Ocena przydatności metody TXRF do analizy płynów ustrojowych

7.2.1

.

Metoda całkowitego odbicia promieniowania X została zastosowana do analizy płynu mózgowo – rdzeniowego oraz osocza pochodzących od osób chorych na stwardnienie boczne zanikowe – (Amiotrophic Lateral Sclerosis – ALS). ALS jest jedną z chorób neurodegeneracyjnych o nieznanej etiologii. Choroba atakuje nerwy motoryczne centralnego układu nerwowego powodując ich stopniowy zanik, co w konsekwencji prowadzi do całkowitego paraliżu oraz nieuchronnej śmierci, zazwyczaj w ciągu około trzech lat od wystąpienia pierwszych objawów. Najczęściej choroba rozpoczyna się między 50 a 70 rokiem życia. W związku z tym, że schorzenie jest rozpoznawane najczęściej w momencie zaistnienia ewidentnych objawów neurologicznych związanych z daleko posuniętą degeneracją neuronów motorycznych takich jak: problemy z mową, utrudnione przełykanie, spastyczność lub drżenie, poszukuje się ewentualnych odstępstw od normy w badaniach laboratoryjnych (tj. markerów biochemicznych choroby), pomocnych w zdiagnozowaniu wczesnego stadium - nawet przed wystąpieniem objawów klinicznych.

Analiza składu pierwiastkowego jest badaniem pomocniczym mogącym wykazać odstępstwa od normy w płynach ustrojowych. Pierwiastki które mogą brać udział w procesie chorobowym, to przede wszystkim miedź i cynk. Są one składnikami enzymów odpowiedzialnych za wiele procesów metabolicznych, między innymi oksydaz biorących udział w procesach utleniania i redukcji w komórkach. Cynk i miedź występują w oksydazie

35 ponadtlenkowej (Cu/Zn SOD1) - enzymie odpowiedzialnym za neutralizację wolnych rodników tlenowych. Dezaktywacja enzymów unieszkodliwiających nadtlenki i wolne rodniki tlenowe może być przyczyną oksydacyjnych uszkodzeń składników komórek. Zaburzenia funkcjonowania tego enzymu obserwowano w genetycznej formie stwardnienia bocznego zanikowego. Dodatkowo metale te mogą mieć wpływ na procesy neurodegeneracyjne poprzez tworzenie nieprawidłowych form białkowych. Cynk jest również niezbędny w procesie syntezy kwasów nukleinowych, insuliny i różnego rodzaju białek. Z uwagi na fakt, że organizmy ludzi i zwierząt pozbawione są możliwości magazynowania cynku, objawy związane z niedoborem tego pierwiastka pojawiają się bardzo szybko.

Płyn mózgowo-rdzeniowy jest bezbarwnym, przezroczystym płynem o składzie podobnym do składu osocza krwi. Wytwarzany jest w splotach naczyniówkowych i w wyściółce układu komorowego mózgu. Jego ilość wynosi około 140 ml, natomiast organizm produkuje ponad 500 ml płynu w ciągu doby, co oznacza jego czterokrotna wymianę w ciągu 24 godzin. Płyn krąży w mózgu i rdzeniu kręgowym i jest wchłaniany w układzie żylnym mózgowia. Jego podstawową funkcją jest transport związków chemicznych do mózgu oraz jego ochrona. Dzięki barierze krew-mózg stężenie pierwiastków w PMR jest stałe i powinno być niezależne od przyjmowanych leków, diety, jak również od stężenia pierwiastków w osoczu.

Celem badań była przede wszystkim ocena przydatności metody TXRF do bezpośrednich pomiarów stężeń pierwiastków w płynach ustrojowych, co może być przydatne w procesie diagnostycznym. Praca była realizowana we współpracy z Kliniką Neurologii Collegium Medicum UJ (dr B. Tomik, dr D. Adamek).

7.2.2. Przedmiot badań

Badane próbki płynu mózgowo rdzeniowego oraz osocza były pobierane podczas rutynowych badań neurologicznych (nakłucie lędźwiowe). Próbki pochodziły od osób ze zdiagnozowanym stwardnieniem bocznym zanikowym oraz od grupy kontrolnej. Osocze pobrano od 27 pacjentów chorych na ze zdiagnozowanym ALS i 17 z grupy kontrolnej. W grupie chorych było 14 kobiet i 13 mężczyzn, średni wiek wynosił 57± 8.9 lat a w grupie kontrolnej było 11 kobiet i 6 mężczyzn (średni wiek 54 ± 7.6 lat). Średni czas trwania choroby to 27 ± 3.2 miesięcy. Grupa kontrolna składała się z 9 pacjentów z negatywną diagnozą krwawienia podpajęczynówkowego, 5 guzem rdzenia kręgowego oraz 3 z polineuropatią. Płyn mózgowo-rdzeniowy pochodził od 25 osób ze zdiagnozowanym ALS i

36 15 pacjentów z grupy kontrolnej. Z uwagi na fakt że pobieranie płynu mózgowo- rdzeniowego nie należy do badań często wykonywanych, w tego typu badaniach za grupę kontrolną uważa się osoby chore na inne schorzenia neurologiczne. W grupie nie-ALS było 5 osób ze stwardnieniem rozsianym, 6 z dyskopatią, 3 z neuropatią i 1 z chorobą tkanki łącznej. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego od razu po pobraniu były zamrażane w naczyniach z polipropylenu. Rozmrażano je bezpośrednio przed przygotowaniem do pomiarów. Próbki nie były mineralizowane ze względu na potrzebę oznaczenia bromu i chloru, które zostałyby utlenione w czasie rozkładu do form lotnych, oraz z powodu niewielkich ilości dostępnych materiałów (poniżej 100 mikrolitrów), co wynikało z procedury pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego. Bezpośrednia analiza jest prostsza, szybsza i zapobiega ewentualnemu zanieczyszczeniu próbek w procesie preparatyki, aczkolwiek granice wykrywalności dla próbek mineralizowanych są niższe. Porównanie widm osocza zmineralizowanego i rozcieńczonego przedstawia rysunek 12.

Rys.12 Porównanie widm osocza ludzkiego: próbki zmineralizowanej i rozcieńczanej wodą destylowaną 0 2000 4000 6000 8000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 lic zb a z lic ze ń energia [keV] rozcieńczenie mineralizacja Fe ^{Cu Zn}

37 7.2.3. Pomiary i przygotowanie próbek

Pomiary pierwiastków lekkich sodu i magnezu w płynie mózgowo- rdzeniowym i osoczu wykonano w Instytucie Atomowym w Wiedniu. Pierwiastki te były analizowane z zastosowaniem komory próżniowej, lampy rentgenowskiej z anoda chromową oraz detektora Si/Li z ultracienkim okienkiem. Warunki pomiarowe: 30kV/30mA, czas pomiaru wynosił 300s. Pomiary pozostałych pierwiastków wykonano na spektrometrze z lampa molibdenową w Krakowie. Warunki pomiarowe to 55kV, 40 mA. Czas pojedynczego pomiaru wynosił 1000 s.

Ze względu na niewielkie ilości (poniżej 0,5 ml) obu płynów podjęto próbę analizy bezpośredniej z pominięciem procesu mineralizacji. Analiza bezpośrednia jest szybsza a w przypadku płynów o niskich stężeniach zapobiega ewentualnym zanieczyszczeniom lub stratom pierwiastków śladowych w trakcie przygotowania próbek, dodatkowo próbki nie ulegają rozcieńczeniu. Z drugiej strony obecność lekkich pierwiastków może wpływać niekorzystnie na kształt widma (podwyższone tło) ze względu na promieniowanie rozproszone.

Osocze

Do 100 µl osocza dodawano 30µl wody dejonizowanej. Standardem wewnętrznym był gal w stężeniu końcowym 1mg/l.

Płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR)

Płyn mózgowo-rdzeniowy charakteryzuje się około dziesięciokrotnie niższymi zawartościami miedzi i cynku niż osocze, przy stosunkowo wysokim stężeniu chlorków. Z tego względu próbki nie były rozcieńczane, natomiast podjęto próbę uproszczonej mineralizacji dokonywanej bezpośrednio na szkiełku pomiarowym. Dodatek kropli (2 µl) kwasu azotowego klasy Suprapur rozcieńczonego wodą w stosunku 1:1 powodował eliminację dużej części chloru. Kwas azotowy jako silny utleniacz sprawiał, że większa część chloru obecnego w próbce ulegała utlenieniu do wolnego chloru i w tej postaci była usuwana w czasie suszenia. Preparatyka ta wpływała na poprawę kształtu widma i obniżenie granic wykrywalności. Standarem wewnętrznym był gal (1mg/dm3

). Każdorazowe nakropienie było mierzone dwukrotnie – raz dla oznaczenia chloru, a następnie po jego usunięciu.

38

Pierwiastki lekkie w płynie mózgowo- rdzeniowym i osoczu.

Przed pomiarem próbki były jedynie rozcieńczane wodą podwójnie destylowaną (100 µl próbki + 40µl wody). Podobnie jak w przypadku PMR w czasie pomiarów w powietrzu z wysuszonej próbki usuwano chlor za pomocą kwasu azotowego. Standardem wewnętrznym był skand (40 mg/l).

Dokładność analizy zweryfikowano za pomocą pomiaru materiału odniesienia – serum MIO 181 a wyniki pokazano w tabeli 2.

Tabela 2. Wyniki analizy materiału odniesienia Serum Mio 181.

pierwiastek Osocze SRM MIO 181 certyfikowane stężenie i

niepewność

TXRF

Zmierzone stężenie , średnia i niepewność [mg/l] K _{150; 146; 147; 135 – 163 140; 150; 145 145,0 (2,4)} Ca _{108; 103; 104; 97 – 116 112; 102; 124 112,0 (5,0)} Fe _{1.27; 1.25 1.15 - 1.35 1,35; 1,39; 1,28 1,340 (0,045)} Cu _{1.18; 1.22; 1.19 1.09 - 1.29 1,25; 1,18; 1,18 1,203 (0,033)} Zn _{1.33; 1.30; 1.23 – 1.43 1,31; 1,36; 1,31 1,327 (0,013)}

W tabeli 3 przedstawiono granice wykrywalności dla płynu mózgowo- rdzeniowego mierzonego bezpośrednio oraz po zastosowaniu kwasu azotowego. Największy wpływ na polepszenie tego parametru zaobserwowano dla potasu (46%) i wapnia (45%) oraz około 30% dla miedzi i cynku. Poprawa granic wykrywalności ma miejsce przede wszystkim ze względu na redukcję tła spowodowaną niższą zawartością chloru. Na rysunku 13 przedstawiono widma płynu mózgowo-rdzeniowego mierzonego bezpośrednio oraz po zastosowaniu kwasu azotowego. Widoczne obniżenie tła spowodowane jest przede wszystkim niższym stężeniem chloru.

39 Tabela 3. Granice wykrywalności oznaczanych pierwiastków w płynach ustrojowych – PMR i osoczu. Pierwiastek [mg/dm³] Na Mg K Ca Fe Cu Zn PMR bezpośrednio ^{0,28 0,20 0.027 0,023 0,020} PMR/HNO3 3,9* 1,6* 0,15 0,11 0,019 0,016 0,015 osocze/ TXRF 21,7* 5,5* 1,7 1,0 0,21 0,27 0,23 * oznaczenie w próżni

Rys. 13. Porównanie widma osocza ludzkiego mierzonego bezpośrednio i po usunięciu chloru za pomocą kwasu azotowego.

40 W tabelach 4 i 5 przedstawiono średnie wartości stężenia pierwiastków uzyskane dla osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego pobranych od osób chorych na ALS i grupy kontrolnej oraz wartości testu t.

Tabela 4. Średnie stężenia pierwiastków w płynie mózgowo rdzeniowym u osób chorych na ALS i u grupy kontrolnej. Każdy wynik jest średnią z trzechpojedynczych oznaczeń.

pierwiastek średnia ALS Odch. standardowe . średnia kontrola Odch. standardowe Wartość testu t tablicowa Wartość testu t obliczona Na [mg/ dm³] 2100 75 2610 126 2,024 -3,683 Mg [mg/dm³] 12,8 0,7 15,1 0,8 2,024 -1,960 Cl [mg/ dm³] 5360 470 6550 940 2,024 -1,272 K [mg/ dm³] 97 6 90 7 2,024 0,825 Ca [mg/ dm³] 41 3 46 4 2,024 -0,964 Fe [µg/ dm³] 580 30 660 40 2,024 -1,408 Cu [µg/ dm³] 58 5 78,5 8 2,024 -2,451 Zn [µg/ dm³] 106 6 102 10 2,024 0,338 Br [mg/ dm³] 680 50 703 80 2,024 -0,188

41 Tabela 5. Średnie stężenia pierwiastków w osoczu u osób chorych na ALS i u grupy kontrolnej. Każdy wynik jest średnią z trzech pojedynczych oznaczeń.

Pierwiastek średnia ALS Odch. standardowe średnia kontrola Odch. standardowe Wartość testu t tablicowa Wartość testu t obliczona Na [mg/l] 1980 100 2020 130 2,018 -0,216 Mg [ppm] 28 1,5 30 2,4 2,018 -0,751 Cl [ppm] 4000 100 4500 100 2,018 -2,025 K [ppm] 143 6 143 5 2,018 0,002 Ca [ppm] 90 2,2 87 2 2,018 1,178 Cr [ppm] 0,9 0,03 0,85 0,07 2,018 0,735 Fe [ppm] 4 0,3 4,9 0,7 2,018 -1,341 Cu [ppm] 1,5 0,07 1,5 0,08 2,018 -0,570 Zn [ppm] 1,1 0,05 1,3 0,06 2,018 -1,891 Br [ppm] 2,6 0,3 2,4 0,2 2,018 0,510

Żelazo w osoczu zostało prawidłowo oznaczone, o czym świadczą wyniki analizy materiału odniesienia. Jego podwyższona wartość w stosunku do normy wynika z zanieczyszczenia próbki osocza krwią.

7.2.4. Podsumowanie

Statystyczną istotność różnic w składzie pierwiastkowym PMR i osocza pomiędzy dwoma populacjami zbadano wykorzystując test t studenta. Uzyskane wyniki wykazały, że jedynie miedź jest pierwiastkiem, którego stężenie w PMR osób chorych na ALS jest istotnie różne niż w grupie kontrolnej. Prawdopodobnie jest to spowodowane niezbyt wielka ilością danych przebadanych pacjentów jednak zachorowania na ALS w Polsce są na tyle nieliczne, że trudno jest uzyskać materiał badawczy reprezentujący dużą populację chorych. Z drugiej strony badania te są czasochłonne i trudno by było przebadać wiele dziesiątków chorych. Przy interpretacji wyników należy również wziąć pod uwagę fakt ze osoby z grupy kontrolnej nie

42 należą do osób zdrowych, a jedynie chorych na inne choroby neurologiczne niż stwardnienie boczne zanikowe.

W grupie ALS stwierdzono, że stężenie miedzi w płynie mózgowo-rdzeniowym jest niższe niż stężenie u grupy kontrolnej, natomiast nie stwierdzono różnic pomiędzy grupami w zawartości miedzi, ani cynku w osoczu. Stwierdzono również nieco niższą zawartość sodu w grupie ALS.

Reasumując, można wyciągnąć wnioski, że aczkolwiek metoda TXRF nadaje się do badań płynów ustrojowych, a szczególnie osocza, to w przypadku badań nad ALS trudno o wnioski dotyczące biochemii choroby. Prawdopodobnie, różnic należy szukać na poziomie zaburzeń komórkowym lub np. w zmianach stopni utlenienia poszczególnych pierwiastków, natomiast skład podstawowych płynów ustrojowych nie wnosi istotnych informacji.

Różnic pomiędzy oboma populacjami nie znaleziono również po zastosowaniu analizy klastrowej. Opracowania sposobu przygotowaniu próbek zostało jednak wykorzystane do analizy płynów ustrojowych w innych zagadnieniach medycznych i biochemicznych.

43

7.3. Zastosowanie TXRF do badania składu pierwiastkowego roślin. Ocena