Przygotowując homogeniczne, fizyczne mieszaniny dwuskładnikowe substancji leczniczych z pomocniczymi, odważano w naczynkach wagowych odpowiednie ilości substancji, a następnie przenoszono te substancje do tygielka porcelanowego i dokładnie mieszano łopatką. Skład chemiczny analizowanych mieszanin przedstawiono w Tabeli 5.
Tabela 5. Skład ilościowy analizowanych mieszanin substancji leczniczych z pomocniczymi.
Substancje
lecznicze Substancje pomocnicze Skład mieszanin
Acetazolamid
Składniki mieszano w stosunku molowym wówczas, gdy masy molowe substancji leczniczej i pomocniczej były podobnego rzędu lub w stosunku masowym, gdy masy molowe obu substancji różniły się znacznie.
50 3.1. Różnicowa kalorymetria skaningowa
Analizę DSC przeprowadzono przy użyciu różnicowego kalorymetru skaningowego DSC 822e Mettler Toledo z oprogramowaniem komputerowym StareSystem. Próbkę o masie ok. 4-5 mg umieszczano w 40 μl aluminiowym tygielku, szczelnie zamkniętym pokrywką z dwoma otworkami, natomiast próbkę odniesienia stanowił pusty tygielek, również szczelnie zamknięty pokrywką z dwoma otworkami. Pomiar wykonywano w warunkach dynamicznych, w zakresie temperatur 25–300 C w atmosferze gazu obojętnego – azotu z przepływem 70 ml/min. Próbkę badaną i odniesienia ogrzewano z szybkością wzrostu temperatury 10 C/min. Po osiągnięciu temperatury 300 C komorę pomiarową schładzano ciekłym azotem do temperatury pokojowej.
Z krzywej DSC wyznaczano dla każdego piku, temperaturę początku piku Ti, temperaturę piku Tp oraz wartość ciepła przemiany fazowej i wartość znormalizowaną ciepła (ciepło właściwe).
3.2. Różnicowa analiza termiczna i termograwimetria
Badania termoanalityczne wykonano za pomocą derywatografu OD-103. Krzywe DTA, TG i DTG rejestrowano w jednakowych warunkach; 100 lub 200 mg odważki umieszczone w zestawie czterech tygli talerzowych o średnicy 18,5 mm każdy, ogrzewano z szybkością wzrostu temperatury 5oC/min w statycznej atmosferze powietrza, w zakresie temperatur 20–700 C, stosując -Al2O3 jako substancję odniesienia.
Interpretacja krzywych DTA polegała na wyznaczeniu dla każdego z pików, temperatury początku piku Ti, temperatury piku Tp, temperatury końca piku Tf oraz zakresu temperatur endotermicznych i egzotermicznych pików (∆T).
Bazując na krzywych TG odczytywano temperatury odpowiadające początkowi ubytku masy T0 oraz kolejnym ubytkom masy – 1, 5, 15, 30, 50, 75 i 100% (T1, T5, T15, T30, T50, T75, T100), dla których wykonano analizę chemometryczną.
Natomiast w przypadku krzywych DTG, wyznaczano temperaturę początku piku Ti, temperaturę piku Tp i temperaturę końca piku Tf.
51 3.3. Termomikroskopia
Pomiar temperatury topnienia z jednoczesną obserwacją zachowania się substancji badanej podczas ogrzewania, wykonano przy użyciu mikroskopu BX41 Olympus ze stolikiem grzewczym. Próbki badane poddano programowanemu ogrzewaniu w zakresie 20–350°C przy szybkości wzrostu temperatury 5°C/min i obserwowano w świetle spolaryzowanym przemiany fazowe zachodzące w analizowanym materiale.
3.4. Spektroskopia w podczerwieni
Widma w podczerwieni rejestrowano za pomocą spektrofotometru IR, Specord M-80, w zakresie spektralnym 4000–200 cm-1 w skali transmitancji, stosując pastylki z KBr.
Przygotowano je przez dodanie do 100 mg spektralnie czystego KBr (Uvasol , Merck, Niemcy), 1 mg sproszkowanej substancji badanej. Oba składniki dokładnie mieszano w celu uzyskania mieszaniny homogenicznej i prasowanopod ciśnieniem 10 atm, przy zastosowaniu prasy mini-press, otrzymując przeźroczystą pastylkę.
Interpretacja widm IR, bazująca na znajomości struktury badanego związku, polegała na ustaleniu obecności wchodzących w skład danego związku grup funkcyjnych, poprzez określenie dokładnych obszarów w zakresie spektralnym 4000–200 cm-1, w których występują charakterystyczne dla tych grup funkcyjnych pasma absorpcyjne.
3.5. Dyfrakcja rentgenowska proszkowa
Analizę dyfrakcyjną wykonano za pomocą dyfraktometru D2 Phaser z detektorem paskowym w technologii LynxeyeTM, przy napięciu 30 kV i natężeniu 10 mA. W pomiarach zastosowano filtr niklowy dla promieniowania CuKα (λ = 0,154060 nm), w zakresie kąta 2θ, od 7 do 55°, z wielkością kroku kąta 2θ 0,02° i czasem pomiaru pojedynczego impulsu 0,10 s/krok.
Próbkę z niewielką ilością badanej substancji, roztartej uprzednio w moździerzu porcelanowym, umieszczano w kuwecie krzemowej formując możliwie gładką powierzchnię przy pomocy szklanej płytki. Następnie kuwetę z badaną substancją zamocowano w uchwycie goniometru.
Dane dyfrakcyjne uzyskano w postaci dyfraktogramów przedstawiających zależność intensywności (liczba zliczeń) refleksów dyfrakcyjnych od kąta dyfrakcji (odbicia braggowskiego) 2θ przy użyciu oprogramowania Diffrac.Suite.
52 3.6. Metody analizy wielowymiarowej
Do interpretacji wyników analizy termograwimetrycznej i widm w podczerwieni zastosowano metody analizy wielowymiarowej – analizę skupień (CA) i analizę głównych składowych (PCA). Obliczenia przeprowadzono za pomocą programu komputerowego Statistica wersja 10 (StatSoft Inc., USA).
Przedmiotem analizy chemometrycznej były wielowymiarowe zbiory danych pomiarowych zestawionych w postaci macierzy, które składały się z kolumn oraz z wierszy.
Kolumny przedstawiały zmienne, natomiast wiersze badane próbki, którymi były:
Ø substancje lecznicze,
Ø dwuskładnikowe mieszaniny substancji leczniczych z substancjami pomocniczymi o malejącej zawartości substancji leczniczej, natomiast wzrastającej zawartości substancji pomocniczej,
Ø substancje pomocnicze.
Dla pierwszej grupy macierzy, w kolumnach znajdowały się wyniki analizy termograwimetrycznej, tj. wartości temperatur odpowiadające początkowi rozkładu (T0) i kolejnym ubytkom masy (T1, T5, T15, T30, T50, T75 i T100). Natomiast w drugiej grupie macierzy kolumny przedstawiały wartości transmitancji w procentach odpowiadające kolejnym liczbom falowym, wyznaczonym na podstawie widm w podczerwieni. Do analizy wybrano dwa zakresy spektralne: 3600–2800 oraz 1800–1000 cm -1, ze względu na możliwość wykrycia zmian w tych obszarach w przypadku wystąpienia niezgodności między składnikami. Pierwszy zakres spektralny obejmuje pasma absorpcyjne charakterystyczne dla substancji pomocniczych i leczniczych, które różnią się rodzajem pasm ze względu na ugrupowania występujące w strukturach tych substancji. Drugi z kolei obszar spektralny częściowo pozbawiony jest pasm absorpcyjnych substancji pomocniczych, pomagając dostrzec zmiany zachodzące w substancji leczniczej.
Macierze użyte do obliczeń za pomocą wielowymiarowych technik eksploracyjnych zawierały 8 kolumn w przypadku analizy krzywych TG i 402 kolumny w przypadku analizy widm IR, natomiast liczba wierszy wynosiła 7 lub 11, w zależności od liczby badanych mieszanin (Tabela 5). Obliczenia techniką analizy skupień przeprowadzono z użyciem metod aglomeracji: pojedynczego wiązania oraz metody Warda, przy zastosowaniu odpowiednich miar odległości: odległości euklidesowej oraz 1-r Persona. Obliczenia techniką analizy głównych składowych wykonano bez rotacji oraz stosując algorytm rotacji, varimax surowa i varimax znormalizowana.
53
WYNIKI DOŚWIADCZEŃ
I DYSKUSJA
54