tłumaczenie z angielskiego oryginału - dr hab. Elżbieta Jankowska, prof. UG
Jestem głęboko zaszczycony faktem , iż zostałem wybrany na doktora honoris causa U niw ersytetu Gdańskiego. O pow iem teraz trochę o sobie, o nauce, w którą jestem zaangażowany, i o współpracy, jaką ja i m oi w spółpracownicy m ieliśm y okazję podjąć ze w spaniałym i polskim i naukowcami, związanym i głów nie z Uniw ersytetem Gdańskim.
Chem ią zainteresowałem się, gdy m iałem około dziesięciu la t - w tedy to m ój nauczyciel chem ii na pierwszym wykładzie przeprow adził ekspery
m ent pokazujący, jak rozpalić ogień pod wodą. D o reakcji tej w ykorzystał żó łty fosfor i chloran potasu. B yłoby to całkowicie niem ożliwe do zrobienia dzisiaj, gdy - niestety - ważniejsze jest zaszczepianie w chłopcach i dziewczę
tach ostrożności niż ciekawości. Zrozum iałem wtedy, że w chem ii wszystko jest m ożliw e i że ważne jest, by wciąż zadawać sobie pytanie, czy rozw ój świata dokonuje się dzięki osobom ostrożnym czy ciekawym. W to ku m oich badań uświadom iłem sobie z fascynacją, że procesy zachodzące w człowieku to przykład najbardziej złożonej chem ii i że odpow iada ona za zdrow ie, choroby, a także świadomość. R ów nie intrygująca była m yśl, że wszystko to opiera się na właściwościach pierwiastków, a te z kolei były nieodłącznym elementem W ielkiego W ybuchu - k tó ry lepiej byłoby może nazwać W ielką Falą Mózgową lub Umysłową, był bowiem bezgłośny.
K iedy we wczesnych latach siedemdziesiątych znalazłem się na rozdrożu chem ii oraz ludzkiego zdrow ia i chorób, czyli w obszarze chem ii klinicznej, zapragnąłem zacząć poznawać św iat procesów chemicznych zachodzących w człow ieku. M oje pierwsze spotkanie z cząsteczką o nieznanej strukturze i fu n kcji odcisnęło na m nie swoje piętno, tak jak to bywa, zgodnie z teorią Lorenza, w wypadku niektórych ptaków, na których piętno odciska pierwsze stworzenie, które widzą, kiedy w ykluw ają się ze swoich jaj.
Tą cząsteczką była cystatyna C, która w tam tych czasach nie miała jeszcze własnej nazwy, ponieważ praktycznie nic nie było wiadom o o jej budowie, fu n kcji ani m ożliw ym zastosowaniu w medycynie. W yizolow aliśm y ją zatem i zsekwencjonowaliśmy jej pojedynczy łańcuch polipeptydowy, co w tam tych czasach wcale nie było łatw e. M ie liśm y nadzieję, że uzyskamy wsparcie ze strony rozwijającej się inform atyki, która um ożliw iała porównanie sekwen
c ji am inokwasowych wszystkich białek o znanych i nieznanych funkcjach.
63
G dyby udało się znaleźć hom ologię sekwencyjną m iędzy cystatyną C a innym białkiem o znanej funkcji, silnie sugerowałoby to, że cystatyna C może pełnić podobną rolę. Ale sekwencja cystatyny C nie przypominała żadnej innej znanej wówczas sekwencji. Z jednej strony fakt ten był niefortunny, ponieważ nadal nie m ieliśm y pojęcia o jej funkcji - z drugiej jednak oznaczało to, że cystatyna C jest pierwszym członkiem nowej, ekscytującej nadrodziny białek.
M ożliwość porównania nieznanej sekwencji aminokwasowej ze wszystkimi znanym i ju ż sekwencjami odzw ierciedla pewien ważny fa kt - m ianow icie że nowoczesna chemia posługuje się uniwersalnym językiem , rozum ianym przez chem ików ze wszystkich krajów świata. W iele jest języków na Ziem i i używają one w ie lu różnych lite r; lite ra m i chem ii są natom iast symbole pierwiastków. Symbole te, w postaci pierwszej lite ry bądź pierwszych dwóch lite r łacińskiej lub greckiej nazwy, zostały zaproponowane przez szwedzkiego lekarza i chemika Jónsa Jacoba Berzeliusa na początku X IX w ieku. O d około 200 lat i przez całą wieczność wszyscy chemicy we wszystkich krajach będą zatem w iedzieli dokładnie, co oznaczają lite ry C, N , O, H i H 20 , ale tylko ułam ek wszystkich ludzi będzie wiedzieć, co oznacza, na przykład, „navcaq” . Uniwersalny język chem ii p o zw o lił na odkrycie funkcji cystatyny C dzięki pow iązaniu jej z procesem zm iękczania mięsa. W K a lifo rn ii mięso często zmiękcza się poprzez wstrzyknięcie zwierzętom kosztownej papainy podczas uboju i hodowcy bydła nie chcieli pogodzić się z faktem , że potrzebow ali tak dużych ilości tego enzymu. W związku z tym wyasygnowali środki na granty dla pobliskich uniwersytetów, w nadziei, że naukowcy będą w stanie w yja
śnić, dlaczego zapotrzebowanie na papainę jest tak ogromne. Pewni badacze przyłączyli ją do nierozpuszczalnej m atrycy stanowiącej wypełnienie kolum ny chrom atograficznej, a następnie przepuszczali przez nią różne płyn y b io logiczne, badając, czy coś się do niej wiąże. G dy przez kolum nę przepusz
czone zostało białko jaja, o dkryto, iż przyłączyło się ono do papainy. G dy białko to w yizolow ano i zsekwencjonowano, okazało się, że jego sekwencja jest wysoce hom ologiczna do wcześniej określonej sekwencji cystatyny C, co p ozw oliło natychm iast ustalić, że jest ona inh ib ito re m papainy. Obecnie w iadom o, że jest to najważniejszy in h ib ito r w ielu istotnych ludzkich proteaz cysternowych, na przykład katepsyn B, K , L i H .
Interesującą cechą białek jest to, że za pełnione przez nie funkcje odpo
w iada często bardzo m ały fragm ent nazywany m iejscem aktyw nym lub, w wypadku in h ib ito ró w proteaz, miejscem inhibitorow ym . Po zidentyfikowa
niu takiego miejsca m ożliwe staje się otrzymanie związku małocząsteczkowego o działaniu biologicznym takim samym lub podobnym do działania całego białka. Te niskocząsteczkowe zw iązki często mogą być wykorzystywane jako leki. Identyfikacja miejsca aktywnego lub inhibitorow ego jest zwykle bardzo trudna i wymaga znajomości trójw ym iarow ej struktury białka, w wypadku
64
cystatyny C dokonaliśm y jednakże nieoczekiwanej obserwacji, że niektóre je j preparaty zawierają pewną ilość białka, w któ ry m brakuje jedenastu N -końcow ych reszt aminokwasowych. Ten w ariant tracił większość zdolności inhibitorow ych i dlatego było bardzo prawdopodobne, że przynajm niej część miejsca inhibitorow ego cystatyny C zawiera się w N -końcow ym jedenasto- peptydzie. Obserwacji tej dokonano w 1986 roku. Wówczas to zapragnęliśmy sprawdzić, czy pochodne peptydylowe zaprojektowane w oparciu o ten frag
m ent będą naśladować właściwości cystatyny C na przykład pod względem inhibicyjnego działania wobec proteaz cysternowych. Próbowaliśm y zatem znaleźć w Szwecji naukowców lu b chemików, którzy bylib y w stanie zsyn- tezować taicie pochodne. M im o znacznych w ysiłków nie pow iodło nam się.
W końcu skontaktowaliśmy się z chemikiem Jerzym Trojnarem z firm y Ferring w M alm ó. Pochodził on z Polski i znał Zbigniew a Grzonkę oraz jego grupę z U niw ersytetu Gdańskiego - powiedział m i też, że jeśli ktokolw iek jest w sta
nie zsyntezować wymagane pochodne peptydylowe, jest to właśnie Zbigniew i jego grupa badawcza. Jerzy skomunikował się ze Zbigniewem i nawiązaliśmy kontakt. M łodym ludziom hołubiącym swoje telefony kom órkowe trudno zapewne zrozum ieć, jak problem atyczna była kom unikacja m iędzy Polską i Szwecją w latach osiemdziesiątych. Każde połączenie telefoniczne trzeba było zamawiać z co najm niej czterogodzinnym wyprzedzeniem, żeby m ógł zostać w ybrany odpow iedni cenzor do sprawdzenia, czy Z bigniew i ja nie spiskujemy przeciwko komunistycznemu rządowi Polski. Cenzorzy ci nie byli chem ikam i i m usiały ich śm iertelnie nudzić nasze dyskusje na tem at chem ii.
A le ich podstawowe założenie było słuszne - ani Zbigniew, ani ja nie ceni
liśm y zbytnio komunistycznego rządu. Oczywiście Z bigniew i jego w spół
pracow nicy, w tym Franciszek Kasprzykow ski i Leszek Pankiew icz, b y li w stanie zsyntezować interesujące nas pochodne peptydylow e naśladujące działanie inhibitorow e cystatyny C wobec proteaz. N iektóre z tych związków były i nadal są najlepszymi dostępnym i in h ib ito ra m i proteaz cysternowych.
A ja k się często zdarza w chem ii i nauce, niektóre pochodne przejaw iały rów nież zaskakujące dodatkowe właściwości i okazały się skutecznymi środ
kam i przeciw w irusow ym i i przeciwbakteryjnym i, zabijającymi nawet szczepy bakterii odporne na wszystkie inne znane antybiotyki. Dalszy rozw ój w tej dziedzinie ma miejsce głów nie w Gdańsku i skupia się na opracowywaniu nowych rodzajów substancji przeciwbakteryjnych i antywirusowych. Pierwszy produkt został niedawno wprowadzony do użytku medycznego w Gdańsku.
Chociaż N-końcowa część cystatyny C wyraźnie stanowiła element miejsca inhibitorow ego, do pełnej jego charakterystyki potrzebna była jednak znajo
mość trójw ym iarow ej stru ktu ry cystatyny C. U staliliśm y sekwencje kwasów nukleinow ych m R N A i gen dla cystatyny C i byliśm y w stanie skonstru
ować system do wydajnej produkcji rekombinowanej cystatyny C, identycznej
65
z form ą natywną, wyizolowaną z ludzkich płynów. Nasza grupa badawcza nie była w stanie wykorzystać krystalografii w badaniach białek, skontaktow ali
śmy się więc z grupam i krystalograficznym i na całym świecie, by zaciekawić je trójw ym iarow ą strukturą cystatyny C. W szystkie wykazały nią duże zain
teresowanie, wysłaliśm y im więc kilka gram ów rekom binowanej cystatyny C do badań. M im o że dwie grupy prowadzone były przez laureatów nagrody N obla, żadna nie była w stanie przedstawić danych na tem at trójw ym iarow ej s tru k tu ry cystatyny C. Z b ig n ie w zaprosił jednak do w spółpracy doświad
czonych krystalografów z U niw ersytetu Adama M ickiew icza w Poznaniu, a w śród nich Mariusza Jaskólskiego, Roberta Janowskiego i Macieja Kozaka, którzy dzięki nowatorskiem u myśleniu zdołali określić strukturę krystaliczną cystatyny C jako dim eru z wymianą domen. B ył to duży krok naprzód w okre
śleniu miejsca inhibitorow ego cystatyny C, a jednocześnie argument za nową hipotezą na tem at sposobu, w ja ki natywne białka mogą agregować i tworzyć szkodliwe zło g i fibrylarne towarzyszące chorobom am yloidow ym takim jak choroby Alzheim era i Parkinsona.
Ponieważ cystatyna C w ystępuje w płynach u stro jo w ych człow ieka jako m onom er, trójw ym iarow a struktura dim eru nie najlepiej nadawała się do badań miejsca inhibitorow ego m onom eru. Jednakże znajomość struktury dim eru p o zw o liła nam skonstruować w a ria n t cystatyny C, k tó ry poprzez wprowadzenie wewnętrznego wiązania disułfidowego ustabilizowaliśm y jako monom er, także w strukturze krystalicznej. Trójw ym iarow a struktura tego m onom eru pozw oliła na wyciągnięcie w niosków dotyczących nie tylko m iej
sca in h ib ito ro w e g o natywnego białka m onom erycznego, ale także innych obszarów cząsteczki mających znaczenie dla jego stabilności.
Z ło g i am yloidow e występujące w m ózgu osób starszych lub cierpiących na chorobę Alzheim era zbudowane są głów nie z peptydu A(342, produktu rozszczepienia prekursorow ego białka am yloidu (A P P ). W spółw ystępują w n ich jednak także znaczące ilo ści natyw nej cystatyny C. Sugeruje to , iż natyw na cystatyna C jest podatna na agregację, co zgadza się z je j ten
dencją do dim eryzacji podczas krystalizacji. W latach trzydziestych islandzki lekarz A rn i Arnason zauważył, że około 25% członków niektórych dużych ro d zin zm arło przed 30 rokiem życia z pow odu k rw o to k u m ózgowego.
C horobę tę nazw ał „dziedzicznym krw o to kie m m ózgow ym ” (hereditary bm in haemorrhage). N aturalnie, w ie lu członków tych rodzin pytało go, czy także mają gen w yw ołujący k rw o to k i m ózgowe. Niestety, m ógł im jedynie pow iedzieć, że muszą um rzeć, aby m ó g ł to stw ierdzić. W ostatnim zda
n iu swojej pracy m agisterskiej Apoplexie und ihre vererbung napisał, że dwa najważniejsze cele stojące przez naukow cam i zajm ującym i się badaniem tej choroby to znalezienie sposobu na je j zdiagnozow anie i zrozum ienie je j p a to fiz jo lo g ii, aby można było ją leczyć. O koło 40 la t później Gunnar
66
Gudm undsson zauważył, że k rw o to k i m ózgowe w tej chorobie pow odo
wane są przez zło g i am yloidow e, chemicznego charakteru depozytów nie można b yło jednak określić. W 1983 roku udało się wyekstrahować n ie w ielką ilość białka tworzącego złogi am yloidowe i oznaczyć sekwencję am i
nokw asow i jego krótkiego fragm entu. Była ona identyczna z fragm entem sekwencji cystatyny C, którą określiliśm y wcześniej, a badania im m unohisto- chemiczne potw ierdziły, że białkiem tym jest rzeczywiście cystatyna C. D a l
sze sekwencjonowanie wyekstrahowanego białka wykazało, że różni się ono jedną resztą am inokwasową - L 6 8 Q - od ustalonej wcześniej sekwencji cystatyny C. A b y określić, czy jest to m utacja pow odująca chorobę, czy ty lk o p o lim o rfiz m , opracow aliśm y opartą na PCR prostą m etodę analizy p o lim o rfizm u fragm entów restrykcyjnych, która m iała um ożliw ić zidenty
fikow anie obu w ariantów genów (a lle li). B yło to łatw e, ponieważ znaliśm y ju ż sekwencję kwasu nukleinow ego m R N A i gen dla cystatyny C. M utację L 6 8 Q w ykryto u wszystkich osób z krw otokam i m ózgow ym i w dotkniętych chorobą rodzinach. Po o ko ło 50 latach postępu chem icznego osiągnięty został zatem pierw szy cel wyznaczony przez A rniego Arnasona: 1 m ikro- lit r k rw i um ożliw ia identyfikację nosicieli genów skutkujących krw otokam i m ózgow ym i. M a to w ie lk i w pływ na kliniczne postępowanie z ty m i pacjen
ta m i, pozwalając m iędzy in n y m i na diagnozę prenatalną. P atofizjolog ia choroby nadal nie została jednak wyjaśniona.
Osiągnięcie tego celu jest ważne nie tylko dlatego, iż pozw oliłoby na opraco
wanie terapii dla stosunkowo niewielu islandzkich pacjentów z mutacją L68Q , ale rów nież dlatego, iż proces agregacji skudcujący powstawaniem wlókienek am yloidow ych może zachodzić rów nież w znacznie częściej występujących zaburzeniach o podłożu am yloidowym , na przykład w rodzinnej polineuro- patii am yloidowej, a także w chorobach Alzheimera i Parkinsona. Trójw ym ia
rowe struktury monomerycznej i dimerycznej cystatyny C nie tylko stanowiły poparcie dla hipotezy zamiany domen jako ważnego ogólnego mechanizmu tworzenia am yloidu, ale także um ożliw iły identyfikację ważnych oligom erów cystatyny C poprzedzających tworzenie wlókienek amyloidowych. Dalsze bada
nia z wykorzystaniem modelowania molekularnego, zaawansowanych metod fizykochemicznych, takich jak mikroskopia sił atomowych, małokątowe rozpra
szanie neutronów i dyfuzometryczny magnetyczny rezonans jądrowy, produkcja
o d m ia n cystatyny C o zwiększonej lub zmniejszonej tendencji do oligom ery- zacji oraz synteza pochodnych peptydylowych zakłócających oligomeryzację cystatyny C pozw oliły na szczegółowe wyjaśnienie procesu agregacji i opraco
wanie odczynników opóźniających lub powstrzymujących ten proces. Postęp ten nie byłby m ożliw y bez w iedzy i doświadczenia Macieja Kozaka, S ylw ii R odziew icz-M otow idło, Anety Szymańskiej, Roberta Kołodziejczyka i innych polskich naukowców z Gdańska i Poznania.
67
N aw et jeśli ma się konkretny plan badań - na przykład wyjaśnienie struk
tu ry i funkcji cystatyny C - zawsze pow inno się być otw artym na to, że osią
gnięte w y n ik i okażą się interesujące rów nież dla innych dziedzin nauki.
D la przykładu, kiedy postaw iliśm y hipotezę, że cystatyna C jest katabolizo- wana przez nerki poprzez wydzielanie przez filtrację kłębuszkową i późniejszą degradację w kom órkach kanalikow ych, badaliśm y pacjentów z obniżoną czynnością nerek (zmniejszoną szybkością filtra c ji kłębuszkowej), a w yn iki wykazały silną odw rotną korelację m iędzy poziom em cystatyny C w osoczu a szybkością filtra c ji kłębuszkowej, nie tylko potwierdzając naszą hipotezę, ale także wskazując, iż poziom cystatyny C w surowicy lub osoczu jest najlepszym wskaźnikiem funkcji nerek. Po pierwszej publikacji tego odkrycia w 1979 roku opublikow ano ponad 3500 prac podkreślających rolę cystatyny C w m o n i
torow aniu czynności nerek. W niektórych z tych badań ważną rolę odegrali polscy naukowcy, m iędzy innym i Joanna Pollak z C ollegium M edicum U n i
wersytetu M ikołaja Kopernika w Bydgoszczy. Wiedza o strukturze i znacznym rozmiarze cystatyny C pozw oliła niedawno na odkrycie nowego zaburzenia funkcjonowania nerek, określanego jako zespół zwężonych porów („Shrunken Porę Syndrome” ), w któ rym p o ry kłębuszkowe tracą zdolność filtro w a n ia dużych cząsteczek, takich jak cystatyna C, zachowując jednocześnie zdolność filtro w a n ia m ałych, takich jak kreatynina. Zespół zwężonych p o ró w oka
zał się częstym zaburzeniem powodującym w yjątkow o wysoką śmiertelność pacjentów. N a szczęście patofizjologia tego zaburzenia wydaje się um ożliwiać jego leczenie.
Ta długotrw ała i udana współpraca polsko-szwedzka - w którą zaangażo
wanych było o wiele więcej polskich naukowców niż tu wspomniano, a którzy w ym ienieni zostali w ponad 35 artykułach naukowych - prawdopodobnie nie byłaby m ożliw a, gdyby Z bigniew G rzonka nie zainicjow ał regularnych spotkań polsko-szwedzkich dotyczących om ów ionych tu tematów. Spotkania te zaczęto organizować w Gdańsku w 1996 roku i trw ają nadal; do tej pory odbyło się ich czternaście, na przem ian w Polsce i w Szwecji.
B IB L IO T E K A U N IW E R S Y T E C K A
G D A Ń S K
j
^—
< o
)—)N?
i i i J L
UNIWERSYTET GDAŃSKI ChemiallG