1.6.1 Ewolucja klonalna nowotworu
Spośród modeli rozwoju nowotworów na szczególną uwagę zasługują dwa, pozornie konkurencyjne, modele opisujące rozwój heterogenności fenotypowej komórek budujących nowotwór. W 1976 roku Nowell zasugerował, że rozwój nowotworu jest funkcją klonalnej ekspansji komórek o różnych fenotypach. Sugestia ta leży u podstaw tzw. modelu ewolucji klonalnej [Nowell, 1976]. Zakładając, że w trakcie rozwoju nowotworu komórki nowotworowe podlegają mikroewolucji stwierdził on, że jeśli takie zmiany przynoszą korzyść selekcyjną komórce, w której powstały, komórka ta i jej potomstwo będą skutecznie konkurować z innymi komórkami. Ewolucja klonalna zachodzi w wyniku, następujących po sobie, cykli proliferacji/dywersyfikacji/ekspansji komórek, co może prowadzić do zróżnicowania fenotypowego guza. Według tej hipotezy różnorodność w obrębie guza wynika przede wszystkim ze zmian genetycznych wpływających na komórki, które pochodzą z tej samej komórki TIC. Co ważne, model ten tłumaczy w jaki sposób może dojść do wykształcenia klonu komórek zdolnych do inwazji sąsiednich tkanek i formowania przerzutów. Wśród procesów wywołujących rozwój klonów inwazyjnych wymieniane jest EMT. Ponadto uważa się, że ewolucja klonalna jest odpowiedzialna za oporność nowotworów na chemio- i radioterapię.
EMT jest traktowane jako jedno z potencjalnych źródeł tej oporności [Singh i Settleman, 2010]. Chociaż trudno zdobyć bezpośrednie dowody na rolę ewolucji klonalnej w progresji nowotworu, hipotezę tą potwierdzają niektóre cechy nowotworów, w tym różnorodność fenotypowa komórek [Marusyk i in., 2009], niestabilność genetyczna [Hanahan i Weinberg, 2000; 2011], obecność klonów opornych na chemioterapię [Shah i Sawyers, 2003] i występowanie w nowotworach komórek wykazujących różną ekspresję markerów EMT [Lyons i in., 2008].
Według modelu ewolucji klonalnej, komórki guza pierwotnego i wtórnego powinny dzielić większość aberracji genetycznych, przy czym komórki przerzutu (powstające z komórek inwazyjnych powstałych w trakcie ewolucji klonalnej komórek guza pierwotnego) powinny posiadać dodatkowe mutacje, które nie występują w komórkach guza pierwotnego. Co ciekawe, choć wiele raportów (przynajmniej częściowo) potwierdza ten aspekt ewolucji klonalnej [Fujii i in., 1996; Kuukasjarvi i in., 1997; Jones i in., 2008], kilka innych sygnalizuje istnienie różnych wzorców zmian
30 genetycznych w guzach pierwotnych i wtórnych u tego samego pacjenta [Albanese i in., 2004; Katona i in., 2007; Artale i in., 2008; Kalikaki i in., 2008]. Dane te sugerują, że źródłem przerzutów w niektórych nowotworach mogą być komórki, które były zdolne do inwazji na wczesnym etapie rozwoju nowotworu. Niewykluczone, że komórki te mogły być bardziej stabilne genetycznie, dając po czasie inny wzór aberracji genetycznych w przerzucie niż obserwowany w ewoluującym klonalnie guzie pierwotnym. Zasadniczo hipoteza ewolucji klonalnej zakłada, że wszystkie komórki w obrębie guza powinny wykazywać porównywalny potencjał do różnicowania i odtwarzania guza, zdolność do samoodnowy i wytwarzania przerzutów, a ograniczeniem jest tylko czas potrzebny do nabycia przez nie cech inwazyjnych. W modelu tym, heterogenność komórek jest odbiciem współistniejących w danym czasie różnych klonów komórek.
1.6.2 Model nowotworowych komórek macierzystych
Z drugiej strony, różnorodność fenotypowa komórek guza może być wynikiem aktywności komórek wykazujących cechy komórek macierzystych; zdolność do samoodnowy, różnicowania i nieograniczonej proliferacji [Reya i in., 2001]. Obecnie formułowane modele nowotworowych komórek macierzystych (ang. Cancer Stem Cells; CSC) zakładają, że nowotwory są utrzymywane i propagowane przez przypuszczalnie niewielkie sub-populacje takich komórek. W pewnym sensie, wczesną wersję tej hipotezy przedstawił już w XIX wieku Juliusz Cohnheim [Cohnheim, 1875].
Na podstawie podobieństw niektórych cech komórek nowotworowych i komórek embrionalnych zasugerował on, że nowotwory powstają z komórek embrionalnych pozostałych po rozwoju zarodkowym. Model ten zakłada, że podobnie jak w większości narządów gdzie obecne są pule tkankowo-specyficznych komórek macierzystych, które mają zdolność odnowy tkanki, również w guzie obecne są nowotworowe komórki macierzyste odpowiedzialne za jego wzrost i homeostazę [Kim i in., 2005; Osawa i in., 1996; Reynolds i Weiss, 1996]. Może je charakteryzować nieograniczona zdolność do proliferacji, natomiast bardziej zróżnicowane, potomne komórki nowotworowe dysponują już tylko ograniczoną zdolnością podziałową. Zatem, według tego modelu, wzrost nowotworu pierwotnego oraz wzrost przerzutów są podtrzymywane przede wszystkim przez niewielką populację komórek a sama struktura nowotworu ma charakter hierarchiczny.
31 Pierwsze próby doświadczalnego potwierdzania zasadności modelu nowotworowych komórek macierzystych miały miejsce w latach 60-tych ubiegłego wieku. Southam i Brunschwig przeszczepiali pacjentom komórki wcześniej usuniętych nowotworów. Zauważono wtedy, że trzeba wszczepić co najmniej 106 komórek, by w miejscu implantacji wytworzył się guz [Southam i Brunschwig, 1961]. Badania te (uznane później za nieetyczne) zasugerowały, że tylko ułamek procenta komórek guza jest zdolny do wytwarzania przerzutów. Pierwszej izolacji komórek nowotworowych o cechach komórek macierzystych dokonano w laboratorium Johna Dicka w 1994 [Lapidot i in., 1994]. Transplantując różne populacje komórek ostrej białaczki mieloidalnej do myszy SCID zespół ten wykazał, że tylko komórki pozytywne dla markera CD34 są zdolne zainicjować rozwój choroby. Późniejsze badania wykazały istnienie populacji komórek CSC w guzach m.in. płuca, piersi, trzustki, prostaty, czerniaku i glejakach [Visvader i Lindeman, 2008; 2012]. W tym czasie doszło również do poszerzenia palety markerów powierzchniowych, w oparciu o obecność których izolowane są komórki CSC. Dla przykładu markerem komórek CSC w białaczkach jest odpowiedzialna za adhezję międzykomórkową glikoproteina CD34. Za komórki CSC w rakach i glejakach uważa się komórki wykazujące ekspresję białek H-CAM (CD44), β1-integryny (CD29) oraz promininy-1 (CD133) [Klonisch i in., 2008; Panyam, 2013].
Analizy cytometryczne wykazały jednak znaczną niejednorodność populacji CSC w rakach. Często zdarza się, że w jednym nowotworze nie wszystkie komórki z wyraźną ekspresją CD133 wykazują ekspresję CD44 lub CD29, a jednak zachowują zdolność tworzenia nowotworów w organizmach myszy SCID [Visvader i Lindeman, 2008;
Lorico i Rappa, 2011; Atlasi i in., 2014].
Wyniki najnowszych badań potwierdzają, że populacje komórek macierzystych w obrębie guzów mogą być heterogenne i bardzo plastyczne. Ponieważ akumulacja zmian genetycznych i epigenetycznych oraz wpływ mikrośrodowiska wymusza ciągłą mikroewolucję komórek nowotworowych, każda z nich może potencjalnie stać się komórką CSC [Marusyk i Polyak, 2009; Marusyk i in., 2012]. Również same komórki CSC mogą podlegać zmianom genetycznym, tak jak wykazano dla komórek CSC białaczki, które są zdolne do rearanżacji genów kodujących łańcuchy ciężkie immunoglobulin [Visvader i Lindeman, 2008]. Postuluje się również rolę EMT w transformacji komórek CSC [Singh i Settleman, 2010]. W latach 2006-2008 zespół Weinberga analizował powiązania między tkankowo-specyficznymi komórkami macierzystymi, komórkami CSC oraz komórkami nowotworowymi, które przeszły EMT
32 [Mani i in., 2008; Gupta i in., 2009]. Wyniki tych badań wykazały, że zarówno tkankowo-specyficzne komórki macierzyste, jak i komórki CSC w raku piersi wykazują wysoki poziom ekspresji markerów związanych z EMT (N-kadheryny, FOXC2).
Dodatkowo indukcja EMT w komórkach raka piersi prowadziła do podniesienia ekspresji markerów związanych z macierzystością [Mani i in., 2008]. Wyniki tych doświadczeń sugerują, że EMT może być odpowiedzialne za wytwarzanie komórek CSC. Podobne obserwacje poczyniono później w raku prostaty [Giannoni i in., 2010]
i płuca [DiMeo i in., 2009]. Uważa się, że EMT może również uczestniczyć w wykształcaniu populacji migrujących, inwazyjnych CSC zdolnych do tworzenia przerzutów [Singh i Settleman, 2010].
Dane te wskazują, że CSC mogą uczestniczyć w procesie przerzutowania na kilka sposobów. Po pierwsze, przerzutować mogą CSC, które dały początek guzowi pierwotnemu. Po drugie, w progresję nowotworu zaangażowany może być nowy typ komórki macierzystej pochodzącej od „pierwotnej” CSC, która zapoczątkowała nowotwór lub od innej komórki nowotworowej. Komórki takie mogą mieć przewagę nad innymi ze względu na wcześniejsze modyfikacje genetyczne i epigenetyczne zwiększające ich inwazyjność. Wreszcie CSC może przerzutować wraz z innym typem komórek nowotworowych i/lub rozwijać się de novo w miejscu przerzutu wskutek odróżnicowania komórek inwazyjnych [Marusyk i Polyak, 2009]. Wyniki badań zespołu Weinberga wykluczyły również, że CSC rozwijają się wyłącznie z „prawidłowych”
komórek macierzystych. Nowotworowe komórki macierzyste i tkankowo-specyficzne komórki macierzyste wydają się mieć podobne profile epigenetyczne i profile ekspresji genów. Aktywują też te same szlaki sygnałowe, takie jak Notch, Hedgehog i Wnt [Gupta i in., 2009]. Jednak niekoniecznie wywodzą się one z „prawidłowych” komórek macierzystych i nie jest jasne, czy zachowują zdolność do różnicowania lub inne cechy właściwe tkankowo-specyficznym komórkom macierzystym [Mani i in., 2008; Visvader i Lindeman, 2012; Atlasi i in., 2014].
Koncepcja nowotworowych komórek macierzystych może też częściowo wyjaśniać niepowodzenia chemio- i radioterapii w leczeniu nowotworów [Rosen i Jordan, 2009; Dave i in., 2012]. Niektóre nowotwory, jak np. glejaki, często odrastają po napromieniowaniu jako małe, rozsiane masy nowotworowe. Sugeruje to, że jedynie pewna frakcja komórek nowotworowych jest odpowiedzialna za wznowę [Sakariassen i in., 2007]. CSC okazały się być bardzo oporne na działanie terapii przeciwnowotworowych. Dlatego, w wielu przypadkach konwencjonalna radio-
33 i chemioterapia mogą działać tylko na bardziej „dojrzałe” komórki, podczas gdy komórki CSC są oporne na terapię [Korkaya i Wicha, 2007]. Mechanizm oporności CSC na leki nie jest dobrze poznany. Możliwe wyjaśnienia tego zjawiska obejmują nadekspresję białek oporności wielolekowej (MDR); enzymów metabolizujących leki lub białek anty-apoptotycznych [Chen i Sikic, 2012]. Sugeruje się również, że przynajmniej część oporności CSC na terapie może być spowodowana zwiększoną intensywnością autofagii [Ishii i in., 2008].
Należy podkreślić, że modele ewolucji klonalnej oraz nowotworowych komórek macierzystych nie wykluczają się wzajemnie, co oznacza, że nowotwór może się rozwijać równocześnie według obu scenariuszy. Zarówno komórki CSC jak i ich potomstwo mogą podlegać ewolucji klonalnej i łączyć oba modele w model klonalnej ewolucji komórek macierzystych [Shackleton, 2010]. W niektórych interpretacjach modelu nowotworowych komórek macierzystych zakłada się, że potomstwo CSC w trakcie różnicowania może podlegać kolejnym zmianom genetycznym powodującym tworzenie nowych sub-populacji. W takim przypadku „pień” nowotworu opierałby się na zdolności do samoodnowy i różnicowania komórek CSC, ale potomstwo („gałęzie”) podlegałoby zmianom zgodnym z modelem ewolucji klonalnej [Clevers, 2011].
Spekuluje się, że EMT może uczestniczyć w budowaniu heterogenności fenotypowej komórek w guzach rozwijających się zgodnie z modelem macierzystych komórek nowotworowych. Z jednej strony EMT odpowiadać może za wytwarzanie populacji komórek CSC, z drugiej może ono zachodzić w kolejnych pokoleniach komórek powstałych na skutek różnicowania CSC [Gupta i in., 2009]. W drugim przypadku EMT odgrywałoby podwójną rolę; napędzałoby ewolucję klonalną i rozwój populacji inwazyjnych oraz odpowiadałoby za wytwarzanie nowej puli CSC.