Index of /rozprawy2/10572

Pełen tekst

(1)Akademia Górniczo-Hutnicza im. Stanisøawa Staszica Wydziaø In ynierii Materiaøowej i Ceramiki Katedra Biomateriaøów. Rozprawa doktorska RESORBOWALNE MEMBRANY DO STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK. mgr in . Maøgorzata Krok. Promotor: dr hab. in . El bieta Pamuøa, Prof. AGH. - Kraków 2012 1.

(2) I CZ. LITERATUROWA .....................................................................................7. 1. WPROWADZENIE ...........................................................................................................7 2. CHOROBY PRZYZ BIA ................................................................................................8 3. SPOSOBY LECZENIA CHORÓB PRZYZ BIA........................................................10 3.1. Niechirurgiczne sposoby leczenia ............................................................................ 10 3.2. Chirurgiczne metody leczenia ................................................................................. 11 3.2.1. Metody leczenia tkanek przyz bia opieraj ce si na reperacji ......................... 11 3.2.2. Metody leczenia tkanek przyz bia opieraj ce si na regeneracji ..................... 13 4. MEMBRANY WYKORZYSTYWANE DO LECZENIA CHORÓB PRZYZ BIA METOD STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK (GTR) .......15 4.1. Wymagania stawiane materiaøom membranowym do sterowanej regeneracji tkanek .................................................................................................... 15 4.2. Rodzaje membran stosowanych w technice GTR ................................................. 17 4.2.1. Membrany nieresorbowane ............................................................................... 17 4.2.2. Membrany resorbowalne .................................................................................. 19 4.2.2.1. Materiaøy membranowe pochodzenia naturalnego ...................................... 20 4.2.2.2. Materiaøy membranowe pochodzenia syntetycznego .................................. 22 4.2.3. Membrany gradientowe .................................................................................... 28. II TEZA I CEL PRACY ...................................................................... 31 III CZ. DO WIADCZALNA ....................................................... 33. 1. MATERIAèY I METODY .............................................................................................33 1.1. Charakterystyka materiaøu matrycowego poli(L-laktydu-co-glikolidu) (PLGA) ...................................................................................................................... 33 1.2. Charakterystyka porogenu poli(glikolidu etylenowego) (PEG) ........................... 33 1.3. Otrzymywanie membran ......................................................................................... 34 1.4. Charakterystyka membran ..................................................................................... 35 2.

(3) 1.4.1. Grubo. i udziaø obj to ciowy porów ............................................................... 35. 1.4.2. Mikrostruktura .................................................................................................. 35 1.4.3. Topografia powierzchni .................................................................................... 36 1.4.4. Zwil alno. powierzchni ................................................................................... 36. 1.4.5. Wøa ciwo ci chemiczne powierzchni................................................................. 36 1.4.6. Wytrzymaøo 1.5. Szybko. mechaniczna .............................................................................. 37. odparowania rozpuszczalnika ................................................................ 37. 1.6. Badania degradacji ................................................................................................... 38 1.7. Wøa ciwo ci biologiczne ........................................................................................... 38 1.7.1. Badania na komórkach osteoblastopodobnych MG-63 .................................... 39 1.7.1.1.. ywotno. komórek .................................................................................... 40. 1.7.1.2. Poziom tlenku azotu .................................................................................... 40 1.7.1.3. Morfologia komórek .................................................................................... 41 1.7.2. Badania z wykorzystaniem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ludzkich fibroblastów ............................................................ 41 1.7.2.1. Ocena proliferacji, ró nicowania i mineralizacji komórek ......................... 42 1.7.2.2. Morfologia komórek .................................................................................... 43 1.7.3. Badania w kokulturach komórkowych .............................................................. 43 1.7.3.1. Ocena proliferacji, ró nicowania i mineralizacji komórek ......................... 44 1.7.3.2. Morfologia ................................................................................................... 44 1.7.3.3. Hodowla komórek po obu stronach membrany........................................... 45 2. WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW ............................................................................46 2.1. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zale no ci od st enia PEG ............................................................................................................. 46 2.1.1. Morfologia membran ........................................................................................ 46 2.1.2. Mikrostruktura .................................................................................................. 47 2.1.3. Wøa ciwo ci mechaniczne ................................................................................. 49 3.

(4) 2.1.4. Dyskusja wyników ............................................................................................ 51 2.2. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zale no ci od masy cz steczkowej PEG ......................................................................................... 54 2.2.1. Mikrostruktura .................................................................................................. 54 2.2.2. Grubo. membran i procent wypøukania PEG ................................................. 57. 2.2.3. Wpøyw odparowania rozpuszczalnika na mikrostruktur membran ................. 57 2.2.4. Badania FTIR-ATR ........................................................................................... 59 2.2.5. Dyskusja wyników ............................................................................................ 61 2.3. Badania degradacji membran ................................................................................. 64 2.3.1. Ocena makroskopowa ....................................................................................... 64 2.3.2. Zmiany masy...................................................................................................... 65 2.3.3. Zmiany pH ......................................................................................................... 66 2.3.4. K t zwil ania ..................................................................................................... 67 2.3.5. Wytrzymaøo. .................................................................................................... 69. 2.3.6. Mikrostruktura i topografia powierzchni .......................................................... 72 2.3.6.1. SEM ............................................................................................................. 72 2.3.6.2. AFM ............................................................................................................ 76 2.3.7. Dyskusja wyników ............................................................................................ 78 2.4. Charakterystyka biologiczna membran ................................................................. 80 2.4.1. Badania membran PLGA w kontakcie z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63 ............................................................................................................... 80 2.4.1.1.. ywotno ci komórek ................................................................................... 80. 2.4.1.2. Poziom tlenku azotu .................................................................................... 81 2.4.1.3. Morfologia komórek .................................................................................... 82 2.4.1.4. Dyskusja wyników ..................................................................................... 84 2.4.2. Badania membran w kontakcie z ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi................................................... 85 2.4.2.1. Proliferacja komórek ................................................................................... 85 4.

(5) 2.4.2.2. Ró nicowanie i mineralizacja komórek ...................................................... 86 2.4.2.3. Morfologia komórek .................................................................................... 88 2.4.2.4. Dyskusja wyników ..................................................................................... 92 2.4.3. Badania w kokulturach komórkowych: ludzkie fibroblasty i ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste ............................................................... 93 2.4.3.1. Proliferacja komórek ................................................................................... 93 2.4.3.2. Ró nicowanie i mineralizacja komórek ...................................................... 95 2.4.3.3. Morfologia komórek .................................................................................... 97 2.4.3.4. Model symuluj cy warunki panuj ce w organizmie ywym ...................... 98 2.4.3.5. Dyskusja wyników ..................................................................................... 99 3. PODSUMOWANIE I WNIOSKI .................................................................................101. IV STRESZCZENIE ......................................................................... 107 V SUMMARY ................................................................................... 108 Spis Tabel:........................................................................................................ 109 Spis Rysunków: ............................................................................................... 110 Literatura:........................................................................................................ 115. 5.

(6) W tym miejscu chciaøam zøo y serdeczne podzi kowania:. Prof. dr hab. in . El biecie Pamule, za nieocenion pomoc, wiele cennych rad oraz wiedz przekazan w czasie studiów doktoranckich. Rodzicom, za to, e zawsze mnie wspieraj . „Przyja poznaj po tym, e nic nie mo e jej zawie , a prawdziw miøo po tym, e nic nie mo e jej zniszczy .” - Pauli i Klaudiuszowi. 6.

(7) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________. I CZ. LITERATUROWA. 1. WPROWADZENIE Zarówno w Polsce jaki i na wiecie ro nie zapotrzebowanie na wszelkiego rodzaju implanty do leczenia ubytków tkanki kostnej, równie. w dziedzinie. periodontologii i chirurgii stomatologicznej. Dzieje si tak dlatego, e wydøu a si rednia døugo. ycia ludzi, ale równie. przyczyniaj. si. do tego zaniedbania. higieniczne w obr bie jamy ustnej. W konsekwencji prowadzi to do coraz cz stszego wyst powania ró nego rodzaju chorób przyz bia. Obecnie choroby te zostaøy zaliczone do grupy chorób spoøecznych; szacuje si , e co trzecia dorosøa osoba w Polsce cierpi na choroby przyz bia, w tym równie na paradontoz [1]. W zale no ci od stopnia zaawansowania parodontozy stosuje si ró ne techniki leczenia, mniej lub bardziej inwazyjne. Jednak e w przypadku znacznego post pu choroby, najwi ksz szans na powodzenie charakteryzuj si techniki implantacyjne nazywane sterowan regeneracj tkanek (GTR, ang. guided tissue regeneration) [2]. Technika. GTR. opiera. si. na. zastosowaniu. materiaøu. w. postaci. póøprzepuszczalnej membrany. Jak wiadomo z doniesie literaturowych komórki tkanki nabøonkowej i tkanki mi kkiej proliferuj. szybciej ni. komórki tkanki kostnej,. w wyniku czego miejsce ubytku w tkance kostnej zajmuje tkanka mi kka, która nie daje dostatecznego wsparcia dla z bów lub w przypadku bardziej zaawansowanego procesu chorobowego uniemo liwia zastosowanie implantów z bów [3, 4, 5]. Zadaniem membrany u ywanej w GTR, jest stworzenie wøa ciwych warunków poprzez odizolowanie tkanek dzi søa i zapewnienie odpowiedniego czasu niezb dnego do odbudowy tkanki kostnej w po danym miejscu. Takie podej cie wymaga zastosowania materiaøu o zdefiniowanej strukturze i wøa ciwo ciach. Membrana powinna charakteryzowa si asymetryczn budow : jedna strona przeznaczona do kontaktu z tkank mi kk powinna sprzyja adhezji fibroblastów i komórek nabøonkowych, za druga strona powinna stymulowa adhezj i wnikanie osteoblastów do miejsca ubytku, co w konsekwencji pozwoli na odbudow nowej, zdrowej tkanki kostnej [5, 6]. Ponadto membrana powinna równie. umo liwia. wymian. pøynów, gazów i skøadników. od ywczych. Jak ka dy biomateriaø membrana powinna tak e by nietoksyczna, nie 7.

(8) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ wykazywa wøa ciwo ci alergizuj cych, by odporna na zasiedlanie drobnoustrojami oraz powinna ulega biodegradacji i bioresorpcji po speønieniu swojej funkcji, co wykluczaøoby powtórn operacj . Obecnie na rynku dost pnych jest kilka ró nych typów membran dla GTR. Jednak e materiaøy te maj w. kontrolowaniu. ich. liczne wady, do których mo na zaliczy. budowy. mikrostrukturalnej,. trudno ci. niebiodegradowalno. czy. odzwierz ce pochodzenie, co stwarza zagro enia przeniesienia na pacjenta chorób i patogenów. W cz ci literaturowej niniejszej pracy omówiono zagadnienia dotycz ce genezy chorób przyz bia, sposobów ich leczenia jak i materiaøów wykorzystywanych w technice GTR.. 2. CHOROBY PRZYZ BIA Choroby przyz bia stanowi bardzo powa ny problem spoøeczny. Pocz tkowe ich objawy, tj. krwawienie dzi seø czy nieprzyjemny zapach z ust s lekcewa one. Konsekwencj. tego jest rozwijaj cy si. cz sto. stan zapalny. W zale no ci. intensywno ci stanu zapalnego choroby przyz bia mo na podzieli. na dwie. podstawowe grupy:.  choroby dzi seø  zapalenia przyz bia. Zarówno choroby dzi seø jak i zapalenia przyz bia s warunkowane przez du patogenów chorobotwórczych, co jest gøówn. przyczyn. liczb. cz stego wyst powania. problemów w obr bie jamy ustnej. Czynniki wywoøuj ce choroby przyz bia mo na podzieli na te, które s niezale ne od czøowieka takie, jak choroby dzi seø i przyz bia pochodzenia alergicznego czy urazowego lub b d ce wynikiem zmian hormonalnych czy obci e genetycznych. Cz ciej jednak obserwuje si zmiany w obr bie przyz bia, które spowodowane s czynnikami zale nymi od dziaøalno ci czøowieka, a konkretnie wynikaj one z maøego stopnia wiadomo ci, jak wa na jest prawidøowa higiena jamy 8.

(9) I CZ LITERATUROWA ________________________________ ________________________________________________________________ ______________________________________ ustnej. nej. Zaniedbania w tej dziedzinie powoduj powstanie pøytki bakteryjnej i kamienia naz bnego, w którym gromadz si resztki pokarmu, co z kolei sprzyja rozwojowi bakterii, które s gøówn przyczyn powstawania stanów zapalnych w obr bie jamy ustnej [7, 8]. Niezale nie od przyczyny wyst powania chorób przyz bia pprzebieg rzebieg ka dej choroby jest do. podobny. W pierwszym etapie pojawia si zapalenie dzi seø, wywoøane przez. bakterie znajduj duj ce si w pøytce naz bnej. Pøytka bakteryjna i tworz cy si kamie naz bny zajmuj coraz wi kszy obszar, wbudowuj c si w z b oraz gromadz c poni ej linii dzi seø w kieszonkach dzi søowych. Døugotrwaøe nieleczone zapalenie dzi seø mo e doprowadzi do tego, e bakterie zaatakuj oz bn (tkank znajduj znajdu ca si mi dzy ko ci dzi søa a z bem), w wyniku cz czego stan zapalny pogø bia si obejmuj c nie tylko dzi søa, ale równie. gø biej poøo one obszary.. W kolejnym stadium dochodzi do. zniszczenia tkanek przyz bia, a bakterie wzdøu korzenia z bowego, przedostaj si a do gø boko umiejscowionej tkanki kostnej dzi søa. Zainfekowana ko. ulega rozpadowi, rozpadowi. co wywoøuje zniszczenie nie wi zadøa z bo bodoøowo-zz bowego i powoduje efekt „cofania si ” ko ci dzi søa (Rys. 1 B B, 2 B) [9]. W wyniku tego procesu zmniejsza si pole kontaktu dzi søo-z b co prowadzi najpierw do rozchwiania, a w pó niejszym etapie do wypadania z bów.. Rys. 1 Schemat przedstawiaj cy obszar zdrowy z bb-dzi dzi søo (A.) i obszar obj ty chorob z widocznym cofni ciem ko ci dzi søa (B.). 9.

(10) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ Bardzo powa nym problem w przebiegu chorób przyz bia jest fakt, e choroba ta mo e przebiega bezobjawowo, nawet przez kilka lat, a do momentu kiedy utrata z ba b dzie praktycznie nieunikniona. Dlatego bardzo wa nym zagadnieniem jest profilaktyka, ale równie opracowywanie nowych metod leczenia chorób przyz bia, które zapobiegn utracie z bów.. 3. SPOSOBY LECZENIA CHORÓB PRZYZ BIA Leczenie chorób przyz bia zale y od stopnia zaawansowania choroby, jak równie od tego czy mamy do czynienia z zapaleniem dzi seø, czy wyst piøo tak e zapalenie przyz bia. Ró nica mi dzy tymi dwiema jednostkami chorobowymi wynika z gø boko ci osadzenia pøytki bakteryjnej. W przypadku zapalenia dzi seø pøytka bakteryjna znajduje si nad dzi søem, natomiast je li wyst puje równie zapalenie przyz bia, pøytka bakteryjna si ga gø biej, poni ej linii dzi seø osadzaj c si w patologicznej kieszonce dzi søowej. Doboru metody leczenia dokonuje lekarz na podstawie stopnia zaawansowania choroby oraz wywiadu ogólnego. 3.1. Niechirurgiczne sposoby leczenia W przypadku niewielkiego stopnia zaawansowania choroby zadowalaj ce efekty daj mniej inwazyjne metody leczenia. Podstawowym zabiegiem, maj cym dziaøanie lecznicze, ale równie profilaktyczne jest usuwanie zøogów pøytki naz bnej (skaling nad- i poddzi søowy) jak równie polerowanie szyjek i korzeni z bów. W niektórych przypadkach skuteczna jest te farmakoterapia, w której stosuje si np. antybiotyki o dziaøaniu ogólnym lub miejscowym, sole metali ci kich, witaminy,. rodki. dezynfekuj ce, ci gaj ce lub/i przeciwzapalne [10].. 10.

(11) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ 3.2. Chirurgiczne metody leczenia Leczenie chirurgiczne stosuje si. w przypadku bardziej zaawansowanych. postaci chorób przyz bia, a ich celem jest:.  regeneracja ubytków tkanki kostnej  przywrócenie fizjologicznych konturów dzi søa  odsøoni cie miejsc niedost pnych dla oczyszczenia uz bienia. Pierwsz grup metod chirurgicznych s zabiegi polegaj ce na poszerzeniu dzi søa (metody plastyczne), do drugiej grupy zalicza si metody, których efektem jest redukcja lub eliminacja kieszonek przyz bnych (metody resekcyjne). Jednak najbardziej interesuj ce, z punktu widzenia skuteczno ci oraz in ynierii biomateriaøów, wydaj si by metody regeneracyjne.. 3.2.1. Metody leczenia tkanek przyz bia opieraj ce si na reperacji W przypadku rozlegøych uszkodze. tkanek procesy naprawcze przebiegaj poprzez. wytworzenie tkanki ø cznej wypeøniaj cej ubytek, tzw. blizny ø cznotkankowej. Proces ten okre lany jest mianem reperacji, bo umo liwia zachowanie integralno ci uszkodzonych tkanek, ale nie prowadzi on jednak do przywrócenia ich peønej funkcjonalno ci i struktury. Czynnikami sprzyjaj cymi bliznowaceniu s intensywny stan zapalny, du a wielko. ubytku oraz czynniki osobnicze (np. wiek pacjenta).. W wyniku bliznowacenia powstaje tkanka niemal e bezkomórkowa, uboga w naczynia krwiono ne zawieraj ca du o kolagenu. Powstanie tkanki bliznowatej jest zwykle procesem nieodwracalnym i niekorzystnym, gdy. w jego wyniku nie zostaj. odtworzone naturalne struktury tkankowe. W przypadku chirurgicznych metod leczenia chorób przyz bia zarówno metody plastyczne jak i resekcyjne przyczyniaj si jedynie do reperacji tkanek przyz bia, tj. dochodzi do ust pienia objawów klinicznych choroby (zapalenia), a w miejscu ubytku powstaje tkanka ø czna, wytworzona przez fibroblasty dzi søa. W wyniku tego tworzy 11.

(12) I CZ LITERATUROWA ________________________________ ________________________________________________________________ ______________________________________ si tzw. døugi przyczep nabøonkowy, b d cy efektem szybkiego narastania nabøonka dzi søa, który mo e si ga. a. do dna ubytku kostnego. Reparacj. mo na wi c. zdefiniowa jako proces gojenia si rany, w wyni wyniku ku którego powstaj tkanki, których budowa i funkcje nie s identyczne z tkank zniszczon (Rys. 2 A – C). Wynika z tego, e reparacja nie zapewnia peønego odtworzenia struktury, ani funkcji utraconych tkanek przyz bia.. dzi søo (A.), obszaru obj tego chorob Rys. 2 Schemat prawidøowego obszaru z bb-dzi z widoczna kieszonk dzi søow i zanikiem ko ci wyrostka z bodoøowego i wi zadøa z bodoøowo-zz bowego (B.) oraz obszaru po leczeni leczeniu metod. reparacji (C.). i regeneracji (D.) [12]. 12.

(13) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ 3.2.2. Metody leczenia tkanek przyz bia opieraj ce si na regeneracji Odzyskanie peønej funkcji i struktury tkanek przyz bia zapewnia metoda sterowanej regeneracji tkanek – GTR (Rys. 2 D). Metoda ta opiera si. na zastosowaniu. odpowiedniego materiaøu, w postaci membrany (bøony) regeneracyjnej (Rys. 3 A). Membran wszczepia si pod pøat dzi søowy, tak aby jeden jej koniec opieraø si o brzeg zachowanego fragmentu wyrostka z bodoøowego, a z drugiej strony przymocowuje do szyjki z ba. Dzi ki temu membrana oddziela tkanki dzi søa od powierzchni korzenia z bowego na okres od kilku tygodni do kilku miesi cy. W tym czasie mo liwe jest zaj cie procesu regeneracji, poniewa. wszczepiony materiaø. uniemo liwia komórkom nabøonka i fibroblastom dzi søa wnikanie do ubytku kostnego i wytworzenie blizny ø cznotkankowej. W wyniku tego, dochodzi do aktywacji komórek oz bnej, które zaczynaj. odtwarza. nowy cement korzeniowy wraz. z wøóknami kolagenowymi oraz dochodzi do aktywacji komórek osteogennych odtwarzaj cych ko. (Rys. 3 B). Dzi ki metodzie GTR mo liwe jest odtworzenie. struktur, które maj znacznie wi ksz odporno. na uszkodzenia ni tkanki powstaj ce. w trakcie procesu reperacji [11, 12]. GTR jest wi c technik , która umo liwia odtwarzanie funkcji i struktury uszkodzonych tkanek poprzez wykorzystanie naturalnych mo liwo ci tkanek do ich regeneracji i przeciwdziaøanie powstawaniu tkanki bliznowatej. Jednakowo. proces regeneracji jest bardzo zøo ony i aby byø. mo liwy, czyli aby doszøo do peønej regeneracji tkanki kostnej, oprócz wy ej wymienionej membrany, speøniaj cej funkcje no nika/aktywatora komórek, musz zosta speønione jeszcze dwa warunki. Pierwszym jest obecno –. macierzystych,. cz ciowo. zró nicowanych. komórek osteogennych. (preosteoblasty). i. komórek. zró nicowanych (osteoblasty), czyli komórek które b d w stanie odtworzy utracone struktury kostne. Drugim warunkiem koniecznym do zaj cia procesu regeneracji s cz stki sygnaøowe procesu gojenia, tj. czynniki wzrostu, cytokiny, hormony, witaminy czy biaøka morfogenetyczne ko ci (BMP, bone morphogenetic proteins). Razem te trzy czynniki: materiaø b d cy aktywatorem, komórki ko ciotwórcze i cz stki sygnaøowe procesu gojenia, stanowi tzw. triad Lyncha, która jest konieczna, aby zaszedø proces regeneracji [13, 14, 15].. 13.

(14) I CZ LITERATUROWA ________________________________ ________________________________________________________________ ______________________________________. Rys. 3 Schemat chemat umieszczenia membrany GTR pod powierzchni dzi søa (A.), proces aktywacji osteoblastów (B.) [12].. Rys. 4 Schemat przedstawiaj cy triad Lyncha [13]].. Reasumuj c choroby przyz bia stano stanowi. rozlegøy problem spoøeczny.. W leczeniu tych chorób ogromn rol odgrywa profilaktyka, jednak e z uwagi na to, e choroba w stadium pocz tkowym cz sto jest lekcewa ona lub przebiega bezobjawowo bezobj dochodzi do znacznego jego post pu.. W takim wypadku niezb dne jest wø czenie 14.

(15) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ w proces leczenia zabiegów chirurgicznych. Przeprowadzone badania dowodz , e najlepsze rezultaty osi gane s przy zastosowaniu metod sterowanej regeneracji tkanek GTR. W metodzie tej wykorzystywane s biomateriaøy w postaci membran o ci le zdefiniowanej budowie i wøa ciwo ciach. W dalszej cz ci rozprawy przedstawiono zaøo enia, metody otrzymywania, charakterystyk. wøa ciwo ci oraz wady i zalety obecnie u ywanych membran. stosowanych w technice GTR.. 4. MEMBRANY. WYKORZYSTYWANE. DO. LECZENIA. CHORÓB. PRZYZ BIA METOD STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK (GTR) Membrany s szeroko stosowane – nie tylko w sterowanej regeneracji tkanek, ale w caøej medycynie. S. wykorzystywane m.in. w sztucznych narz dach,. bioseparatorach, in ynierii tkankowej, w systemach dostarczania leków czy urz dzeniach diagnostycznych [16]. Z uwagi na tematyk niniejszej pracy poruszane w tym rozdziale zagadnienia b d dotyczy membran stosowanych w technice GTR. 4.1. Wymagania stawiane materiaøom membranowym do sterowanej regeneracji tkanek Membrany stosowane w technice GTR, w pierwszej kolejno ci powinny speønia. wymagania stawiane wszystkim biomateriaøom. Powinny by. biozgodne,. umo liwiaj c integracj materiaøu z tkankami gospodarza, nie powinny wywoøywa stanu zapalnego o du ym nasileniu, a tak e powinien je cechowa brak wøa ciwo ci alergizuj cych, kancerogennych i mutagennych [16, 17]. Oprócz tego membranom do GTR stawia si dodatkowe wymagania, które wynikaj ci le z funkcji jak tak membrana ma peøni . Jak ju wspomniano membrana do GTR ma søu y jako bariera pomi dzy tkank mi kk a tkank kostn . Z tego stwierdzenia mo na wnioskowa ,. e materiaø taki powinien charakteryzowa. si. odpowiednimi. wøa ciwo ciami mechanicznymi i sztywno ci [17, 18]. Membrana nie powinna ulega zapadaniu do wn trza ubytku, poniewa w przeciwnym razie nie zapewni odpowiednich warunków potrzebnych do regeneracji tkanki kostnej. Powierzchnia membrany powinna 15.

(16) I CZ LITERATUROWA ________________________________ ________________________________________________________________ ______________________________________ równie umo liwia aktywacj i proli proliferacj feracj komórek ko ciotwórczych z jednej strony, a z drugiej strony zapobiega obiega wnikaniu do ubytku komórek tkanki mi kkiej kkiej. St d budowa membrany powinna by asymetryczna – gøadsza ze strony przeznaczonej do kontaktu z tkank mi kk i bardziej porowata od strony tkanki kostnej (Rys. 5).. Rys. 5 Schemat przedstawiaj cy asymetryczn budow membrany przeznaczonej do sterowanej regeneracji tkanek. Mikrofotografie SEM pochodz z bada wøasnych.. Kolejn wa n cech membrany jest podatno. na degradacj i resorpcj materiaøu,. z którego jest wytworzona. Nie jest to warunek konieczny, ale po dany. Wynika to z faktu, e w przypadku materiaøu nie niedegradowalnego membrana po speønieniu swojej funkcjii musi zosta. usuni ta z organizmu. Wi e si. to z konieczno ci. przeprowadzenia kolejnego zabiegu, a wi c z dodatkowymi obci eniami dla pacjenta oraz podniesieniem kosztów leczenia [6, 19]. W przypadku materiaøu ulegaj cego biodegradacji czas jego dziaøania po powinien winien wynosi. co najmniej 4 – 6 tygodni,. poniewa jest to czas, który z powodzeniem umo liwia regeneracj periodontologiczn. 16.

(17) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ [17, 20, 21]. Natomiast produkty degradacji nie mog by toksyczne, a ich usuni cie z organizmu powinno by mo liwe na drodze metabolicznej [22]. Poza tym, uwzgl dniaj c cechy technologiczne, aby mo liwe byøo wprowadzenie do masowej produkcji nowego biomateriaøu, membrana powinna speønia wymagania takie jak: øatwa i szybka produkcja oraz mo liwo. dostosowana ksztaøtu i wielko ci wyrobu. do zapotrzebowania. Co wi cej mo liwe musi by przeprowadzenia procesu sterylizacji materiaøu, który nie zmieni jego wøa ciwo ci, a produkt ko cowy powinien by por czny chirurgicznie i dawa mo liwo. øatwego zastosowania oraz dopasowania do. potrzeb indywidualnego pacjenta [23]. 4.2. Rodzaje membran stosowanych w technice GTR Membrany stosowane w GTR mo na podzieli na dwie podstawowe grupy. Podziaø ten oparty zostaø na zdolno ci materiaøu do degradacji, st d mo emy wyró ni :  membrany nieresorbowalne  membrany resorbowalne Jako osobn grup materiaøów wyró nia si równie :  membrany gradientowe (FGM, ang. functional gradient materials). 4.2.1. Membrany nieresorbowane Pierwsz. handlow. przyz bia metod. membran , która zostaøa wykorzystana do leczenia chorób sterowanej regeneracji tkanek byøa nieresorbowalana membrana. z ekspandowanego politetrafluoroetylenu (e-PTFE, Gore-Tex Membrane®, W.L. Gore & Assos., Flagstaff, AZ., USA) [5]. Pierwszy raz zostaøa ona u yta w 1984 roku, a jej budowa odzwierciedla zaøo enia stawiane membranom do GTR, gdy posiada ona asymetryczn , porowat. mikrostruktur. [24]. Membrana e-PTFE zbudowana jest. z litych w zøów polimerowych poø czonych ze sob wøóknami (Rys. 6), a wøókna uøo one s tak, e z jednej strony tworz struktur o porowato ci 90% i grubo ci okoøo 1 mm, a z drugiej porowato. wynosi 30%, a grubo. okoøo 0,15 mm [17].. 17.

(18) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________. Rys. 6 Mikrostruktura e-PTFE [25].. Membrany e-PTFE s otrzymywane poprzez kontrolowane rozci ganie foli teflonowej oraz wprasowanie jej w matryc. polimerow. posiadaj c. okre lon. struktur. (np. Dacron® lub Nylon®), dzi ki czemu w PTFE dochodzi do samorzutnego tworzenia si porów. Obecnie na rynku dost pne s. równie. inne membrany na bazie PTFE np.. politetrafluoroetylen o wysokiej g sto ci (d-PTFE, Cytoplast® TXT-200) (Rys. 7) [17]. Membrany te zostaøy wprowadzone do u ycia w 1993 roku. Posiadaj inn budow ni e-PTFE – posiadaj pory o wielko ci 0,2 m [17]. Badania pokazaøy, e membrany z d-PTFE s w mniejszym stopniu zasiedlane przez drobnoustroje i øatwiejsze do usuni cia po procesie leczenia, ni membrany e-PTFE [17, 26]. Stosowane s równie membrany kompozytowe z d-PTFE poø czone z siatk tytanow (Cytoplast® Ti-250). Modyfikacja ta polega na umieszczeniu siatki tytanowej mi dzy dwiema warstwami d-PTFE. Takie rozwi zanie poprawia wytrzymaøo. membran i ma. na celu zapobieganie ewentualnemu zapadaniu si membrany do wn trza ubytku tkanki kostnej, poniewa. ograniczenie obszaru pod membran. wpøywa niekorzystnie na. warunki regeneracji [17, 24]. Oprócz siatki wzmacniaj cej sam tytan w postaci folii jest równie. stosowany jako materiaø membranowy. Tytan jest wykorzystywany jako. membrana ze wzgl du na to, e posiada wysok odporno. na zaka enia bakteryjne. i w przypadku odsøoni cia implantu w trakcie leczenia, nie wywoøuje i nie podtrzymuje infekcji [27].. 18.

(19) I CZ LITERATUROWA ________________________________ ________________________________________________________________ ______________________________________. Rys. 7 Biostabilne membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej g sto ci (d-PTFE, PTFE, Cytoplast®TXT Cytoplast®TXT-200) i. z. d-PTFE. wzmocnionego ego. siatk. tytanow. (Cytoplast®Ti-250) przeznaczone do GTR [28]. Zalet nieresorbowalnych materiaøów jest to, e s one uwa ane za chemicznie oboj tne i za biozgodne w kontakcie z ywym organizmem. Posiadaj one dobre wøa ciwo ci barierowe, zapewniaj c odpowiedni czas dla regeneracji tkanek przyz bia. Wad tych materiaøów jest to,. e je li w czasie procesu regeneracji dojdzie do odsøoni cia. membrany zostaje ona zasiedlona przez bakterie. Jednakowo , ggøówn. wad. nieresorbowanych membran membran, jak ju wspomniano wcze niej, jest fakt, e po speønieniu swojej funkcji membrana musi zosta usuni ta z leczonego miejsca. miejsca Wi e si do z konieczno no ci przeprowadzenie kolejnego zabiegu, w trakcie którego dochodzi do ponownego otworzenia ju wygojonej rany. Stanowi to dodatkowe obci enie dla pacjenta, przedøu a czas leczenia i podnosi jego koszty [6, 19, 29, 30,, 31, 32]. 4.2.2. Membrany resorbowalne Drug. grup. materiaøów u ywanych w GTR, s. materiaøy ulegaj ce degradacji. enzymatycznej lub hydrolitycznej hydrolitycznej. Degradacji enzymatycznej ulegaj. materiaøy. pochodzenia naturalnego, natomiast degradacja hydrolityczna zachodzi w polimerach pochodzenia syntetycznego. W obu przypadkach zjawiskiem towarzysz cym w czasie rozkøadu materiaøu jest powstanie produktów ubocznych. Produkt Produkty te mog. by 19.

(20) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ wydzielane poza organizm lub by w nim zatrzymywane. Wa ne jest aby produkty degradacji nie wywieraøy negatywnego wpøywu na organizm. ywy [33]. Dzi ki. mo liwo ci degradacji po speønieniu swojej funkcji membrana zanika. Poprzez zastosowanie membrany z materiaøu resorbowalnego lub degradowanego mo na wyeliminowa gøówn wad materiaøów stabilnych, tj. potrzeb powtórnej operacji w celu usuni cia biomateriaøu. Podziaø materiaøów resorbowalnych na dwie grupy wynika z ich pochodzenia i mechanizmu ich degradacji. 4.2.2.1. Materiaøy membranowe pochodzenia naturalnego Podstawowym materiaøem naturalnym, wykorzystywanym do wytworzenia membrany dla GTR jest kolagen, najcz ciej typu I. Mo e to by kolagen pochodz cy z ludzkiej skóry (Alloderm®, LifeCell, Branchburg, NJ, USA), b d wyekstrahowany z woøowych ci gien Achillesa (Cytoplast® RTM Collagen, City, State, USA) lub wi skiej skóry (Bio-Gide®, Osteohealth, Shirley, NY, USA) [13]. Pochodzenie kolagenu jest ró ne, natomiast. jak. wiadomo. kolagen. jest. podstawowym. skøadnikiem. macierzy. zewn trzkomórkowej, st d wynikaj jego bardzo dobre wøa ciwo ci biologiczne, za membrany kolagenowe charakteryzuj si bardzo dobrym powinowactwem do komórek oraz biozgodno ci [6, 34, 35]. Na Rys. 8 przedstawiono budow membrany BioGide®. Jak wida membrana ta ma asymetryczn budow , z jednej strony przeznaczonej do kontaktu z tkank mi kk membrana jest gøadsza (Rys. 8 C), a z drugiej bardziej chropowata co sprzyja proliferacji komórek kostnych (Rys. 8 D). Wøóknista budowa membran kolagenowych (Rys. 8, 9) przy piesza formowanie skrzepu i stabilizuje ran , oprócz tego stymuluje degranulacj pøytek krwi, w trakcie której uwalniane s np. czynniki wzrostu, co z kolei mo e wpøyn. korzystnie na proces regeneracji [37].. Membrany kolagenowe s otrzymywane kilku etapowo. W pierwszym etapie kolagen zostaje rozpuszczony, nast pnie przygotowany roztwór zostaje zamro ony (-20°), a. ostateczn ,. wøóknist. struktur. otrzymuje. sublimacyjnego (liofilizacji) i prasowania. Inn. si. poprzez. metod. proces. mo e by. suszenia prz dzenie. w rodowisku 99,5% alkoholu etylowego. Otrzymany produkt poddaje si procesowi pøukania i suszenia pod obni onym ci nieniem. Nast pnie kolagen sieciuje si w aldehydzie gluarowym oraz poddaje ponownemu pøukaniu i prasowaniu. [36]. 20.

(21) I CZ LITERATUROWA ________________________________ ________________________________________________________________ ______________________________________. Rys. 8 Budowa membrany rany BioGide® A. powi kszenie 40x B. powi kszenie 100x, C. strona gøadsza, powi kszenie 250x, 0x, D. strona bardziej chropowata, powi kszenie 10000x [37].. Rys. 9 Budowa membrany rany Cytoplast® RTM Collagen [[28].. 21.

(22) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ Pomimo wielu zalet, stosowanie membran kolagenowych poci ga za sob równie pewne ograniczenia. Po pierwsze koszty pozyskania surowca kolagenowego s stosunkowo wysokie, a liczba ródeø ograniczona. Jednak e najwi kszym problemem wydaje si by fakt, e kolagen jako materiaø pochodzenia naturalnego charakteryzuje si zmienno ci wøa ciwo ci oraz budowy, w wyniku czego pojawiaj si trudno ci w kontrolowaniu wøa ciwo ci mechanicznych i jak czasu degradacji wyrobów finalnych [13]. Badania pokazaøy,. e wytrzymaøo. membran kolagenowych znacznie spada. w momencie, kiedy membrana zaczyna si degradowa [6], co mo e sprzyja zapadaniu si membrany do wn trza ubytku i powodowa ograniczenie obszaru regeneracji tkanki kostnej. T wad mo na korygowa stosuj c proces sieciowania struktury kolagenu (cross-linking) za pomoc promieniowania ultrafioletowego czy rodków chemicznych tj. aldechydu glutarowego lub zwi zków pochodzenia naturalnego np. genipiny [13, 38, 39, 40]. Sieciowanie poprawia wytrzymaøo. oraz wydøu a czas resorpcji membrany. kolagenowej, nie zmieniaj c przy tym jej mikrostruktury. Oprócz wy ej wymienionych wad istnieje równie ryzyko,. e pomimo ostrych wymaga dotycz cych przetwarzania. i produkcji membran z materiaøów pochodzenia naturalnego, nast pi przeniesienia chorób i patogenów pochodzenia zwierz cego do organizmu ludzkiego. W niektórych kr gach równie wzgl dy wiatopogl dowe (ze wzgl du na pochodzenie kolagenu) mog powodowa ograniczenia w u yciu membran kolagenowych. Z uwagi na wymienione ograniczenia membran pochodzenia naturalnego oczywist alternatyw wydaj si by degradowalne materiaøy pochodzenia syntetycznego. 4.2.2.2. Materiaøy membranowe pochodzenia syntetycznego Wi kszo. syntetycznych membran stosowanych w GTR wytwarzana jest z polimerów. nale cych do grupy poliestrów alifatycznych takich jak: poliglikolid (PGA), polilaktyd (PLA), poli(-kaprolakton) (PCL) czy ich kopolimery. Poliestry alifatyczne s. obecnie. wykorzystywane w medycynie jako resorbowalne materiaøy implantacyjne w postaci nici chirurgicznych, rub czy pøytek. Znalazøy one równie zastosowanie w farmacji jako no niki leków w systemach kontrolowanego ich uwalniania [19, 22, 33, 41, 42]. Podstawowymi zaletami syntetycznych poliestrów alifatycznych s biodegradacja, brak zagro e pochodzenia. odzwierz cego. jakie niesie za sob oraz. mo liwo. lepszej. biozgodno ,. wykorzystanie materiaøów kontroli. ich. struktury. i wøa ciwo ci mechanicznych. Dzi ki lepszej powtarzalno ci procesu otrzymywania 22.

(23) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ materiaøów mo liwe jest równie kontrolowanie czasu degradacji i ustalenie po jakim czasie nast puje znaczny spadek wytrzymaøo ci, który zagra aøby zapadaniu si materiaøu do wn trza ubytku. Pierwsz , obecnie niedost pn komercyjnie degradowaln membran u ywan w GTR byøa membrana o nazwie handlowej Guidor® [17], która zostaøa wytworzona z PLA i poddana dziaøaniu acetylocytrynianutributylu, w celu nadania jej wi kszej elastyczno ci. Membrana ta skøada si. z dwóch warstw: warstwa zewn trzna,. przeznaczona do kontaktu z dzi søem, charakteryzuje si. du ymi, prostok tnymi. porami, natomiast warstwa wewn trzna, maøymi okr gøymi porami które maj na celu opó nienie penetracji ubytku przez tkank mi kk , przy jednoczesnym umo liwieniu przepøywu substancji od ywczych. Mi dzy tymi dwiema warstwami znajduj. si. równie bariery tworz ce szczeliny, aby umo liwi wzrost tkanki kostnej. Producenci podaj ,. e struktura membrany nie zmienia si. przez pierwsze 6 tygodni, mimo. degradacji, a caøkowita resorpcja materiaøu zachodzi po upøywie roku [43]. Kolejnym przykøadem membrany z PLA jest Epi-Guide®, która posiada trójwarstwow budow i ró ni si porowato ci w zale no ci od strony oraz utrzymuje swoje wøa ciwo ci przez 5 miesi cy, a caøkowitej resorpcji ulega po roku od implantacji [44, 45]. Innym rodzajem membran, ale równie z PLA jest membrana Atrisorb®. Jest to materiaø w postaci. elu skøadaj cy si. pirolidonie. Grubo. z poli(D,L-laktydu) zawieszonego w N-metylo-2-. membrany wynosi 600-750 m, a jej czas degradacji wynosi 6-12. miesi cy [46, 47]. Jednym z kopolimerów, u ywanych do wytwarzania membran do GTR jest kopolimer laktydu z glikolidem (PLGA). Du e zainteresowanie tym materiaøem wynika z faktu, e posiada on bardzo dobre wøa ciwo ci fizyczne, chemiczne i biologiczne. Liczne badania pokazuj , e PLGA jest materiaøem biozgodnym [22, 48, 49]. Co wi cej, PLGA ulega degradacji hydrolitycznej, której produktami s. nietoksyczne zwi zki naturalnie. wyst puj ce w organizmie (kwas mlekowy i glikolowy), które usuwane s z niego w trakcie przemian metabolicznych (cykl Krebsa) [50]. Kolejn zalet PLGA jest to, e dzi ki zmianom udziaøu laktydu i glikolidu mo liwe jest sterowanie wøa ciwo ciami mechanicznymi oraz kinetyk. degradacji [22, 42, 48, 49]. Obecnie na rynku. medycznym dost pne s dwie membrany produkowane z PLGA: Vicryl Periodontal Mesh® oraz Resolut®. Pierwsza zbudowana jest z wøókien poliglaktyny 910 (kopolimer glikolidu z laktydem w stosunku 9:1). Membran Vicryl® cechuje brak odpowiedzi 23.

(24) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ antygenowej oraz to, e utrzymuje swoje wøa ciwo ci mechaniczne przez 3-4 tygodnie po implantacji [51], aczkolwiek badania na zwierz tach pokazaøy søab. integracj. membrany z tkankami [44, 52]. Druga komercyjnie dost pna membrana z PLGA – Resolut®, zbudowana jest z dwóch warstw, bardziej zbitej, która zapobiega wnikaniu komórek nabøonka do wn trza ubytku oraz porowatej sieci wøókien PGA uøatwiaj cych integracj z tkankami. Badania biologiczne tych membran pokazaøy, e ich wøa ciwo ci s. podobne do wøa ciwo ci membran nieresorbowanych, a caøkowita resorpcja. nast puje po upøywie 5 – 6 miesi cy [52, 53]. Innym rodzajem kopolimeru testowanego pod k tem zastosowania w GTR jest kopolimer laktydu i -kaprolaktonu (PLCL). Kopolimer PLCL charakteryzuje si krótszym czasem degradacji, w porównaniu do membran z czystego laktydu, dobr biozgodno ci oraz zapewnia odpowiednie miejsce i wsparcie dla regeneracji tkanki kostnej. Kopolimer PLCL wyst puje pod handlowa nazw Vivosorb® i jest u ywany jako implant to regeneracji nerwów, ale prowadzone badania pokazuj. mo liwo. wykorzystania go równie. w sterowanej regeneracji. tkanek przyz bia [54, 55]. Istnieje wiele metod u ywanych do wytwarzania membran z polimerów syntetycznych. Ze wzgl du na wymagania jakie stawia si o rodków badawczych zajmuje si. membranom do GTR obecnie wiele. testowaniem elektrospiningu jako metody ich. otrzymywania. Metoda ta daje mo liwo. otrzymania wøóknistych membran o du ym. rozwini ciu powierzchni i jest alternatyw dla tradycyjnych metod, w których uzyskuje si materiaø tkany za pomoc procesu prz dzenia z roztworu [13, 56, 57]. Powszechnie u ywanymi metodami do otrzymywania membran polimerowych s odlewanie z roztworu poø czone z wypøukiwanie porogenu lub inwersja faz (separacja faz) [13, 58, 59, 60, 61, 62, 63]. W pierwszej metodzie rozpuszczony polimer miesza si z porogenem, którym najcz ciej jest sól nieorganiczna lub inny polimer. Po zhomogenizowaniu mieszanin odlewa si na pøask powierzchni i pozostawia do odparowania rozpuszczalnika. Ostatnim etapem jest wypøukanie porogenu, dzi ki czemu uzyskuje si porowat struktur . W drugiej metodzie otrzymywania separacja faz zachodzi w ukøadzie polimer-rozpuszczalnik-czynnik str caj cy (np. temperatura) i polega na wytr caniu polimeru z homogenicznego roztworu. Metoda odlewania z roztworu oraz separacja faz daj. mo liwo. uzyskania niewøóknistej, porowatej. mikrostruktury i przez to lepszej jej kontroli, wynikaj cej z mo liwo ci zmiany 24.

(25) I CZ LITERATUROWA ______________________________________________________________________ parametrów fizykochemicznych u ytych substratów tj. rodzaju i masy cz steczkowej porogenu, skøadu roztworu polimeru, rodzaju rozpuszczalnika oraz st enia roztworu. Scharakteryzowane wy ej membrany do sterowanej regeneracji tkanek zarówno syntetyczne jak i te naturalne posiadaj asymetryczn , wøóknist budow . Budowa taka stanowi pewn wad tych materiaøów poniewa , mo e ona utrudnia kontrol nad ich budow mikrostrukturaln (udziaøem procentowym i wielko ci porów) [5, 29, 30, 64]. Dlatego celowe wydaje si prowadzenie bada. nad otrzymaniem membrany, która. b dzie speønia wszystkie najwa niejsze wymagania stawiane membranom dla GTR, ale jej budowa nie b dzie wøóknista.. W. Tabeli. 1. zestawiono. najwa niejsze. cechy. membran. nieresorbowanych. i resorbowalnych, stosowanych w sterowanej regeneracji tkanek. Przedstawiono ich nazw handlow , skøad oraz wymieniono najwa niejsze wøa ciwo ci fizykochemiczne.. 25.

(26) I CZ LITERATUROWA ____________________________________________________________________________________________________________________ Tabela 1 Charakterystyka porównawcza dost pnych na rynku membran do sterowanej regeneracji tkanek – GTR [13, 17]. Membrana – nazwa handlowa. Materiaø. Charakterystyka. membrany syntetyczne nieresorbowalne  døuga praktyka kliniczna Gore-Tex Membrane®. Ekspandowany politetrafluoroetylen (e-PTFE).  dobre wøa ciwo ci barierowe  budowa wøóknista – w zøy poø czone sieci wøókien  stosunkowo sztywny. Cytoplast® TXT-200. Cytoplast®Ti-250. Politetrafluoroetylen w wysokiej g sto ci (d-PTFE) d-PTFE wzmocniony siatk tytanow.  øatwy do usuni cia  wøóknista budowa; pory ~ 0,2 m  odporny na infekcje  wi ksza sztywno. ni Cytoplast® TXT-200. membrany naturalne resorbowalne AlloDerm®. Kolagen typu I z ludzkiej skóry.  czas degradacji ~ 16 tyg [65], wytrzymaøo. 9,4 – 21,5 MPa [66].  dobre wøa ciwo ci barierowe BioGide®. Kolagen typu I i III ze wi skiej skóry.  døuga praktyka kliniczna  wøóknista, asymetryczna budowa  czas degradacji 24 tyg [67], wytrzymaøo. 7,75 MPa 3,5 – 22,5 MPa. BioMend Extend®. Kolagen typu I ze ci gna woøowego.  czas degradacji 18 tyg [69], wytrzymaøo. Cytoplast® RTM. Kolagen typu I ze ci gna woøowego.  czas degradacji 26-38 tyg 26.

(27) I CZ LITERATUROWA ____________________________________________________________________________________________________________________ cd. Tabela 1 Membrana – nazwa handlowa. Materiaø. Charakterystyka. membrany syntetyczne resorbowalne Guidor®. Poli-D,L-laktyd/Poli-L-laktyd + acetylocytryniantributylu. Epi-Guide®. Poli-D,L-laktyd. Atrisorb®. Poli-D,L-laktyd z N-metylo-2-pirolidoem.  wycofana rynku  warstwowa budowa, pory wi ksze na zewn trz, mniejsze w rodku  budowa trójwarstwowa  czas resorpcji 6-12 miesi cy  mo liwo. dostosowania (adaptacji) do miejsca ubytku.  czas degradacji 6-12 miesi cy [68]  membrana tkana. Vicryl®. Poliglaktyna 910.  mi kka. Poliglikolid/poliaktyd (w stosunku 9:1).  mo liwo. dostosowania (adaptacji) do miejsca ubytku.  czas degradacji: pocz tek 4-12 tyg, caøkowity ~ 9 miesi cy [69]  dobra integracja z tkankami. Resolut LT®. Poli-D,L-laktyd-co-glikolid. Vivosorb®. Poli(D,L-laktyd--kaprolakton) (PLCL).  dobre wøa ciwo ci barierowe  czas degradacji: pocz tek 10 tyg, caøkowity 5-6 miesi cy [53], wytrzymaøo 11,7 MPa [29]  wøa ciwo ci mechaniczne utrzymuj ce si do 8 tyg.  wøa ciwo ci antyadhezyjne. 27.

(28) I CZ LITERATUROWA ________________________________ ________________________________________________________________ __________________________________________ 4.2.3. Membrany gradientowe Badania nad opracowaniem pracowaniem coraz to doskonalszych rozwi za. materiaøowych, które. speøniaøyby wszystkie ie zaøo enia stawiane materiaøom do techniki GTR doprowadziøy do opracowania membran o budowie gradientowej. Taka me membrana mbrana powinna, w porównaniu z opisanymi powy ej dost pnymi obecnie rozwi zaniami,, posiada. jeszcze lepsze. wøa ciwo ci mechaniczne i biologiczne. Obecnie wiele o rodków badawczych prowadzi badania nad gradientowymi materiaøami funkcjonalnymi (FGM (FGM, ang. functional gradient materials). Zgodnie z najnowszymi doniesieniami materiaø taki powinien zawiera komponent nieorganiczny np. hydroksyapatyt, fosforan triwapniowy wapniowy -TCP lub szkøo bioaktywne oraz komponent organiczny organiczny, czyli naturalny b d syntetyczny polimer [17]. Komponenty te w pewnyc pewnych obszarach materiaøu wyst puj. jako niezale ne elementy,. a w innych tworz kompozyt. (Rys. 10). Oprócz tego materiaø mo e zawiera dodatkowo takie skøadniki jak czynniki wzrostu,. rodki antybakteryjne czy innego rodzaju leki. wspomagaj ce procesy leczenia [13]. ]. Dzi ki takiej konstrukcji membrany, membrany stworzone zostaøy nowe mo liwo ci zarówno je li chodzi o procesy ot otrzymywania, rzymywania, uøo enia warstw jak i ø czenia elementów nieorganicznych z organicznymi,, tak aby zapewni optymalne warunki (czas degradacji, biozgodno zgodno , osteokonduktywno tywno. czy osteoinduktywno ) do peønej. regeneracji tkanek przyz bia.. Rys. 10 Schemat przedstawiaj cy ide gradientowego radientowego materiaøu funkcjonalnego (FGM).. Przykøadem membrany FGM mo e by membrana skøadaj ca si z kopolimeru L-laktydu, L glikolidu, -kaprolaktonu, kaprolaktonu, w której jako wypeøniacz nieorganiczny zostaø u yty -TCP [70] albo membrana z PGA lub PLA z dodatkiem bioaktywnego szkøa. Badani Badania in vivo pokazaøy, e materiaøy te mog stymulowa ró ne procesy biologiczne biologiczne, tj. aktywno ci osteoblastów czy wpøyn. korzystnie na syntez kolagenu [71, 72]. 28.

(29) I CZ LITERATUROWA ________________________________ ________________________________________________________________ __________________________________________ Innym rozwi zaniem mo e by membran membrana FGM zaproponowana przez Bottino i in. [17, [ 73]. Zaproponowana przez ten zespóø badawczy membrana posia posiada da rdze zbudowany z PLCL (CL) oraz dwie zewn trzne, funkcjonalne, warstwy oparte na elatynie, elatynie PLCL i PLA (SL) (Rys. 11). Warstwa zewn trzna przeznaczona do kontaktu z tkank. kostn. zostaøa. wzbogacona o nano-hydroksyapatyt hydroksyapatyt, co miaøo na celu przyspieszenie procesu formowania nowej tkanki kostnej. Druga warstwa zewn trzna, przeznaczona do kontaktu z nabøonkiem zostaøa. sfunkcjonalizowana unkcjonalizowana. poprzez. dodatek. metronidazolu,. leku. o. dziaøaniu. przeciwbakteryjnym bakteryjnym i grzybobójczym, aby zapobiega ewentualnemu za zasiedleniu membrany przez drobnoustroje.. Rys. 11 Schemat membrany FGM [64].. Materiaøy FGM wydaj. ssi. by. obiecuj cym rozwi zaniem, gdy. mo liwo ci ø czenia. ró nych materiaøów otwieraj szerokie perspektywy zarówno pod k tem materiaøowym jak i biologicznym.. Jednakowo , jak mo na wnioskowa z literatury, membrany FGM, podobnie jak wi kszo. membran do GTR dost pnych na rynku posiadaj budow wøóknist , co mo e. uzna za ich wad , gdy trudno w takich materiaøach kontrolowa udziaø obj to ciowy porów oraz ich wielko. (pkt. 4.2.2.2.) 4.2.2.2.).. 29.

(30) I CZ LITERATUROWA __________________________________________________________________________ Podsumowuj c, w cz ci literaturowej pracy omówiono zagadnienia dotycz ce zarówno samych chorób przyz bia, przyczyn ich wyst powania jak i obecnie stosowanych sposobów leczenia. Jak wskazuj doniesienia literaturowe najbardziej obiecuj cym sposobem leczenia, szczególnie w bardziej zaawansowanych stadiach choroby, a daj cym mo liwo peønej regeneracji utraconych tkanek przyz bia jest metoda regeneracyjna opieraj ca si na technice sterowanej regeneracji tkanek (GTR). Wykorzystywane w tej metodzie materiaøy, w postaci membrany, powinny speønia funkcj bariery mi dzy odtwarzaj c si tkank kostn , a niepo dan w miejscu ubytku tkank ø czn i nabøonkow . Wa ne jest aby ich wøa ciwo ci zarówno fizyczne, chemiczne jak i biologiczne mo na byøo dostosowa w taki sposób aby zapewni mo liwie jak najlepsze warunki dla regeneruj cej si tkanki kostnej. Obecnie na rynku medycznym dost pne s membrany, które umo liwiaj zaj cie procesu regeneracji tkanek przyz bia. Jednak e z uwagi na to, e materiaøy te nie s pozbawione wad, w wielu o rodkach badawczych prowadzone s badania nad otrzymaniem nowych materiaøów do GTR. Badania skupiaj si przede wszystkim na materiaøach degradowalnych, poniewa eliminuje to jedn z podstawowych wad materiaøów biostabilnych, a mianowicie potrzeb powtórnej operacji w celu usuni cia materiaøu po speønieniu jego funkcji. Proponowane modyfikacje dotycz zarówno samych materiaøów, tj. wykorzystania kopolimerów np. PLCL, które u ywane s w innych obszarach medycyny. jak i zmian w obr bie dodatków do. u ywanych ju materiaøów, w celu polepszenia ich wøa ciwo ci. W niniejszej rozprawie przedstawiono odmienne podej cie w stosunku do materiaøów dost pnych na rynku, gdy. wprowadzone modyfikacje nie dotyczyøy samego surowca. polimerowego czy wypeøniaczy, a miaøy na celu lepsze kontrolowanie mikrostruktury materiaøu membranowego. Wi kszo zwracano. uwag ,. ma. wøóknist. dost pnych membran do GTR, na co wcze niej budow ,. mikrostrukturalnych takich jak wielko. która. utrudnia. kontrol. parametrów. porów czy ich udziaø obj to ciowy. Cechy te maj. wpøyw zarówno na wøa ciwo ci mechaniczne, czas degradacji jak i integracj materiaøu z otaczaj c je tkank kostn , a mo liwo. ich kontroli pozwoliøaby na dostosowywanie cech. materiaøu do konkretnego zapotrzebowania. Dlatego w tej pracy skupiono si na otrzymaniu materiaøu speøniaj cego wymagania stawiane materiaøom do GTR, ale posiadaj cego odmienn , niewøóknist budow . Cel i teza pracy zostaøy omówione szczegóøowo w cz ci II, a wyniki przeprowadzonych bada wraz z dokøadniejszym opisem metody otrzymywania i mechanizmu formowania si membrany oraz bada biologicznych przedstawiono w cz ci III – badawczej. 30.

(31) II TEZA I CEL PRACY __________________________________________________________________________. II TEZA I CEL PRACY. Celem rozprawy jest opracowanie nowego typu materiaøów membranowych z kopolimeru L-laktydu i glikolidu (PLGA), przeznaczonych do leczenia ubytków tkanki kostnej w chirurgii stomatologicznej i periodontologii zgodnie z metod. sterowanej. regeneracji tkanek (GTR). Postawiony cel b dzie realizowany poprzez realizacj nast puj cych zada cz stkowych: 1.. Opracowanie metody otrzymywania membran z wykorzystaniem zjawiska separacji faz, które zachodzi mi dzy polimerem matrycowym PLGA i porogenem poli(glikolem etylenowym) – PEG.. 2.. Okre lenie. mechanizmu. formowania. membran,. który umo liwi. kontrolowanie. mikrostruktury otrzymywanych materiaøów. 3.. Dobór odpowiedniego st enia porogenu PEG, nadaj cego membranie maksymaln porowato. przy. zachowaniu. homogeniczno ci. i. odpowiednich. parametrów. mechanicznych. 4.. Sprawdzenie wpøywu masy cz steczkowej u ytego porogenu PEG na mikrostruktur membran.. 5.. Okre lenie mechanizmu degradacji i zbadanie czasu oraz kinetyki degradacji materiaøów w postaci membran.. 6.. Przeprowadzenie. bada. potencjalnej. cytotoksyczno ci. wytworzonych. membran. w kontakcie z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63. 7.. Przeprowadzenie bada. in vitro w kontakcie z komórkami interesuj cymi z punktu. widzenia GTR – ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. 8.. Przeprowadzenie. bada. w. kokulturach. komórkowych:. fibroblasty. i. ludzkie. mezenchymalne komórki macierzyste. W pracy postawiono tez , e mo liwe jest otrzymanie nowego rodzaju niewøóknistej, resorbowalnej membrany przeznaczonej do GTR, posiadaj cej asymetryczn , porowat budow , a dzi ki znajomo ci mechanizmu separacji faz i formowania membrany, w czasie procesu otrzymywania, mo liwa b dzie kontrola mikrostruktury otrzymanych materiaøów, 31.

(32) II TEZA I CEL PRACY __________________________________________________________________________ która w dalszej kolejno. pozwoli na dobór optymalnych warunków hodowli komórkowych,. zapewniaj cych mo liwo. odbudowy tkanki kostnej w miejscu ubytku.. Przeprowadzone badania z wykorzystaniem ró nych st e dobranie takiego st enia, które zapewni najwy sz. porogenu pozwol na. porowato , przy jednoczesnym. zachowaniu ci gøo ci (homogeniczno ci) materiaøu oraz b d stanowi podstaw do dalszych bada. nad okre leniem wpøywu zmian masy cz steczkowej porogenu na mikrostruktur. membran. Testowanie ró nych mas cz steczkowych porogenu daje mo liwo. dostosowania. parametrów budowy mikrostrukturalnej, tj. wielko ci, ksztaøtu porów, ich rozkøadu w obj to ci (asymetryczno ) membrany, do zaøo e. stawianych materiaøom do GTR.. Przeprowadzone. scharakteryzowanie. badania. pozwol. równie. na. mechanicznych opracowanych membran, tj. wytrzymaøo. wøa ciwo ci. na rozci ganie, moduø Younga czy. wydøu enia materiaøu oraz wøa ciwo ci powierzchni, np. k ta zwil ania, topografii i chropowato ci powierzchni. Ocena materiaøu, pod k tem zachowania w. rodowisku. organizmu. degradacji. ywego, zostanie przeprowadzona zarówno w czasie bada. w rodowisku wodnym jak i bada w kontakcie z komórkami in vitro. W czasie degradacji oceniane b d zmiany masy, pH pøynu inkubacyjnego, ale równie wøa ciwo ci mechaniczne i chemiczne membran. Dzi ki tak zaplanowanym badaniom okre lony zostanie czas degradacji PLGA przetworzonego w posta. membran, a tak e zostanie zaproponowany. mechanizm ich degradacji. Badania biologiczne in vitro zostaøy podzielone na trzy etapy. W pierwszym etapie oceniana b dzie potencjalna cytotoksyczno. otrzymanych membran w kontakcie. z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63. W kolejnych etapach zostan wykorzystane komórki interesuj ce z punktu widzenia leczenia chorób przyz bia metod GTR – ludzkie fibroblasty i ludzkie mezenechymalne komórki macierzyste. Najpierw okre lony zostanie wpøyw porowato ci membran na zachowanie komórek, co pozwoli na zoptymalizowanie warunków hodowli komórek kostnych i fibroblastów. Poniewa w organizmie ludzkim oba typy komórek, w tym samym czasie b d miaøy kontakt z membran , w ostatnim etapie zaplanowano badania komórkowe w kokulturze, aby mo liwe najlepiej odwzorowa warunki w jakich znajdzie si otrzymana membrana w czasie praktyki klinicznej. Tak zaplanowane badania umo liwi. zarówno otrzymanie materiaøu jak i jego. kompleksowe scharakteryzowanie oraz dostosowanie do wymogów jakie stawiane s materiaøom dla sterowanej regeneracji tkanek w periodontologii i chirurgii szcz kowotwarzowej. 32.

(33) III CZ. DO WAIDCZALNA MATERIAèY I METODY. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________. III CZ. DO WIADCZALNA. 1. MATERIAèY ATERIAèY I METODY 1.1. Charakterystyka materiaøu matrycowego poli(L-laktydu-co-glikolidu) glikolidu) (PLGA). Materiaøem matrycowym, z którego wykonano membrany jest kopolimer L-laktydu i glikolidu poli(L-laktyd--co-glikolid) (PLGA), w którym stosunek molowy jednostek laktydowych do glikolowych wynosi 85:15. Masa molowa polimeru wynosiøa wynosi Mn = 100 kDa, a g sto. 1,24 g/cm3. PLGA u yty do bada. zostaø otrzymany w wyniku procesu. polimeryzacji z otwarciem pier cien cienia, z u yciem inicjatora niskotoksycznego toksycznego zwi zku acetyloacetonianu cyrkonu Zr(acan)4 [74]. Wzór póøstrukturalny alny PLGA przedstawiono na Rys. 12.. Rys. 12 Wzór póøstrukturalny PLGA. 1.2. Charakterystyka porogenu poli(glikolidu etylenowego) (PEG) Jako. rodek porotwórczy ((porogen) zastosowano poli(glikol glikol etylenowy) (PEG,. Aldrich)) o ró nych masach cz steczkowych. Zastosowane rodzaje PEG charakteryzuj si ró nymi wøa ciwo ciami, tj. ró nymi warto ciami masy cz steczkowej, g sto ci, temperatury topnienia: PEG 300 (Mn = 300 Da, = 1,125 g/cm3, Tm = -15 ÷ - 8ºC), PEG 400 (Mn = 400 Da, = 1,128 g/cm3, Tm = 4 ÷ 8ºC), PEG 600 (Mn = 600 Da, = 1,128 g/cm3, Tm = 20 ÷ 25ºC), PEG 1000 (Mn = 1000 Da, = 1,101 g/cm3, Tm = 39ºC) i PEG 3400 (Mn = 3400 Da, = 1,204 g/cm3, Tm = 54 ÷ 58ºC). Wzór póøstrukturalny lny PEG przedstawiono na Rys. 13. 13. Rys. 13 Wzór póøstrukturalny PEG. 33.

(34) III CZ. DO WAIDCZALNA MATERIAèY I METODY. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 1.3. Otrzymywanie membran Membrany zostaøy wykonane metod odlewania z roztworu i wypøukiwania porogenu. W pierwszym etapie PLGA zos zostaø rozpuszczony w 10% roztworze chlorku metylenu (CH2Cl2, POCh, Gliwice) po 24 h do roztworu zostaø dodany PEG (w odpowiednim st eniu wagowym, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% i 80% 80%). Po homogenizacji (okoøo 30 min) roztwór zostaø odlany na szklan. szalk. Petriego i pozostawiony, a. do momentu. odparowania rozpuszczalnika. nika. Odparowanie rozpuszczalnika byøo prowadzone dwuetapowo, blendy polimerowe PLGA--PEG byøy suszone przez 24 h w powietrzu rzu i nast pnie przez 24 h w pró ni. Ostatnim etapem otrzymywania membran byøo wypøukanie porogenu z blend. W tym celu blendyy zostaøy zanurzone w wodzie o ultra wysokiej czysto ci (UHQ, PureLab, Elga, UK) i pozostawaøy waøy w niej przez okres 3 dni; w czasie procesu wypøukiwania woda byøa wielokrotnie wymieniana (~ 40 razy) razy). Schemat otrzymywania membran zostaø z przedstawiony na Rys. 14,, a szczegóøowy opis zosta zostaøø uj ty w zgøoszeniu patentowym [75]. [ Jako materiaø porównawczy odlano równie czyste folie z PLGA.. Rys. 14 Schemat otrzymywania membran PLGA. PLGA. 34.

(35) III CZ. DO WAIDCZALNA MATERIAèY I METODY. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 1.4. Charakterystyka membran 1.4.1. Grubo Grubo. i udziaø obj to ciowy porów. membran byøa mierzona za pomoc. ruby mikrometrycznej. Pomiar byø. wykonywany w dziesi ciu miejscach dla trzech ró nych membranach tego samego typu. Udziaø obj to ciowy porów, odpowiadaj cy procentowi wypøukanego PEG, zostaø wyznaczony na podstawie zmierzonych ró nic masy blendy i membrany przed i po procesie wypøukiwania. Do oblicze zostaø wykorzystany wzór (1).. % wypø. PEG. 100%. 100%. (1). Gdzie : M0 – oznacza mas blendy przed procesem wypøukiwania, a MP – mas membrany po procesie pøukania. Obliczenia zostaøy przeprowadzone dla 10 membran. Wyniki pomiaru grubo ci membran jak i udziaøu procentowego porów zostaøy przedstawione jako rednie ± bø d standardowy. 1.4.2. Mikrostruktura Do scharakteryzowania mikrostruktury membran zostaø u yty skaningowy mikroskop elektronowy (SEM, Nova NanoSEM, FEI, USA). Napi cie przyspieszaj ce wi zk elektronów miaøo warto. 18 kV. Zdj cia wykonano dla obydwu powierzchni membran. górnej, tj. tej która w trakcie procesu otrzymywania miaøa kontakt z powietrzem i dolnej, tj. tej która w trakcie procesu otrzymywania miaøa kontakt ze szklan powierzchni szalki Petriego. Analizie poddano równie. przeøamy membran, które zostaøy wykonane po. umieszczaniu fragmentów membran w ciekøym azocie. Wykonano równie zdj cia czystej folii PLGA. Przed analiz. próbki zostaøy napylone ultracienk. warstw. w gla, która. przeciwdziaøaøa gromadzeniu si øadunków w trakcie obserwacji mikroskopowej. Zdj cia zostaøy wykonane przy powi kszeniach 2000 i 5000 razy.. 35.

(36) III CZ. DO WAIDCZALNA MATERIAèY I METODY. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 1.4.3. Topografia powierzchni Obraz topografii powierzchni zostaø zarejestrowany przy u yciu mikroskopu siø atomowych (Explorer, Veeco, USA) w trybie kontaktowym. Dzi ki oprogramowaniu (SPMLab6.0.2 Explorer) mo liwe równie. byøo wyznaczenie. (zgodnie ze wzorem 2), jak i wyznaczenie wielko. 1. |. Gdzie: Ra oznacza redni arytmetyczn odchyle. redniej chropowato. powierzchni Ra. porów.. | (2) profilu od linii redniej, Ir – døugo. odcinka elementarnego, Z(x) – funkcja okre laj ca odchylenia od profilu. Podobnie jak w przypadku bada. SEM analizie poddane zostaøy obie powierzchnie. membrany (górna i dolna) oraz czysta folia PLGA. Dla ka dej powierzchni zarejestrowano po sze. obrazów dla obszaru skanowania 100 m x 100 m z szybko ci skanowania 3 linie/s.. Warto ci Ra i wielko ci porów zostaøy przedstawione jako rednia ± bø d standardowy. 1.4.4. Zwil alno Zwil alno. powierzchni. powierzchni zostaøa wyznaczona poprzez pomiar k ta zwil ania przy pomocy. goniometru (DSA10, Krüss, Niemcy) wyposa onego w system to analizy ksztaøtu kropli. Ciecz pomiarow obj to. byøa woda UHQ (PureLab, Elga, UK), a analizowane krople miaøy. 0,2 l. Pomiary zostaøy wykonane dla górnej i dolnej powierzchni membrany jak. i dla czystej folii PLGA. K t zwil ania zostaø u redniony z pomiaru dziesi ciu kropli dla ka dej serii pomiarowej i przedstawiony jako rednia ± bø d standardowy. 1.4.5. Wøa ciwo ci chemiczne powierzchni Badania za pomoc spektroskopii w podczerwieni zostaøy wykonane technik caøkowitego wewn trznego odbicia (FTIR-ATR), w zakresie rodkowej podczerwieni (4000 ÷ 550 cm-1) z rozdzielczo ci 4 cm-1 na urz dzeniu Digilab FTS 60V, Bio-Rad przy wykorzystaniu. 36.

(37) III CZ. DO WAIDCZALNA MATERIAèY I METODY. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________. krysztaøu ZnSe. Badanie zostaøo wykonane na membranach, blendach PLGA/PEG jak i czystych polimerach: PLGA i PEG. 1.4.6. Wytrzymaøo. mechaniczna. Membrany oraz czysta folia PLGA zostaøy po poddane ddane jednoosiowemu rozci ganiu w celu wyznaczenia wytrzymaøo ci mechanicznej na rozci ganie ganie,, moduøu Younga, odksztaøcenia maksymalnego oraz odksztaøcenia przy zerwaniu. W badaniu tym wykorzystano uniwersaln maszyn wytrzymaøo ciow Zwick 1435 (Niemcy). Pr dko wartoo. obci enia wst pnego 0,1 N, odlegøo. 5 mm. Wykonano po sze. testu wynosiøa 100 mm/min,. mi dzy szcz kami 40 mm i szeroko s. próbki. pró próbb dla ka dego rodzaju materiaøu, a wyniki przedstawiono jako. redni ± bø d standardowy. 1.5. Szybko. odparowania rozpuszczalnika. W celu wyja nienia nia mechanizmu separacji faz PLGA/PEG i powstania membran przeprowadzono badania szybko ci odparowywania rozpuszczalnika zarówno z blend PLGA/PEG jak i z czystych polimerów: PLGA i PEG. Do wiadczenie przeprowadzono w ten sposób,. e rozpuszczone i zhomogenizowane roztwory (przygotowane tak samo jak. w przypadku odlewania blend) byøy odlewane na szklane szalki Petriego umieszczone na wadze elektronicznej (RADWAG WPX 250, Radom, Polska) (Rys. 15). ).. Rys. 15 Schemat odparowywania rozpuszczalnika. rozpuszczalnika. Zmiany masy byøy rejestrowan rejestrowane co minut przez 60 minut, a nast pnie co 5 minut przez kolejne 60 minut. Szybko. suszenia zostaøa obliczona na postawie krzywych zale no ci 37.