rodziny aneksyn [4]. Aneksyna V jest inhibitorem PKC [74]. Syntetyczny peptyd identyczny z tym regionem aneksyn ham uje wiązanie się PKC do białek RA C K (ang. R A C K - receptors fo r activated C kinase) [60]. W e wszystkich 14-3-3 sekw encja KGDY dom eny aneksynowej jest całkow icie konserw atyw na (rys. 2).
M utacje w tej sekwencji nie miały jednak wpływu na aktyw ność PKC. Być może, w ażniejsza jest tu dalsza, C -końcow a sekw encja dom eny lub hydrofobow ość oto
czenia tego m otywu [7].
B iałka rodziny 14-3-3 m ogą również aktywow ać kinazę białkow ą C [4, 40].
H om olog 14-3-3, Exol, z w ydzielniczych kom órek gruczołu przytarczycznego w pły
wa za pośrednictw em kinazy C na C a2+-zależną egzocytozę [63, 72]. Izoform a 14-3-3 £ aktyw uje około pięciokrotnie izoformę PKC £, około dw ukrotnie izoformy
http://rcin.org.pl
16 G. W ILC Z Y Ń SK I, E. M ARK IEW ICZ, A. K U L M A , J. SZO PA
PKC a , (3 i y izolow ane z m ózgu szczura, myszy oraz wołu, nie w ykazuje żadnego w pływ u na aktyw ność PKC 8. Zaobserw ow ano, że aktyw acja kinazy C zachodzi niezależnie od obecności stym ulatorów PKC, takich jak fosfatydyloseryna (PS) i estry forbolu (PM A), w ym aga jednak obecności jonów w apnia i fosfolipidów [1].
Porów nanie sekwencji w szystkich izoenzym ów PKC z konserw atyw nym m o
tyw em R (S)X 1,2S(P)X (P) białka 14-3-3 wykazało, że najbliższy tej sekw encji m otyw m a izoform a £ PKC w swojej dom enie regulatorow ej, praw dopodobnie więc izoform a ta najsilniej asocjuje z 14-3-3. W yjaśnia to rów nież najw iększy wpływ izoform y £ 14-3-3 na aktyw ność e PKC [1 ,6 ]. Izoform y PKC a , [3, y i 8 zaw ierają sekw encje o m niejszej hom ologii do tego motywu, natom iast izoform a £ w ogóle nie m a sekwencji hom ologicznej do om aw ianego m otywu białka 14-3-3. Zgodnie z oczekiw aniam i polipeptyd 14-3-3 nie w yw ierał lub m iał niew ielki w pływ na aktyw ność izoform a , p, y i 8 kinazy C [3]. Nie wiadom o jednak, czy hom olog m otyw u 14-3-3 w kinazie C (e PKC) jest fosforylowany.
UDZIAŁ W WEWNĄTRZKOMÓRKOWYM PRZENOSZENIU SYGNAŁÓW
Izoform y 14-3-3 P i C, oddziałują i praw dopodobnie aktyw ują kinazę białkow ą Raf. Ekspresja drożdżow ego hom ologu 14-3-3 o sym bolu BMH1 w kom órkach ssaków stym uluje aktyw ność R af zarów no w cy tosolu, jak i błonie cy toplazm atyczn ej.
A socjacja R af z 14-3-3 jest niezbędna w jego aktyw acji przez Ras [25, 26, 39].
Zw iększona ekspresja 14-3-3 w oocytach Xenopus przyspiesza ich dojrzew anie w reakcji zależnej od R af [23,75]. W ykazano, że 14-3-3 oddziałuje z regulatorow ą dom eną R af w regionie CR1 zaw ierającym palce cynkow e, a także z bogatą w reszty S er/Thr dom eną CR2 oraz z dom eną CR3 o w łaściw ościach kinazow ych [25, 39]. Przypuszcza się, że stym ulacja aktywności R af przez 14-3-3 w ynika raczej ze stabilizacji R af przez 14-3-3 niż z bezpośredniej stym ulacji aktyw ności kinazow ej R af [2]. Duży w pływ ma najpraw dopodobniej stopień fosforylacji obu składników , który jednak nie został jeszcze dokładnie poznany. Polipeptyd 14-3-3 i białko szoku term icznego hsp60 blokują defosforylację Raf, a przez to jeg o inakty w ację. N atom iast stwierdzono, że dim er 14-3-3 wiąże się do N -końca (region CR1 i CR2) i C -końca (region CR3) kinazy R af i m oże ją utrzym yw ać w nieaktywnej konform acji [47, 70]. M odel aktywacji R af przez Ras z udziałem polipeptydu 14-3-3 polega pra
wdopodobnie na tym, że zaktyw ow any Ras (R as-G TP) zw alnia 14-3-3 z N -ter- minalnej dom eny CR2 Raf, przy czym 14-3-3 ciągle jeszcze oddziałuje z C -końcow ą dom eną R af praw dopodobnie przez m otyw zaw ierający fosfoserynę w pozycji 621.
N astępnie Ras pow oduje przem ieszczenie się rozwiniętej form y R af do błony, gdzie m oże ulegać dalszej fosforylacji i aktywacji. Szybka zm iana formy aktywnej enzym u do nieaktyw nej m ożliw a jest dzięki tem u, że 14-3-3 jest wciąż zw iązany do C -końca
http://rcin.org.pl
B IA Ł K A 14-3-3 17
kinazy Raf. M odel ten sugeruje, że 14-3-3 nie jest bezpośrednio regulatorem kinazy białkowej Raf, ale stabilizuje pew ną jej konform ację [70].
A ktyw acja R af i transport do błony cytoplazm atycznej um ożliw ia jego oddzia
ływ anie z innym i białkam i funkcjonującym i rów nież jako przekaźniki w ew nątrz
kom órkow e. Serynow o-treoninow a kinaza białkow a c-Bcr tworzy przez dim er 14-3-3 kom pleks z aktyw nym , zw iązanym z błoną Raf, co um ożliw ia ich w łaściw ą orientację w błonie w zględem siebie i ich substratów [13]. Ludzka izoform a 14-3-3 T, spe
cyficzna dla lim focytów T, wiąże się i jest fosforylow ana na reszcie Ser przez kinazę Ber. K inaza Ber m a w swej sekwencji regiony podobne do dom en CR1 i CR2 kinazy Raf.
P ow stające w wyniku transform acji nowotworow ej białko fuzyjne B cr-A bl (gen kodujący B er je st m iejscem dwóch m ożliwych pęknięć chrom osom u i wzajem nej translokacji z protoonkogenem c-abl) m oże fosforylow ać 14-3-3 na reszcie Tyr [68].
Izoform y 14-3-3 asocjują z antygenem T (M T) wirusa polyom a (polyom a virus m iddle T a n tig e n ), który z kolei oddziałuje z innymi białkam i zw iązanym i z regulacją proliferacji kom órki. M T wiąże się do czynników She i Grb2, białek w iążących G TP i regulujących aktywność Ras, nadto do białek SOS, a także do kinazy 3-fosfoinozytolu (PI3-kinaza), która m odyfikuje aktywność kinazy R af [67]. D alsze badania wykazały bezpośrednie oddziaływanie izoformy i 14-3-3 z katalityczną podjednostką PI3-kinazy w stym ulowanych antygenem M T limfocytach T. M T antygen asocjuje z dom enam i SH2 i SH3 regulatorowej podjednostki PI3-kinazy.
Sugeruje to obecność dużego kom pleksu sygnalnego, w którym białko 14-3-3 stanowi platform ę (scaffold) dla interakcji dom en SH2 i SH3 [11]. Bardzo podobne jest działanie izoform 14-3-3 £ i które asocjują z konstruktem rekom binacyjnym zaw ierającym C -term inalne dom eny SH2 i SH3 onkoproteiny Vav. O nkoproteina działa praw dopodobnie jako swoisty dla kom órek hem atopoetycznych czynnik akty
wujący w ym ianę G DP na G TP w białkach rodziny Ras. Izoform y 14-3-3 nie wiążą się jednak z pełną cząsteczką rekom binacyjnego Vav, praw dopodobnie więc białka te nie oddziałują in vivo [77].
Dalsze pow iązanie 14-3-3 z kom órkow ym przekazyw aniem sygnałów w ykazują badania, w których stw ierdzono, że eukariotycznym czynnikiem , który aktyw uje exoenzym S z Pseudom onas aeruginosa, jest izoform a £ 14-3-3. Exoenzym S m a zdolność A D P-rybozylacji białek Ras i innych białek wiążących GTP. A DP-ry- bozylacja Ras-podobnych, białek wiążących GTP zaburza transport pęcherzykow y podczas infekcji przez patogeny. Ponadto wykazano, że nie istnieje bezpośrednie oddziaływ anie pom iędzy A D P-rybozylotransferazą a 14-3-3 [27].
Z identyfikow ano u drożdży S. cerevisiae dw a hom ologii 14-3-3, a m ianow icie BMH1 i BM H2, biorące udział w transporcie pęcherzykowym . BM H2 i w m niej
szym stopniu BMH1 przyw racają cechy szczepu dzikiego m utantom drożdżow ym m ającym delecję w genie kodującym ciężki łańcuch klatryny [31]. Roślinne 14-3-3
http://rcin.org.pl
18 G. W ILC ZY Ń SK I, E. M ARK IEW ICZ, A. K U LM A , J. SZ O P A
z Arabidopsis uzupełniają m utanty drożdżowe, w których w prow adzono zm iany w genach kodujących BMH1 i BM H2 [35]. Sugeruje to albo niesw oistość izoform 14-3-3 w ich oddziaływ aniu z innymi białkam i, albo że ich szerokie spektrum aktyw ności zw iązane jest z obecnością motywu R (S)X 1,2S(P)X (P).
KONTROLA CYKLU KOMÓRKOWEGO
W kom órkach drożdżow ych obok hom ologów 14-3-3 opisanych sym bolam i BMH1 i BM H2 (S . cerevisiae) zidentyfikow ano dw a kolejne hom ologi rad24 i rad25 (S . pom be). Delecja obu izoform 14-3-3 w w ym ienionych szczepach drożdży je st letalna. O porność kom órek drożdżow ych na prom ieniow anie UV jest zależna od ekspresji hom ologów 14-3-3, rad24 i rad25. Białka te są rów nież zaangażow ane w kontrolę cyklu kom órkow ego, a dokładniej w naprawę DNA. M utanty ze zm ianam i w genach rad24 i rad25 w chodzą wcześniej w m ejozę [24].
F osfatazy cdc25 pełnią kluczow ą rolę w kontroli cyklu kom órkow ego przez w ybiórczą defosforylację i następującą aktywację kinaz zależnych od cyklin. W y
kazano oddziaływ anie ludzkich fosfataz cdc25A i cdc25B z dw iem a izoform am i 14-3-3, a m ianow icie z e oraz P zarówno in vitro, jak i in vivo. Polipeptyd 14-3-3 nie w pływ a jednak na aktyw ność fosfatazow ą cdc25A. K inaza Raf, oddziałująca z 14-3-3, wiąże się również z cdc25A i stym uluje jej aktyw ność fosfatazową. Dodać należy, że białko 14-3-3 nie zm ienia aktywności kinazowej R af w zględem cdc25A.
P raw dopodobnie polipeptyd 14-3-3 ułatwia asocjację R af z cdc25 in vivo biorąc udział w połączeniu między kom órkow ym przenoszeniem sygnałów a cyklem ko
m órkow ym . Należy również dodać, że podobnie jak w przypadku kinazy Raf-1, fosfataza cdc25 nie wiąże się bezpośrednio z białkiem 14-3-3 w w arunkach in vitro [18, 29].
W kom órkach ssaków wykazano udział 14-3-3 w kontroli cyklu kom órkowego przez jego oddziaływ anie z keratynam i K8 i K I 8 filam entów pośrednich tkanek nabłonkow ych. O ddziaływ anie to jest regulow ane przez fosforylację. Białko 14-3-3 oddziałuje preferencyjnie z K18 podczas fazy S i w czasie przejścia kom órek z fazy G2 do M. W prow adzenie m utacji w regionie K I 8 ulegającym fosforylacji uniem ożliw ia pow stanie tetram erycznych filam entów keratynow ych K8-K18 w ko
m órkach zatrzym anych na granicy faz G2/M . Znanym i białkam i asocjującym i z K 8-K 18 jest katalityczny fragm ent dom eny PKC £ i dwa polipeptydy (hsp70) z rodziny białek szoku cieplnego [48].
INNE FUNKCJE
B iałka 14-3-3 kom pleksują z histonami i regulują ich fosforylację i defosforylację.
Z dolność w iązania się kwaśnych białek 14-3-3 z histonam i w ykazano przy pom ocy
http://rcin.org.pl
BIA Ł K A 14-3-3 19
czynnika sieciującego (ang. dim ethyl suberim idate) i chrom atografii na złożu z im m obilizow anym i histonam i. K onsekw encją tw orzenia się takich kom pleksów m o
głaby być regulacja ekspresji genów. Polipeptyd 14-3-3 stym uluje fosforylację hi- stonów przez PKC, ham uje natom iast ich defosforylację katalizow aną przez Ser/Thr- specyficzne fosfatazy 1 (PP1) i 2A (PP2A). H am ow anie defosforylacji histonów przez 14-3-3 m oże być konsekw encją zarów no interakcji z fosfatazą, jak i z histonam i [16]. W ykazano również zaham owanie defosforylacji, a zatem inaktywacji, zw ią
zanego z błoną R af przez fosfatazy PP1 i PP2A i tyrozynow o-specyficzną PTP1B w obecności 14-3-3 C, [21].
W proliferujących fibroblastach poziom jednej z izoform 14-3-3 jest znacznie obniżony w porów naniu do kom órek transform ow anych wirusem SV40 [15].
W ykazano rów nież oddziaływ anie in vitro 14-3-3 z białkiem NS2 parvow irusa m yszy (ang. m inute virus o f mice) zw iązanego z prow irusow ą am plifikacją DNA, ja k i efektyw ną produkcją w irusa w kom órkach gospodarza [14].
Izoform y 14-3-3 asocjują z A TP-zależnym białkow ym czynnikiem (am i) wątroby szczura, który stym uluje im port białek prekursorow ych do izolow anych m itochon- driów [8].
Izoform ie £ 14-3-3 przypisyw ano rów nież aktyw ność fosfolipazy A2 [92], ale ostatnie badania z zastosow aniem białek rekom binacyjnych wykazały brak tej aktyw ności [64, 69].
U dokum entow ano oddziaływanie 14-3-3 z łożyskow ą glikoproteiną G PIb-IX (re
ceptor czynnika von W illebranda) pośredniczącą w adhezji łożyska do naczyń krw io
nośnych [22, 87].
B iałka 14-3-3 biorą udział w program owanej śm ierci kom órki (apoptozie). C zyn
nik prom ujący w ejście kom órki w apoptozę - BAD, po fosforylacji przez inne czynniki w ew nątrzkom órkow e (IL-3) na reszcie Ser wiąże się z 14-3-3 w cytosolu, uniem ożliw iając wejście komórki w stan apoptozy. Niefosforylow any BAD tworzy dim ery w błonie z BCL-XL i aktywuje w ejście kom órki na drogę apoptozy [91].
B iałko 14-3-3 jest fosforylow ane przez sfingozyno-zależną kinazę białkow ą [59].
W cyklu sfingom ielinow ym , zaktyw ow ana sfingom ielinaza przekształca błonow ą sfingom ielinę w ceram idy, będące znanymi czynnikam i ham ującym i wzrost kom órki oraz indukującym i apoptozę [32].
O statnio m etodą screeningu dw uhybrydow ego (ang. two hybrid screening system ) w ykazano oddziaływ anie 14-3-3 z białkiem A20 - inhibitorem apoptozy wywołanej czynnikiem m artw icy nowotworu. W im m unoprecypitacie ekstraktu kom órek no
w otw oru zidentyfikow ano białka: 14-3-3, c-R af i A20. W spółim m unoprecypitacja c-R af i A 20 zależy od obecności 14-3-3, co sugeruje jego adaptorow ą funkcję w oddziaływ aniu kinazy R af i białka A20 [86].
A nalizą białek ekstraktu mózgu szczura precypitow anych za pom ocą poliklo- nalnych przeciw ciał skierow anych przeciw transferazie sjalowej wykazano obecność białka 14-3-3. Biorąc pod uwagę, że aktyw ność transferazy jest regulow ana przez
http://rcin.org.pl
20 G. W ILC ZY Ń SK I, E. M ARK IEW ICZ, A. K U L M A , J. SZOPA
kinazę białkow ą C oraz że 14-3-3 wpływa na aktyw ność PKC, m ożna przypuszczać, że polipeptyd 14-3-3 ma rów nież regulatorow y w pływ na aktyw ność transferazy sjalowej [30].
Pom im o że aktywności przejaw iane przez rodzinę białek 14-3-3 są dobrze zde
finiow ane, to jednak zasób informacji o sposobie regulacji tych aktyw ności, np.
w rozw oju organizm u czy przez warunki środow iskow e jest dość skąpy. U D rosophila m elanogaster poszczególne izoformy 14-3-3 ulegają ekspresji w tkankow o-spe- cyficzny sposób. Gen kodujący 14-3-3 charakteryzuje się zróżnicow anym w zorem ekspresji, syntetyzowany jest mRNA o trzech różnych długościach, z których każdy pojaw ia się w ściśle określonym przedziale czasow ym w rozwoju organizm u. m R N A 0 długości lk b jest intensywnie produkow any w zapłodnionym jaju i dziedziczony m atczynie, m RNA o długości 1,9 kb pojaw ia się w em brionach i utrzym uje się na w ysokim poziom ie podczas em briogenezy, a 2,9 kb mRNA ulega specyficznej ekspresji w tkance nerwowej głowy. Trudno jest jed nak połączyć te inform acje ze sposobem , w jaki poszczególne izoformy są regulow ane oraz z funkcją, jak ą pełnią w ściśle określonych przedziałach czasow ych [78]. M utanty D rosophila ze zm ianą w genie kodującym 14-3-3 w tzw. m ushroom bodies miały obniżoną zdolność uczenia się i rozpoznaw ania zapachów. M utacja nie m iała wpływu na anatom ię m ózgu. W ysunięto przypuszczenie o uczestnictw ie białek 14-3-3 w procesach uczenia się i zapam iętyw ania [76].
ROŚLINNE BIAŁKA 14-3-3
B iałka 14-3-3 zostały również zidentyfikow ane w wielu organizm ach roślinnych, w tym u Arabidopsis [51, 71], w ryżu [54], pom idorze [46], kukurydzy [84], dyni patison [79, 80] i ziem niaku [88]. Polipeptydy roślinne w ykazują w ysoki, około 60% stopień homologii do izoform ssaczych zarów no w sekwencji nukleotydow ej, jak i am inokwasow ej (rys. 2). Roślinne 14-3-3 m ają właściwości analogiczne do ich hom ologów zw ierzęcych. Izoform y izolow ane z A rabidopsis, szpinaku, grochu 1 ryżu ham ują aktyw ność PKC z mózgu owcy [33]. R ekom binacyjna izoform a co 14-3-3 z Arabidopsis aktywuje enzym exoS oraz pochodzące z m ózgu szczurzego hydroksylazę tryptofanu i PKC w sposób podobny do wołowej 14-3-3. Jak w spo
m niano wcześniej, rekom binacyjne białko 14-3-3 pochodzące z A rabidopsis p rzy w raca cechy typu dzikiego szczepom drożdżow ym o zm utow anych białkach 14-3-3 [53].
R oślinna izoform a 14-3-3 co wiąże jeden jon Ca +. R oślinne hom ologi m ają konserw atyw ną resztę Gly w C -końcow ym regionie [52]. Region ten przypom ina m otyw „E F -hand” wiążący C a2+. R eszta ta jest w ażna dla funkcji tego m otywu i nie w ystępuje w ssaczych izoform ach, nie w ykazano rów nież w iązania jonów C a"+ przez te izoformy [7].
http://rcin.org.pl
BIA ŁK A 14-3-3 21
14-3-3 a regulacja transkrypcji. Jako jedne z pierw szych zostały sklonow ane i w ydzielone hom ologi 14-3-3 z A rabidopsis i kukurydzy i nazw ane „G F 14” z pow odu ich zdolności wiązania się do G boxow (G-box Factor, 14-3-3 hom olog) [50]. R egulacja ekspresji genów na poziom ie transkrypcji zależy od interakcji se
kw encji regulatorow ych genu z elem entami cis oraz czynnikam i trans. M otywy sekw encji DNA, tzw. „G -boxy” (5 ’-C C A C G TG G -3’) są ważnym elem entem obe
cnym w wielu genach, w tym w kodującym dehydrogenazę alkoholow ą i genach indukow anych czynnikam i środowiska, takich jak geny dla syntazy chalkonu i małej podjednostki R uBisC o [51]. Dalsze badania wykazały jednak, że GF14 nie od
działuje bezpośrednio z DNA, a wiązanie do sekwencji „G -box” odbyw a się przez inne białko o nazw ie G -box Binding F actor (GBF). GF-14 nie m a bow iem m otywu palców cynkow ych, charakterystycznego dla białek klasy bZIP w iążących DNA.
M a natom iast pow tórzony m otyw Ileu-Leu (niepełny m otyw zam ka leucynow ego) odpow iedzialny za oddziaływ anie białko-białko, oraz kwaśny N -końcow y fragm ent m ogący tw orzyć am fipatyczną a-helisę charakterystyczną dla czynników aktyw u
jących transkrypcję [85]. Równie istotną dom eną obecną w GF14 jest m otyw „EF- h and” , zlokalizow any w C -końcow ym fragm encie białka i odpow iedzialny za w iązanie jonów w apnia dzięki obecności kwaśnych reszt am inokw asow ych zlo
kalizow anych wewnątrz pętli strukturalnej domeny: helisa-pętla-helisa. M otyw
„E F -hand” jest wysoce konserwatywny we wszystkich 14-3-3 zarówno roślinnych, jak i zw ierzęcych. Rekom binacyjny GF14 z Arabidopsis wiąże jony w apnia in vitro w w arunkach fizjologicznych (1 atom na m onom er) i jest fosforylow any w w arunkach fizjologicznych na reszcie Ser przez endogenną kinazę białkową. Poprzez w iązanie się do m otyw ów ,,G -box” białka 14-3-3 biorą udział w regulacji transkrypcji, jak rów nież stanow ią połączenie pom iędzy szlakam i przenoszenia sygnału i czyn
nikam i trans w iążącym i DNA. Jako część kom pleksu białkow ego w iążącego się do elem entów prom otora licznych genów, GF14 m oże stanowić ważny regulator wzrostu, rozwoju i odpowiedzi środowiskowej roślin [52].
O statnio zidentyfikow ano gen kodujący GF14 określony jako G R F-G FM ^. P o rów nanie sekwencji tego genu z sekwencjam i cD N A kodującym i inne białka 14-3-3 w ykazało, że najbardziej konserw atyw ne dom eny kodow ane są przez pierw sze trzy eksony, a charakteryzujący się dużą różnorodnością C-koniec przez zm ienny czwarty ekson specyficzny dla danej izoformy. Ekspresja genu [3-glukuronidazy, znajdującej się pod kontrolą prom otora genu GRF-G F14^ w transgenicznych Arabidopsis w y
kazała jeg o najw yższą aktywność w korzeniach zarówno dojrzałych, jak i m łodych roślin. W m łodych kwiatach najsilniejszą ekspresję zlokalizow ano w pąkach, w dojrzałych kwiatach - w znamieniu, pręcikach i pyłku. W niedojrzałych ow ocach aktyw ność prom otora GF14^ początkow o obserw ow ano w podstaw ie słupka, a n a
stępnie w całych dojrzałych owocach. H ybrydyzacja in situ antysensem R N A /R N A w ykazała najw yższą ekspresję m RNA w tkance epiderm alnej korzeni, okw iacie, płatkach kw iatow ych, pączkach kwiatowych, kom órkach papillam ych kw iatów , ow o
http://rcin.org.pl
22 G W ILC ZY Ń SK I, E. M ARK IEW ICZ, A. K U L M A , J. SZO PA
cach i endosperm ie dojrzałych nasion. Dane te w skazują, że ekspresja 14-3-3 je st kom órkow o- i tkankow o-specyficzna [20], podobnie jak to obserw ow ano d la
ssaczej tkanki m ózgowej.
U dział 14-3-3 w przenoszeniu sygnałów ze środow iska zew nętrznego. B iałka 14-3-3 m ogą też być czynnikam i zam ieniającym i sygnał zew nętrzny w stym ulację specyficznej transkrypcji. Podczas infekcji jęczm ienia przez patogenny grzyb (E ry- siphe gram inis) znacznie wzrasta poziom m R N A kodującego białko 14-3-3. In
dukow ane nagrom adzenie 14-3-3 w kom órkach jęczm ien ia koreluje się z innym i formam i odpow iedzi na infekcję, np: z nabytą odpornością na następną infekcję czy tw orzeniem się wtórnych struktur ściany kom órkow ej. Sugeruje się, że p o d w yższony poziom 14-3-3 w odpowiedzi rośliny na patogen m oże być zw iązany z jeg o wpływ em na aktyw ność kinaz białkowych. B adania nad kom órkam i roślinnym i wskazują, że ich odpow iedzią na inwazję patogenu są zm iany w fosforylacji białek [12]. Udział 14-3-3 w zm ianie wzoru fosforylacji białek w roślinach pod w pływ em patogenu nie je st jednak udokum entow any, opiera się raczej na analogii z kom órkam i zw ierzęcym i i znanym i aktywnościam i tych polipeptydów . N iedaw no stw ierdzono, że roślinny receptor toksyny grzybowej - fusikoksyny (FC BP) należy do rodziny białek 14-3-3 [45, 58, 66]. Związany z błoną receptor FC B P w iąże fusikoksynę (FC) i kom pleks ten aktyw uje H +-zależną A TP-azę. Przypuszcza się, że zm iany m etaboliczne w yw ołane przez fusikoksynę i aktyw ację FCBP, m ogą przebiegać przez swoiste reakcje fosforylacji angażujące kinazy białkowe. O dcinek C -końcow y roślinnej H +-A TPazy ma kilka miejsc potencjalnej fosforylacji, a defosforylacja enzym u prow adzi do zwiększonej jego aktywności. K inaza zależna od jonów w apnia i fosfolipidów , fosforylująca H+-ATPazę została częściow o oczyszczona z korzeni ow sa. Proponuje się model, w którym wiązanie FC do FC B P w pływ a na aktyw ność kinazy białkow ej, tak że ATPaza nie ulega fosforylacji. B iałko 14-3-3 pełni tu funkcję nie tylko receptora, wiążąc fusikoksynę, ale rów nież reguluje kinazę białkow ą sw oistą dla ATPazy [62] w sposób podobny do regulacji PKC w kom órkach zw ie
rzęcych [45].
Zaobserw ow ano, że białka 14-3-3 biorą także udział w procesach adaptacji roślin do w arunków środow iska. Z biblioteki cDNA etiolow anych i zaaklim atyzow anych do niskiej tem peratury kiełków Arabidopsis w yizolow ano dw a klony RCI1 i R CI2 (ang. R are C old-Inducible), wykazujące wysoki stopień hom ologii do rodziny białek 14-3-3. E kspresja obu genów jest indukow ana niską tem peraturą, niezależnie od organu rośliny (w równych ilościach w liściach, łodygach i kw iatach) oraz jej stadium rozw ojow ego (w etiolow anych kiełkach i w dorosłych roślinach). C hociaż oba geny kodują bardzo podobne białka, ich ekspresja w ydaje się być regulow ana w sposób zróżnicow any. Kodujący R C I1 m RNA nagrom adza się szybciej i w w iększej ilości niż m R N A dla RCI2, co świadczy o zróżnicow anej odpow iedzi tych genów na stres zim na. Po przeniesieniu roślin do tem peratury pokojowej ilość m R N A dla RCI1 zm niejsza się szybciej, osiągając praw idłow y poziom po 24 godzinach,
