Model symuluj cy warunki panuj ce w organizmie ywym

jakie panuj w organizmie ywym.

wysiania komórek na materiaø przedstawiono w pkt. 1.7.3.3. Przeprowadzone badani charakter pilota owy, a przedstawione wyniki obrazuj

modelu.

Najwi kszym problemem byø

kiedy insert byø obrócony. Wynikaøo to z

insert nie pøywaø, a jednocze nie poziom medium wyschøy i komórki nie ulegøy uszkodzeniu. Do osadzenia

fibroblasty, z tego wzgl du, e ich adhezja i proliferacja przebiega Na Rys. 54 przedstawiono

rozpocz cia eksperymentu. bardzo maøa (Rys. 55 A)

kontrolnej TCPS. Taki wynik mógø wiadczy o tym, e liczba fibroblastów osadzonych na membranie byøa za maøa, ale równie

do powierzchni i ulegøa odczepieniu po 14 dniach hodowli (R

cz ci membrany jest znacznie wi ksza i zbli ona do liczby komórek obserwowanych na próbie kontrolnej (Rys. 56

liczby komórek fibroblasty równie zdj cia hMSC (Rys. 56 nie zauwa ono ró nic mi dzy kontrolnej TCPS.

Rys. 55 Morfologia fibroblastów odwróconym insercie (A) i

h, zdj cia wykonane przy 5

III CZ DO WAIDCZALNA

WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Model symuluj cy warunki panuj ce w organizmie ywym

a byøa próba stworzenia warunków jak najbardziej zbli onych do tych jakie panuj w organizmie ywym. Szczegóøy hodowli oraz schemat przedstawiaj cy sposób wysiania komórek na materiaø przedstawiono w pkt. 1.7.3.3. Przeprowadzone badani

a przedstawione wyniki obrazuj mo liwo rozwoju opracowanego

Najwi kszym problemem byøo osadzenie komórek na dolnej stronie membranie, w momencie kiedy insert byø obrócony. Wynikaøo to z konieczno ci zapewnienia takich waru

, a jednocze nie poziom medium byø na tyle wysoki

nie ulegøy uszkodzeniu. Do osadzenia na dolnej stronie zostaøy wybrane fibroblasty, z tego wzgl du, e ich adhezja i proliferacja przebiegaj s

przedstawiono zdj cia membrany i pøytki hodowlanej wykonane po 24 h od rozpocz cia eksperymentu. Jak mo na zauwa y liczba fibroblastów

w porównaniu do liczby fibroblastów obserwowanych na próbie kontrolnej TCPS. Taki wynik mógø wiadczy o tym, e liczba fibroblastów osadzonych na membranie byøa za maøa, ale równie , e cz komórek nie przylgn øa

egøa odczepieniu po obróceniu insertu. Kolejne badania przeprowadzon hodowli (Rys. 56) pokazuj , e liczba fibroblastów hodowanych

jest znacznie wi ksza i zbli ona do liczby komórek obserwowanych na ys. 56 A, C). wiadczy to o tym, e pomimo niewielkiej pocz tkowej liczby komórek fibroblasty zaadherowaøy do podøo a i zacz øy si namna a .

ys. 56 B, D). Równie w tym przypadku, co jest bardzo korzystne, mi dzy morfologi i liczb komórek na membranie

ibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany odwróconym insercie (A) i w próbie kontrolnej – na dnie pøytki TCPS (B).

dj cia wykonane przy 5-krotnym powi kszeniu po wybarwieniu MTT

I CZ DO WAIDCZALNA

WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

jak najbardziej zbli onych do tych Szczegóøy hodowli oraz schemat przedstawiaj cy sposób wysiania komórek na materiaø przedstawiono w pkt. 1.7.3.3. Przeprowadzone badania miaøy mo liwo rozwoju opracowanego

osadzenie komórek na dolnej stronie membranie, w momencie konieczno ci zapewnienia takich warunków, aby na tyle wysoki, aby membrany nie na dolnej stronie zostaøy wybrane j szybciej ni hMSC. wykonane po 24 h od Jak mo na zauwa y liczba fibroblastów na membranie jest w porównaniu do liczby fibroblastów obserwowanych na próbie kontrolnej TCPS. Taki wynik mógø wiadczy o tym, e liczba fibroblastów osadzonych na øa wystarczaj co mocno po obróceniu insertu. Kolejne badania przeprowadzone hodowanych na dolnej jest znacznie wi ksza i zbli ona do liczby komórek obserwowanych na o tym, e pomimo niewielkiej pocz tkowej i zacz øy si namna a . Wykonano , co jest bardzo korzystne, na membranie, i na próbie

powierzchni membrany przy TCPS (B). Czas hodowli 24 po wybarwieniu MTT.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 56 Morfologia fibroblastów hodowanych na górnej powierzchni TCPS (C, D). Czas hodowli wybarwieniu MTT.

2.4.3.5. Dyskusja wyników

Gøównym celem bada w ko ludzkie fibroblasty i hMSC

po wszczepieniu, b d reagowaøy na wøa ciwo ci mikrostrukturalne membran. Wiadome jest, e w warunkach panuj cych w organizmie komórki ró nych typów kontaktuj i ko

si ze sob , co wpøywa na ich proliferacj czy ró nicowanie

w niniejszej pracy przeprowadzono badania w kokulturach, b d ce znacznie bardziej zaawansowanym sposobem bada cytozgodno ci nowych biomateriaøów.

Przedstawione wyniki

fibroblastów jest ni sza ni na próbie kontrolnej TCPS (Rys. 51). Odwrotn sytuacj obserwujemy w przypadku hMSC, gdzie liczba komórek na próbie kontrolnej TCPS jest znacz co ni sza ni na membranach (

proliferacji komórek hodowanych w separowanych warunkach (Rys. 45 A, B), mo na zauwa y , e proliferacja fibroblastów po 14 dniach hodowli na membranach jest ni sza III CZ DO WAIDCZALNA

WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Morfologia fibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany (A) powierzchni membrany (B) i w próbie kontrolnej

hodowli 14 dni, zdj cia wykonano przy 5-krotnym powi kszeniu

Dyskusja wyników

Gøównym celem bada w kokulturach komórkowych byøo sprawdzenie czy komórki ludzkie fibroblasty i hMSC – z którymi materiaø b dzie miaø kontakt w organizmie ludzkim po wszczepieniu, b d reagowaøy na wøa ciwo ci mikrostrukturalne membran. Wiadome jest,

e w warunkach panuj cych w organizmie komórki ró nych typów kontaktuj i ko si ze sob , co wpøywa na ich proliferacj czy ró nicowanie [100

w niniejszej pracy przeprowadzono badania w kokulturach, b d ce znacznie bardziej zaawansowanym sposobem bada cytozgodno ci nowych biomateriaøów.

Przedstawione wyniki proliferacji pokazuj , e na obydwu membranach liczba fibroblastów jest ni sza ni na próbie kontrolnej TCPS (Rys. 51). Odwrotn sytuacj obserwujemy w przypadku hMSC, gdzie liczba komórek na próbie kontrolnej TCPS jest znacz co ni sza ni na membranach (Rys. 52). Porównuj c otrzymane wyniki

proliferacji komórek hodowanych w separowanych warunkach (Rys. 45 A, B), mo na zauwa y , e proliferacja fibroblastów po 14 dniach hodowli na membranach jest ni sza I CZ DO WAIDCZALNA

WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

powierzchni membrany (A) i hMSC i w próbie kontrolnej – na dnie pøytki krotnym powi kszeniu po

kulturach komórkowych byøo sprawdzenie czy komórki – z którymi materiaø b dzie miaø kontakt w organizmie ludzkim po wszczepieniu, b d reagowaøy na wøa ciwo ci mikrostrukturalne membran. Wiadome jest, e w warunkach panuj cych w organizmie komórki ró nych typów kontaktuj i komunikuj 100, 101, 102]. Dlatego w niniejszej pracy przeprowadzono badania w kokulturach, b d ce znacznie bardziej zaawansowanym sposobem bada cytozgodno ci nowych biomateriaøów.

proliferacji pokazuj , e na obydwu membranach liczba fibroblastów jest ni sza ni na próbie kontrolnej TCPS (Rys. 51). Odwrotn sytuacj obserwujemy w przypadku hMSC, gdzie liczba komórek na próbie kontrolnej TCPS jest równuj c otrzymane wyniki z wynikami proliferacji komórek hodowanych w separowanych warunkach (Rys. 45 A, B), mo na zauwa y , e proliferacja fibroblastów po 14 dniach hodowli na membranach jest ni sza

III CZ DO WAIDCZALNA

WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

w kokulturach ni w separowanych warunkach (Rys. 51, Rys. 45 A). Bior c równie pod uwag , e w separowanych warunkach proliferacja fibroblastów byøa porównywalna do próby kontrolnej TCPS, a w przypadku kokultury liczba fibroblastów byøa znacz co ni sza ni na TCPS, mo na stwierdzi , e proliferacja fibroblastów jest obni ona na skutek obecno ci hMSC. Dla hMSC obserwujemy odwrotn zale no . Liczba komórek hodowanych na membranach, w kokulturze jest istotnie wy sza ni na próbie kontrolnej TCPS i w porównaniu do hodowli w separowanych warunkach (Rys. 52, Rys. 45 B). Przedstawione wyniki sugeruj , e hMSC rosn lepiej je li maj kontakt z fibroblastami. Niemniej jednak, pomimo wysokiego poziomu proliferacji hMSC, w kokulturze, zaobserwowano niski stopie ró nicowania i mineralizacji hMSC (Rys. 53 A, B). W separowanych warunkach liczba komórek byøa ni sza ni na próbie kontrolnej, a mimo to zarówno poziom ALP jak i mineralizacji byøy wy sze dla komórek hodowanych na membranach, w porównaniu do próby kontrolnej (Rys. 46 A, B). Z tej zale no ci wynika wniosek, e obecno fibroblastów korzystnie wpøywa na proliferacj hMSC, ale powoduje równie osøabienie ich ró nicowania i mineralizacji. Obserwacje morfologii nie uwidoczniøy istotnych zmian w budowie komórek hodowanych w kokulturze (Rys. 54).

Wyniki bada w kokulturach, w modelu symuluj cym warunki panuj ce w organizmie ywym dowodz , e mo liwa jest hodowla in vitro w ukøadzie polegaj cym na jednoczesnej hodowli fibroblastów oraz hMSC na obu stronach membrany. Jednak e, wzgl du na problem z osadzeniem komórek na dolnej cz ci membrany zastosowany model powinien zosta udoskonalony, tak aby mo liwe byøo uzyskanie powtarzalnych warunków hodowli, a dzi ki temu wiarygodnych wyników bada .

Podsumowuj c, przeprowadzone badania membran w kokulturach komórkowych pokazaøy, e badane membrany s cytozgodne w warunkach jednoczesnego kontaktu z oboma typami komórek. Co wa niejsze, zauwa ono e w warunkach kokultur komórkowych fibroblasty maj ce kontakt z membran proliferuj wolniej ni hMSC. Taki wynik sugeruje, e opracowane membrany b d speønia swoj funkcj jako bariera przeciwdziaøaj ca wnikaniu mi kkiej tkanki ø cznej (wytwarzanej przez fibroblasty) do miejsca ubytku kostnego. Zapewni zatem korzystne warunki do odtworzenia si tkanki kostnej.

III CZ DO WAIDCZALNA

PODSUMOWANIE I WNIOSKI

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________