OCENA JAKOŚCI PREPARATÓW 1. Oznaczanie stężenia białka

Do określania stężenia białka stosowałem metodę Bradford [Bradford et al., 1976]. Do roztworu zawierającego 750 µl wody i 250 µl odczynnika Bradford dodałem 1 µl roztworu białka. Pomiar absorbancji wykonałem po upływie 10 min. (spektrofotometr UV-VIS, Hewlett Packard 8452A) przy długości fali 595 nm wobec próby kontrolnej zawierającej tylko odczynnik Bradford i wodę destylowaną. Stężenie białka odczytałem z krzywej wzorcowej, którą przygotowałem wykorzystując szereg rozcieńczeń roztworu albuminy wołowej (BSA) w zakresie stężeń 0-2mg/ml. Każdorazowo przeprowadzałem

- 61 -

trzy pomiary absorbancji, a średnią arytmetyczną wykorzystałem do obliczania stężenia badanego białka w roztworze.

W przypadku analizy zawartości białka przy dużej ilości prób stosowałem metodę pomiaru absorbancji w świetle ultrafioletowym (λ=280 nm). Teoretyczny współczynnik ekstynkcji molowej wyznaczony przez serwer ProtParam [Gasteiger, 2005] wynosi 27195 M^-1cm^-1.

4.3.2. Oznaczanie czystości białka

Do monitorowania przebiegu rozdziału białek na kolumnach chromatograficznych stosowałem metodę opartą na pomiarze absorbancji przy dwóch długościach fal 260 nm i 280 nm. Stosunek wartości absorpcji A260/A280 pozwalał wskazać frakcje białkowe wolne od nukleotydów (AMP) [Warburg i Christian, 1942; Glasel, 1995].

4.3.3. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym

Do analizy czystości białek wykorzystywałem elektroforezę w żelu

poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) prowadzoną w systemie buforów Laemmli [Laemmli, 1970]. Przed rozdziałem do każdej próbki dodałem 10 µl buforu SBL i inkubowałem ją 10 min. w temperaturze 80^oC. Elektroforezę prowadziłem w żelu o wymiarach 8,6/6,8/0,1cm w aparacie o układzie pionowym (Bio-Rad). Na żel zagęszczający nałożyłem odpowiednio przygotowane próbki oraz marker masy molekularnej. Pierwszą fazę rozdziału prowadziłem pod napięciem 80 V. Po przemigrowaniu próbki do części rozdzielającej zwiększałem napięcie do 160 V. Rozdział zakończyłem, gdy barwnik (błękit bromofenolowy) dotarł do końca żelu.

Żel barwiłem przez 30 min. w roztworze barwiącym, a następnie odbarwiłem wytrząsając

w roztworze odbarwiającym do czasu pokazania się prążków, po czym przepłukałem wodą destylowaną.

4.3.4. Oznaczanie aktywności enzymatycznej

Do monitorowania przebiegu izolacji FBPazy wykorzystywałem pomiar jej aktywności enzymatycznej. Pomiary wykonywałem na spektrofotometrze 8452A

(Hewlett-- 62 (Hewlett--

Packard) przy długości fali 340 nm [Traniello et al., 1972]. Polega ona na pomiarze szybkości redukcji NADP do NADPH. Redukcja katalizowana jest przez dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu (G6PDH). Reakcja redukcji jest sprzężona z reakcją katalizowaną przez FBPazę poprzez dodatek izomerazy glukozo-6-fosforanu, która przekształca produkt reakcji katalizowanej przez FBPazę, fruktozo-6-fosforan w glukozo-6-fosforan, który następnie jest przekształcany przez G6PDH w rybozylo-5-fosforan z jednoczesną redukcją NADP do NADPH.

Aktywność FBPazy oznaczyłem w objętości 1 ml w temperaturze 37^oC. Białko dodałem do mieszaniny reakcyjnej zawierającej 50 mM bufor BTP o pH 7,5, 2 mM MgCl₂, 150 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,2 mM NADP, 5 U/ml G6PDH, 5 U/ml G6PI i inkubowałem 5 min. Reakcja rozpoczyna się przez dodanie 0,1 µl 10 mM F-1,6-BP. W pomiarach wykorzystałem wartość współczynnika ekstynkcji dla NADP/NADPH A₃₄₀=6220 M^-1/cm^-1 [Segel, 1976].

4.4. KRYSTALIZACJA

Proces wyodrębniania białka z roztworu w postaci monokryształów przebiega podobnie jak krystalizacja małych związków organicznych lub nieorganicznych. Każdy układ rozpuszczalnik (bufor) - związek chemiczny (białko) ma pewne graniczne stężenie, zwane stężeniem nasycenia, od którego rozpoczyna się krystalizacja. Pierwszym etapem krystalizacji jest tworzenie mikroskopijnych zarodków przyszłych monokryształów (nukleacja). W kolejnej fazie następuje wzrost pojedynczych kryształów (propagacja krystalizacji). Niepożądanym zjawiskiem każdej krystalizacji jest zlepianie się pojedynczych kryształów w większe struktury, tzw. zrosty. Przy odpowiednim doborze metody oraz warunków krystalizacji możliwe jest zatrzymanie jej na etapie wzrostu kilku dobrze utworzonych kryształów, dzięki czemu uzyskuje się monokryształy nadające się do badań dyfrakcyjnych.

Do otrzymania kryształów wykorzystywałem metodę dyfuzji par, której podstawą jest dążenie układu zamkniętego do osiągnięcia stanu równowagi. W metodzie tej nad zbiornik wypełniony roztworem czynnika strącającego umieszcza się kroplę roztworu białka. Kropla utworzona jest z roztworu białka o określonym stężeniu zmieszanego z roztworem strącającym w określonym stosunku. W wyniku mieszania kropli, stężenia roztworu krystalizacyjnego oraz białka maleją. Dyfuzja składników lotnych w obrębie układu prowadzi do wyrównania stężeń czynników strącających w obu roztworach, a przez

- 63 -

to do zatężenia białka do stanu przesycenia i w efekcie do jego krystalizacji lub wytrącenia w postaci osadu.

Poszukiwanie wstępnych warunków krystalizacji prowadziłem w układzie kropli siedzącej z wykorzystaniem robota krystalizacyjnego Gryphon (ARI) z płytkami 96 dołkowymi (ARI) uszczelnionymi taśmą Crystal Clear (HR). Roztwory krystalizacyjne pochodziły z komercyjnych zestawów odczynników krystalizacyjnych (Hampton Research, Molecular Dimensions Ltd). Do krystalizacji używałem białko w dwóch różnych stężeniach, 6 mg/ml i 12mg/ml. Do każdego rezerwuaru dodawałem 60 µl odpowiedniego roztworu. Całkowita objętość kropli wynosiła 0,9µl. Roztwór białka mieszałem z roztworem krystalizacyjnym w trzech stosunkach: 2:1, 1:1 i 1:2. Krystalizację prowadziłem w temperaturze 19^oC.

Optymalizację wstępnych warunków krystalizacji prowadziłem w temperaturze 19^oC w układzie kropli wiszącej stosując płytki 24 dołkowe (HR), których brzegi pokryłem smarem silikonowym w celu uszczelnienia układu po nałożeniu szkiełka nakrywkowego. Do każdego rezerwuaru dodawałem 1 ml odpowiedniego roztworu krystalizacyjnego, a na szkiełko nakrywkowe nakładałem roztwór białka zmieszany z roztworem krystalizacyjnym w trzech stosunkach: 2:1, 1:1 i 1:2. Objętość każdej kropli wynosiła 3µl. Optymalizacja krystalizacji miała na celu otrzymanie większej liczby kryształów o wymiarach wystarczających do pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej.