POMIARY DYFRAKCYJNE I OBRÓBKA DANYCH

Do określenia struktury przestrzennej białka wykorzystuje się zjawisko dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego na krysztale. W porównaniu z kryształami małych cząsteczek, kryształy białka charakteryzują się mniejszym stopniem upakowania, dużą zawartością cząsteczek wody (ok. 50% objętości kryształu), a ich rozmiary nie przekraczają 0,5 mm. Z tego względu do ich badania stosuje się zwykle promieniowanie o wysokiej intensywności, które uzyskuje się w synchrotronach. W przeciwieństwie do dwóch długości fali dostępnych w laboratoryjnych generatorach rentgenowskich, w synchrotronie uzyskuje się promieniowanie o szerokim zakresie długości fal, co ma ogromne znaczenie przy pomiarach metodą dostrajanej dyfrakcji anomalnej (MAD).

Rejestracja refleksów powstałych w wyniku rozproszenia promieniowania rentgenowskiego na elektronach atomów białka w krysztale odbywa się na półprzewodnikowych detektorach CCD lub na krzemowych detektorach pikselowych.

- 64 -

Pomiary dyfrakcyjne prowadzi się zwykle w temperaturze 100 K (-173^oC), wykorzystując do jej utrzymania strumień par azotu. Dzięki temu przedłużamy żywotność kryształów białkowych oraz poprawiamy ich jakość. Efektem niepożądanym, towarzyszącym witryfikacji kryształów białka może być powstawanie kryształów wody lub składników buforu obecnych w krysztale. Aby zapobiec takiej sytuacji, stosuje się krioprotektanty. Substancje te oddziałują z cząsteczkami wody i zapobiegają jej zamarzaniu. Do najpopularniejszych krioprotektantów należą glicerol, glikol etylenowy, PEG400 i MPD [Garman i Owen, 2006].

Przed pomiarem dyfrakcji kryształ zawiesza się w nylonowej pętelce, którą umieszcza się na główce goniometrycznej. Goniometr umożliwia obrót kryształu o 360^o dookoła osi prostopadłej do wiązki promieniowania i zapewnia stabilną pozycję kryształu podczas pomiaru.

Pomiar wykonujemy, naświetlając kryształ wiązką promieni rentgenowskich przez określoną ilość czasu. Podczas naświetlania kryształ wykonuje obrót o określony kąt. Podczas obrotu wiązka pierwotna zostaje częściowo ugięta na sieci przestrzennej kryształu, w efekcie czego uzyskujemy zwykle wiele tysięcy promieni dyfrakcyjnych zwanych refleksami. Celem pomiaru jest zarejestrowanie wszystkich niezależnych refleksów przynajmniej raz, a w szczególnych przypadkach z jak największą liczbą powtórzeń. W celu określenia strategii pomiarów najpierw rejestruje się serię kilku obrazów dyfrakcyjnych, zmieniając kąt obrotu kryształu. Najczęściej rejestruje się dwa obrazy przy kącie obrotu 0^o i 90^o. Pozwala to określić jakość kryształu, jak również poszczególnych refleksów. Na podstawie uzyskanych w ten sposób informacji można określić niektóre parametry pomiaru takie jak: optymalny czas naświetlania pojedynczego obrazu, kąt obrotu przypadający na pojedynczy obraz oraz odległość detektora od kryształu. Przy użyciu programów do analizy obrazów dyfrakcyjnych takich jak Mosflm [Leslie i Powell, 2007], na podstawie dwóch obrazów dyfrakcyjnych można określić parametry komórki elementarnej oraz optymalny kąt obrotu kryształu dla zarejestrowania najlepszego i kompletnego zestawu refleksów niezależnych. Pomiar dyfrakcji kryształu stanowi ostatni etap doświadczalny w krystalografii, dlatego ważne jest, by został przeprowadzony poprawnie i dokładnie.

Obrazy dyfrakcyjne są następnie przetwarzane na zbiór czynników struktury. Do tego celu wykorzystuje się programy: HKL [Otwinowski i Minor, 1997] lub XDS [Kabsch, 2010]. Podczas przetwarzania danych dyfrakcyjnych ustalana jest grupa

- 65 -

przestrzenna i parametry komórki elementarnej oraz zostają wyszukane refleksy o największej intensywności (I). Następnie program wykonuje wskaźnikowanie polegające na przypisaniu do każdego refleksu wskaźnika h, k, l. Kolejny etap polega na udokładnieniu parametrów układu pomiarowego, m.in. odległości kryształ-detektor czy pozycji wiązki. Równocześnie przeprowadza się integrację refleksów oraz koryguje intensywność tła w otoczeniu każdego refleksu. Integracja przeprowadzana jest dla każdego obrazu dyfrakcyjnego oddzielnie. Końcowym etapem integracji jest przypisanie do każdego obrazu czynnika skali opisującego zmiany rozpraszania w trakcie pomiaru. Ostatnim etapem przetwarzania danych jest skalowanie. W poprzednim etapie każdy obraz dyfrakcyjny został zamieniony w plik zawierający listę refleksów wraz z ich intensywnościami. Podczas skalowania wszystkie pliki łączy się w jeden zbiór i ponownie udokładnia parametry sieci i orientację kryształu. Za pomocą programu XDSCONV wchodzącego w skład pakietu XDS [Kabsch, 2010] zbiór intensywności refleksów (I) zostaje zamieniony na zbiór czynników struktury (|F|). Z całkowitego zbioru refleksów na tym etapie wyłączona zostaje grupa ok. 1000 refleksów, która służy w kolejnych etapach do obliczania wskaźnika R_free [Kleywegt i Jones, 1997].

Na zakończenie wykonuje się analizę statystyczną dla oceny jakości uzyskanego zbioru refleksów. Sprawdzamy m.in. kompletność danych, czyli ilość refleksów zarejestrowanych w stosunku do ilości teoretycznej dla danej rozdzielczości. Kolejny istotny parametr to wskaźnik rozbieżności Rmerge oraz stosunek intensywności refleksu do intensywności tła <I/σ(I)>. Wskaźnik rozbieżności określa różnicę między symetrycznymi refleksami. Niekiedy istotna okazuje się również liczba obserwacji refleksów niezależnych. Parametr ten otrzymujemy ze stosunku całkowitej liczby refleksów do ilości refleksów niezależnych i określamy go jako krotność lub redundancję. Należy pamiętać, że wszystkie parametry analizujemy w odniesieniu do całego zbioru danych, jak również do zakresu o najwyższej rozdzielczości.

Wszystkie pomiary dyfrakcyjne przeprowadziłem z wykorzystaniem trzech linii pomiarowych synchrotronu BESSY II w Berlinie, należącego do Helmholtz-Zentrum Berlin (Tabela 12).

- 66 -

Tabela 12. Biokrystalograficzne linie pomiarowe synchrotronu BESSY II

Numer linii Zakres długości fali [Å] Detektor

14.1 2,25 - 0,8 Rayonix MX-225

14.2 2,25 - 0,8 Rayonix MX-225

14.3 0,89 Rayonix SX-165

Przed rozpoczęciem pomiarów kryształy były witrifikowane. W tym celu przenosiłem je do kropli roztworu rezerwuarowego (różny dla każdego kryształu) zawierającej odpowiednią ilość krioprotektanta. Po kilku sekundach nasączania kryształ umieszczałem w strumieniu par azotu. Dane dyfrakcyjne rejestrowałem na detektorach CCD. Strategię zbierania danych ustalałem za pomocą programu Mosflm [Leslie i Powell, 2007]. Do obróbki danych stosowałem program XDSAPP [Krug et al., 2012], stanowiący nakładkę graficzną na program XDS [Kabsch, 2010].