Index of /rozprawy2/10312

Pełen tekst

(1)Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej. Praca doktorska Beata Ostachowicz. Zastosowanie zjawiska całkowitego odbicia promieniowania X w rentgenowskiej analizie fluorescencyjnej. Promotor: prof. dr hab. Marek Lankosz Kraków, czerwiec 2010.

(2) Oświadczenie autora rozprawy: Oświadczam, świadoma odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że niniejszą pracę doktorską wykonałam osobiście i samodzielnie i że nie korzystałam ze źródeł innych niż wymienione w pracy. data, podpis autora. Oświadczenie promotora rozprawy: Niniejsza rozprawa jest gotowa do oceny przez recenzentów. data, podpis promotora rozprawy. 2.

(3) Dziękuję Władzom Dziekańskim Wydziału Fizyki i Informatyki Stosowanej AGH za umożliwienie wykonania tej pracy. Promotorowi, Panu profesorowi Markowi Lankoszowi dziękuję za poświęcony czas, pomoc i wartościowe uwagi. Dziękuję wszystkim, którzy powierzyli mi cenny materiał analityczny umożliwiając pracę z różnorodnymi próbkami. Mojej rodzinie dziękuję za wsparcie przez okres pisania pracy.. 3.

(4) Spis treści 1. Wstęp...................................................................................................................................... 5 2. Rys historyczny ...................................................................................................................... 6 3. Podstawy fizyczne .................................................................................................................. 9 4. Aparatura pomiarowa stosowana w metodzie TXRF ........................................................... 11 4.1. Układ optyczny stosowany w spektrometrach TXRF............................................11 4.2. Spektrometry wykorzystywane w metodzie TXRF .............................................. 14 4.3. Spektrometr użytkowany w Katedrze Fizyki Medycznej i Biofizyki ................... 15 5. Analiza ilościowa ................................................................................................................. 18 5.1. Przygotowanie próbek ........................................................................................... 20 5.2. Reflektory .............................................................................................................. 23 6. Studia literaturowe dotyczące zastosowan metody TXRF ................................................... 25 6.1. Zastosowanie metody TXRF w przemyśle elektronicznym. ................................. 25 6.2. Zastosowanie metody TXRF do analizy jakościowej i ilościowej próbek biologicznych i środowiskowych. ................................................................................ 26 6.3. Zastosowanie metody TXRF w archeometrii. ....................................................... 28 7. Wyniki badań prowadzonych metodą TXRF w Katedrze Fizyki Medycznej i Biofizyki ... 30 7.1. Analiza wód naturalnych …………………………………………………………31 7.2. Ocena przydatności metody TXRF do analizy płynów ustrojowych…………….34 7.3. Zastosowanie TXRF do badania składu pierwiastkowego roślin. Ocena wpływu mikoryzy na przyswajalność metali u roślin hałdowych. ............................................. 43 7.4. Ocena możliwości zastosowania metody TXRF do analizy srebrnych monet...... 61 8. Podsumowanie...................................................................................................................... 71 9. Literatura………………..………………………………………………………………….73. 4.

(5) 1.. WSTĘP Kilkanaście ostatnich lat przyniosło ogromny postęp w dziedzinie analityki. Postęp ten. skierowany jest przede wszystkim w kierunku doskonalenia metod pod kątem osiągania coraz to niższych granic wykrywalności, przy zachowaniu szybkości analizy, jej wszechstronności oraz stosunkowo niskiej ceny. Postępuje automatyzacja pomiarów, metody obliczeniowe stają się coraz doskonalsze. Z drugiej strony obserwuje się tendencje do miniaturyzacji próbek i uproszczenia metod ich przygotowania. Pomimo rozwoju metod badawczych i możliwości oznaczania zarówno związków chemicznych, jak i stopni utlenienia w mikroobszarach, analiza pierwiastkowa całości materiału jest wciąż niezbędna. W dobie postępującego zanieczyszczenia środowiska i równoczesnego dążenia do ograniczania ilości toksycznych pierwiastków w środowisku i przedmiotach codziennego użytku konieczna jest kontrola składu pierwiastkowego coraz to nowych materiałów, produktów, odczynników chemicznych, czy też środków spożywczych, w tym wody. Fluorescencja rentgenowska jest znaną od wielu lat metodą analityczną powszechnie stosowaną w wielu dziedzinach od przemysłu, poprzez ochronę środowiska czy też kryminalistykę, po analizę dzieł sztuki. Metoda całkowitego odbicia promieniowania rentgenowskiego (Total Reflection X-Ray Fluorescence – TXRF) choć opiera się na tych samych zasadach fizycznych i analizie promieniowania charakterystycznego oferuje nowe możliwości analityczne. Do jej podstawowych zalet należy zaliczyć niższe granice wykrywalności, możliwość bezpośredniego pomiaru próbek ciekłych oraz niewielkie masy próbek. O ile w przemyśle elektronicznym metoda TXRF stała się rutynową metodą kontroli jakości to jej możliwości analityczne pozostają ciągle niedoceniane. Celem niniejszej pracy jest zaprezentowanie możliwości analitycznych tej metody, przede wszystkim w odniesieniu do różnych próbek pochodzenia środowiskowego i biologicznego.. 5.

(6) 2.. RYS HISTORYCZNY Od odkrycia przez W. Rentgena w 1895 roku, promieniowanie X, zwane również. rentgenowskim, znalazło wiele zastosowań w różnych dziedzinach nauki takich jak medycyna czy też analiza instrumentalna. Promieniowanie to, jest niewidocznym promieniowaniem elektromagnetycznym o długości fali od ok. 0,005 do 10 nm. Rozchodzi się po liniach prostych i ulega takim zjawiskom fizycznym jak odbicie, polaryzacja czy dyfrakcja. Od lat czterdziestych ubiegłego wieku prowadzone są prace nad jego wykorzystaniem do celów analitycznych. Metodą analityczną wykorzystującą promieniowanie X jest rentgenowska analiza fluorescencyjna. Opiera się ona na wzbudzeniu promieniowania charakterystycznego danego pierwiastka, następującym po naświetleniu badanej próbki promieniowaniem pierwotnym pochodzącym z lampy rentgenowskiej, izotopu promieniotwórczego lub coraz częściej stosowanego ostatnio synchrotronu. Naświetlenie powoduje przejście atomów w stan wzbudzony, a powrotowi do stanu podstawowego towarzyszy emisja specyficznego dla każdego pierwiastka promieniowania, zależnego od wewnętrznej struktury powłok elektronowych, zwanego promieniowaniem charakterystycznym. Od kilkudziesięciu lat fluorescencja rentgenowska jest stosowana do analizy składu pierwiastkowego różnego rodzaju próbek środowiskowych, geologicznych i biologicznych takich jak gleby, osady, rośliny, pyły powietrza, żywność oraz różnego rodzaju obiekty archeologiczne i historyczne. Przy szerokim spektrum zastosowań analitycznych poważnym ograniczeniem tzw. klasycznej fluorescencji rentgenowskiej była bezpośrednia analiza próbek ciekłych. Jest ona utrudniona ze względu na wysokie tło spowodowane rozproszeniem promieniowania wzbudzającego na cząsteczkach wody oraz niewielką głębokość penetracji promieniowania rentgenowskiego w próbce. Do lat osiemdziesiątych próbki analizowane były głownie w postaci proszków lub pastylek. Wymagało to starannego mielenia próbek, oraz pracochłonnego przygotowania pastylek. Były to najczęściej próbki o masach pośrednich wymagające korekty efektów matrycy. Z kolei pierwiastki śladowe z roztworów były wydzielane chemicznie w postaci osadów tworzących cienkie próbki na filtrach. Stosowano różne selektywne i nieselektywne metody wzbogacania i wydzielania, wiązało się to z jednak z koniecznością opracowywania wielu różnych metod chemicznego przygotowania próbki. Rozwiązaniem tych trudności umożliwiającym rozszerzenie stosowania fluorescencji rentgenowskiej również do analizy próbek ciekłych jest zaproponowana w 1971 roku przez japońskich naukowców Yonedę i Horiuchiego metoda całkowitego odbicia promieniowania X 6.

(7) (Total Reflection X-ray Fluorescence – TXRF) [1]. Chociaż zjawisko całkowitego odbicia tego promieniowania zostało odkryte w 1923 roku przez Comptona, to przez blisko 50 lat nie znaleziono dla niego praktycznego zastosowania w analityce. Yoneda i Horiuchi zaproponowali analizę niewielkiej ilości materiału osadzonego na optycznie gładkiej powierzchni. Pomimo, że zarówno XRF jak i TXRF wykorzystują lampę rentgenowską jako źródło promieniowania wzbudzającego, obie techniki różnią się znacząco geometrią pomiarową. Przekrój wiązki stosowanej w XRF ma charakter owalny, a w TXRF płaski. TXRF wymaga również innego położenia próbki względem wiązki promieniowania wzbudzającego. W dotychczas używanych spektrometrach fluorescencyjnych stosowano zazwyczaj tzw. geometrię 45º/45º - kąt między promieniowaniem wzbudzającym, a próbką wynosił 45º , podobnie jak kąt pomiędzy próbką a detektorem.. W tego rodzaju geometrii pomiarowej do detektora docierało nie tylko promieniowanie charakterystyczne pierwiastków próbki, ale też promieniowanie rozproszone. Powodowało to istotny wzrost natężenia promieniowania tła, na które nakładają się linie promieniowania charakterystycznego. W metodzie TXRF promieniowanie wzbudzające materiał próbki ślizga się po niej pod katem połysku mniejszym od około 0,1º. Promieniowanie pierwotne jest modyfikowane poprzez układy optyczne zanim dotrze do próbki. Dzięki temu docierające do detektora promieniowanie w przeważającej części składa się z promieniowania charakterystycznego. Zminimalizowane tło przyczynia się do znaczącego obniżenia granic wykrywalności. Pozostałe elementy aparatury pomiarowej – takie jak: źródła promieniowania (poza radioizotopami) czy też detektory są takie same jak w metodzie XRF. Inne są sposoby przygotowania próbek, kalibracja, oraz metoda obliczeniowa stosowana w analizie ilościowej. Pod względem przygotowania próbek, oraz możliwości analitycznych technika TXRF wydaje się być bardziej podobna do metod spektroskopowych takich na przykład, jak ogromnie popularna absorpcja atomowa. Na rysunku 1 w sposób uproszczony pokazano różnice w geometrii pomiarowej pomiędzy EDXRF a TXRF. Zaprezentowana geometria TXRF jest jednym z możliwych wariantów (stosowanym w KFMiB). W komercyjnych spektrometrach stosuje się położenie próbki poniżej detektora. W niektórych spektrometrach budowanych w laboratoriach stosowane jest ułożenie boczne, gdzie płaszczyzna reflektora umieszczona jest pionowo. Na rysunku 1 przedstawiono różnice w geometrii pomiarowej EDXRF i TXRF.. 7.

(8) Rys. 1. Porównanie geometrii pomiarowej EDXRF i TXRF.. 8.

(9) 3.. PODSTAWY FIZYCZNE Podobnie jak światło na granicy dwu ośrodków promieniowanie rentgenowskie ulega. załamaniu oraz odbiciu. Dla promieniowania X współczynnik załamania n dla ośrodka nie będącego próżnią jest mniejszy niż 1. Tak więc przy bardzo małych kątach padania promieniowania na płaszczyznę ośrodka może zajść całkowite odbicie. Współczynnik załamania wyrażony jest następującą zależnością:. n= 1 - δ- iβ. (1). gdzie δ przedstawia czynnik rzeczywisty – składową dyspersyjną, a β czynnik urojony – składową absorpcyjną współczynnika załamania. Oba czynniki zależą od długości fali promieniowania X, β zależy od masowego współczynnika absorpcji, a δ od gęstości ośrodka. Zależność obu współczynników od wielkości fizycznych charakteryzujących ośrodek przedstawiają wzory 2 i 3:. δ=. (2). (3). Gdzie: e – ładunek elektronu, NA – liczba Avogadro, c – prędkość światła w próżni, Z- liczba atomowa pierwiastka ośrodka, A – liczba masowa pierwiastka ośrodka, λ – długość fali promieniowania, τ – masowy współczynnik fotoelektrycznej absorpcji ośrodka dla promieniowania o długości fali λ, ρ – gęstość ośrodka.. 9.

(10) Dla promieniowania rentgenowskiego współczynniki β i δ są bardzo małe i wynoszą około 10-6. Rzeczywista część n jest niewiele mniejsza od 1 – promieniowanie X przechodząc z próżni lub powietrza do materii ulega nieznacznemu tylko załamaniu. Całkowite odbicie ma miejsce, kiedy promieniowanie dotyka powierzchni pod kątem mniejszym od kąta krytycznego φ. Zależność kąta φc od współczynnika  przedstawia wzór (4).. φc = 2. (4). Dla fotonów o energii kilkunastu keV kąt krytyczny wynosi około 0,1. Promieniowanie X całkowicie odbite na płaszczyźnie w niewielkim stopniu penetruje materiał [2].. 10.

(11) 4.. APARATURA POMIAROWA STOSOWANA W METODZIE TXRF. 4.1. Układ optyczny stosowany w spektrometrach TXRF W technice TXRF jako źródeł promieniowania najczęściej używa się dyfrakcyjnych lamp rentgenowskich z podłużnym ogniskowaniem. Stosowane są również lampy z wirującą anodą [3], lub też promieniowanie synchrotronowe [4,5,6]. Wiązka promieniowania rentgenowskiego wychodząca z lampy rentgenowskiej poprzez kolimator szczelinowy ma charakter płaskiej „wstążki”. Pierwszym elementem optycznym układu TXRF jest monochromator. Pomimo, że do wzbudzania próbek we fluorescencji rentgenowskiej można stosować zarówno promieniowanie poli- jak i monochromatyczne, to dla geometrii całkowitego odbicia zachodzi konieczność monochromatyzacji wiązki wzbudzającej. Promieniowanie rentgenowskie oddziałuje z materią w różny sposób. W momencie, gdy polichromatyczna wiązka promieniowania pada na optycznie gładką powierzchnię pod bardzo małym kątem odbiciu ulegnie jedynie część o energii mniejszej od energii krytycznej opisanej wzorem 5. (5). Gdzie: α – kąt wejścia, h – stała Plancka, c – prędkość światła, r0 – promień elektronu, c – prędkość światła, NA – stała Avogadro, ρ – gęstość ośrodka, f – część rzeczywista współczynnika rozpraszania, Ar – względna masa atomowa, j. indeks pierwiastka próbki,. C – abundancja danego pierwiastka.. 11.

(12) Wysokoenergetyczna część widma pierwotnego przyczynia się do powstania promieniowania wtórnego (rozproszenia) wpływając znacząco na podwyższenie tła oraz, co za tym idzie, pogorszenie granic wykrywalności. Wynika stąd konieczność zastosowania elementów optycznych służących do monochromatyzacji wiązki pierwotnej, tak aby zredukować wszystkie składniki promieniowania poza promieniowaniem charakterystycznym pierwiastków próbki [7]. W spektrometrach TXRF zazwyczaj stosuje się monochromator zwierciadlany albo monochromator wielowarstwowy. Po monochromatyzacji wiązka promieniowania pierwotnego pada na próbkę naniesioną na optycznie gładką powierzchnię reflektora. Promieniowanie padające na próbkę pod kątem mniejszym od kąta krytycznego (0,1º) ulega całkowitemu odbiciu. Oznacza to, że nie jest ono absorbowane ani w materiale próbki, ani też w reflektorze. W obszarze ponad gładką powierzchnią reflektora zachodzi interferencja wiązki padającej oraz odbitej i w tym obszarze wytwarza się fala stojąca, której węzły i strzałki leżą na płaszczyźnie równoległej do płaszczyzny reflektora. Zjawisko to przedstawiono na rysunku 2.. Rys. 2. Fala stojąca na powierzchni próbki powstająca w wyniku interferencji wiązki padającej i odbitej. Analogiczna sytuacja następuje, gdy na reflektor zostanie naniesiona próbka. Ponieważ intensywność promieniowania w płaszczyźnie węzłowej wynosi zero, a w płaszczyźnie strzałek jest wzmocniona czterokrotnie można przyjąć, że całkowita wydajność fluorescencji ulega podwojeniu. 12.

(13) W przypadku próbki naniesionej na reflektor w postaci cienkiej warstwy kąt dostrojenia powinien być mniejszy od kąta krytycznego (50-70%). Kąt padania wiązki wzbudzającej powinien być tak ustawiony, aby nie nastąpiła zbyt głęboka penetracja materiału reflektora, gdyż spowodowałoby to zwiększenie sygnału tła. Z kolei przy zbyt małym kącie materiał próbki nie zostanie wzbudzony i intensywność sygnału będzie zbyt niska. Schematycznie sytuację tę pokazuje rysunek 3.. Rys.3. Schematyczne przedstawienie zależności głębokości penetracji wiązki wzbudzającej od kąta jej padania. Optycznie gładka powierzchnia sprawia, że udział promieniowania rozproszonego dyfuzyjnie jest dużo mniejszy od rozproszonego z udziałem zwierciadlanego odbicia [2]. Dzięki temu – poprzez redukcje promieniowania rozproszonego następuje polepszenie stosunku sygnału do tła. Próbka wzbudzana jest zarówno przez wiązkę padającą jak i odbitą, co w efekcie zwiększa wydajność fluorescencji. Geometria pomiarowa umożliwia położenie próbki w odległości około 1mm od okienka detektora, co dodatkowo wpływa korzystnie na intensywność sygnału obniżając absorpcję w powietrzu.. 13.

(14) 4.2. Spektrometry wykorzystywane w metodzie TXRF Od samego początku technika TXRF rozwijała się wielotorowo. Stosowano ją zarówno do analizy powierzchni, jak i do analizy próbek ciekłych mierzonych w postaci suchej pozostałości na optycznie gładkiej powierzchni reflektora. Równolegle produkowane były oba rodzaje spektrometrów. Jednymi z pierwszych dostępnych na rynku spektrometrów wykorzystujących zjawisko całkowitego odbicia była EXTRA zbudowana w 1980 roku przez firmę Rich. Seifert & Co. Ahrensburg, Niemcy oraz EXTRA II rozpowszechniana przez nieistniejącą już firmę Atomika Instruments. Spektrometr ten miał dwie wersje – jedną służącą do analizy wafli krzemowych oraz drugą - do analizy śladowej próbek ciekłych, wyposażony był w zmieniacz próbek i automatyczne dostrajanie położenia próbki. Następnie w 1988 roku pojawiły się spektrometry japońskich firm, a mianowicie TREX – Technos Osaka, rozpowszechniany w Europie przez firmę Philips oraz spektrometry firmy Rigaku. W chwili obecnej również firma Italstructers posiada w swojej ofercie spektrometr TXRF. Pojawiły się również instrumenty przenośne. Większość dostępnych spektrometrów przeznaczona jest do pracy w powietrzu i nie posiada komór próżniowych – wyjątkiem jest WOBISTRAX zaprojektowany i produkowany w Instytucie Atomowym w Wiedniu [8]. Schemat tego urządzenia przedstawiony jest na rysunku 4.. Rys.4. Schemat spektrometru WOBISTRAX. 14.

(15) Niektóre spektrometry są przystosowane do pracy w środowisku czystego helu. Prowadzenie analiz w próżni poprawia wydajność oznaczania pierwiastków lżejszych od potasu ze względu na eliminację efektu absorpcji promieniowania X w powietrzu oraz wpływa na polepszenie kształtu widma poprzez usunięcie z widma piku argonu (2,9 keV) Elementem wzbudzającym promieniowanie charakterystyczne w spektrometrach TXRF jest zwykle lampa rentgenowska z anodą molibdenową, lub wolframową, skonstruowano również instrumenty posiadające lampę z anodą ze stopu wolframowomolibdenowego. Lżejsze aparaty przenośne wyposażone są w lampy rentgenowskie małej mocy z systemem chłodzenia opartym na efekcie Peltiera, nie wymagającym zastosowania ciekłego azotu [9]. Oprócz komercyjnych, gotowych spektrometrów używane są również tzw. przystawki wyprodukowane w Instytucie Atomowym w Wiedniu [10]. Zawieraj one elementy optyczne pozwalające na modyfikacje wiązki pierwotnej i pomiar metodą TXRF. Przystawki te montowane do dyfrakcyjnej lampy rentgenowskiej, co prawda oferują gorsze granice wykrywalności, nie posiadają automatycznego zmieniacza próbek i wymagają ręcznego dostrajania, są jednak wielokrotnie tańsze.. 4.3. Spektrometr użytkowany w Katedrze Fizyki Medycznej i Biofizyki W Katedrze Fizyki Medycznej i Biofizyki prace analityczne prowadzone są na spektrometrze. zaprojektowanym. i. skonstruowanym. w. dawnym. Zakładzie. Analiz. Radiometrycznych. Do dyfrakcyjnej lampy rentgenowskiej (typu long fine focus) z anodą molibdenową dołączono przystawkę do pomiaru w geometrii całkowitego odbicia zaprojektowaną i wyprodukowaną w Instytucie Atomowym w Wiedniu [11]. Wiązka pierwotna opuszcza lampę w postaci wstążki o szerokości około 1 cm i grubości około 1 mm. Następnie ulega ona odbiciu od optycznie gładkiej powierzchni monochromatora (ang. cut – off – reflector - reflektor odcinający) dzieląc się na wiązkę przechodzącą oraz odbitą. W module TXRF monochromatorem jest doskonale wypolerowana płytka z Suprasilu. Jest to materiał często stosowany w optyce rentgenowskiej, powstający poprzez stopienie SiCl4. Charakteryzuje się wysoką czystością, jest całkowicie jednorodny, wolny od zanieczyszczeń oraz pęcherzyków powietrza. Płaszczyzna monochromatora umocowana jest na trzech śrubach co umożliwia precyzyjne jego dostrojenie. Z uwagi na fakt, że przystawka nie jest wyposażona w kamerę konieczne jest ręczne ustawianie płaszczyzny odbicia poprzez obserwację rozszczepienia wiązki na ekranie fluorescencyjnym. Po prawidłowym 15.

(16) rozszczepieniu wiązki na ekranie obserwuje się dwa poziome prążki położone w odległości około 1 milimetra od siebie. Prążek górny to wiązka pierwotna, a dolny to odbita. Po uzyskaniu pierwszego rozszczepienia wiązki pierwotnej należy odciąć promieniowanie pochodzące bezpośrednio z lampy rentgenowskiej. Do tego celu służy tzw. zwany „beam stopper” – czyli blaszka wykonana z ołowiu umocowana na precyzyjnych śrubach, których regulacja umożliwia zaabsorbowanie wiązki pierwotnej. Następnie obserwując ponownie obraz na ekranie fluorescencyjnym należy tak dobrać płaszczyznę odbicia promieniowania na próbce aby uzyskać maksymalny sygnał. Miejsce odbicia wiązki powinno nastąpić w centralnej części reflektora, tak aby wzbudzeniu uległy atomy naniesionej uprzednio próbki, a nie samego reflektora. Na rysunku 5 przedstawiono budowę modułu do TXRF, na którym wykonano badania, których wyniki przedstawiono w niniejszej pracy.. Rys. 5. Moduł TXRF zamontowany w spektrometrze Katedry Fizyki Medycznej i Biofizyki.. 16.

(17) Płaszczyzna modułu połączona jest z lampą rentgenowską pod kątem 6°. Do większości pomiarów używana jest lampa z anodą molibdenową. Energia promieniowania charakterystycznego. serii K Mo wynosi 17,44 keV, co umożliwia poprawną analizę. pierwiastków o liczbach atomowych Z powyżej 19 - cięższych od potasu. Promieniowanie pierwiastków lżejszych od potasu jest silnie absorbowane w powietrzu. W niektórych przypadkach można oznaczać chlor, wymaga to jednak odstąpienia od wstępnego chemicznego przygotowania próbki. Dostrajanie urządzenia jest czasochłonne, a wykonywane ręcznie wymaga sporego doświadczenia. Prawidłowe dostrojenie zapewnia jednak dość stabilną pracę zazwyczaj przez kilka miesięcy. Jedynie przy starzeniu się lampy rentgenowskiej należy „dostrajać” przyrząd mniej więcej co kilka tygodni. W trakcie wykonywania pomiarów konieczna jest codzienna kontrola intensywności promieniowania za pomocą próbki kontrolnej. Rysunek 6 poglądowo przedstawia prawidłowe i nieprawidłowe dostrojenie wiązki promieniowania wzbudzającego na próbce. W przypadku a wiązka padająca trafia w miejsce położenia próbki. W przypadkach b i c zachodzi zjawisko całkowitego odbicia, ale następuje ono przed, lub za miejscem położenia próbki na reflektorze.. Rysunek 6. Prawidłowe (a) i nieprawidłowe (b) i (c) dostrojenie wiązki promieniowania wzbudzającego na próbce w geometrii TXRF.. 17.

(18) 5.. ANALIZA ILOŚCIOWA Ze względu na niewielkie objętości (pojedyncze mikrolitry) i co za tym idzie bardzo. małe masy analizowanych próbek metoda TXRF dedykowana jest do analizy próbek cienkich. W tego typu analizie zbyteczne jest stosowanie żmudnych metod obliczeniowych korekty efektów matrycy, takich jak absorpcja czy wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego. Próbkę nakrapia się na środek reflektora, a następnie suszy. Najczęściej stosowanym sposobem jest suszenie na płycie grzewczej w komorze czystej, suszenie próżniowe z zastosowaniem eksykatora czy też użycie promiennika podczerwieni. Po wyschnięciu, kształt kropli nie jest idealnie symetryczny, nie zawsze też pozycja próbki względem okienka detektora jest dokładnie powtarzalna, rozkład pierwiastków w suchej pozostałości nie zawsze jest homogeniczny, więc liczba zliczeń danego pierwiastka dla różnych nakropień tej samej próbki nie musi być powtarzalna. Dla ominięcia tych niedogodności oznaczenia ilościowe wykonywane są z zastosowaniem standardu wewnętrznego. Metoda ta opiera się na dodaniu znanej ilości pierwiastka nie występującego w badanej próbce. W zasadzie standardem wewnętrznym może być dowolny pierwiastek nie występujący w badanej próbce, powinien jednak być tak dobrany, aby w miarę możliwości uniknąć nakładania się linii spektralnych pierwiastków analizowanych oraz dodanego. Dodatkowo standard wewnętrzny powinien spełniać kilka podstawowych warunków: - należy wybierać pierwiastki charakteryzujące się wysoką czułością; - dodawana objętość standardu powinna być na tyle mała, aby można było pominąć zmianę całkowitej objętości próbki; - stężenie końcowe powinno być porównywalne ze stężeniem pozostałych składników próbki. Ze względu na mniejszą ilość linii spektralnych oraz wyższą czułość zazwyczaj wybierane są pierwiastki emitujące promieniowanie linii K w zakresie badanych energii. Najczęściej stosowane pierwiastki to gal, selen lub itr. Przy wyborze galu jako standardu wewnętrznego poważnie utrudniona jest analiza próbek o wysokiej zawartości ołowiu – pojawiająca się wtedy linia charakterystyczna ołowiu 9,18 keV nakłada się z linia Kα galu (9.2 keV). Przy wyborze selenu natomiast należy zwrócić uwagę, że związki tego pierwiastka mogą być lotne w wyższych temperaturach (ok. 180˚C), więc przy suszeniu próbki należy zachować szczególną ostrożność. Zasada wstępnego pomiaru próbki przed dodaniem standardu musi być bezwzględnie przestrzegana.. 18.

(19) Typowe stężenia standardu wewnętrznego to 0,5-1 mg/dm3 dla próbek wody, 50 –100 mg/kg dla próbek roślinnych ok. 500 mg/kg dla próbek gleby. Kalibracja. polega. na. wyznaczeniu. czułości. względnych. poszczególnych. pierwiastków. Czułość danego pierwiastka definiowana jest jako stosunek liczby zliczeń pod pikiem netto do stężenia tego pierwiastka. Czułością względną jest stosunek czułości danego pierwiastka do czułości standardu wewnętrznego. Roztwory kalibracyjne są mieszaniną różnych pierwiastków dobranych tak, aby uniknąć nakładania się ich linii fluorescencyjnych i tak, aby pokryły cały zakres pomiarowy. Wyznaczenie krzywej kalibracji opiera się na równaniu.. Sj . N j / cj N is / cis.  Sis. (6). Gdzie: Nj – pole powierzchni piku linii charakterystycznej j-go pierwiastka Nis – pole powierzchni piku linii charakterystycznej pierwiastka referencyjnego (standardu wewnętrznego), cj – stężenie j-go pierwiastka oraz cis stężenie pierwiastka referencyjnego, Sj - czułość j-go pierwiastka. Analiza ilościowa z dodatkiem standardu wewnętrznego opiera się na prostym równaniu:. cx . N x / Sx  cis N is / Sis. (7). Gdzie: Nx – pole powierzchni piku linii charakterystycznej oznaczanego pierwiastka oraz Sx – jego czułość wyznaczona w kalibracji, Nis – pole powierzchni piku linii charakterystycznej standardu wewnętrznego oraz Sis – jego czułość wyznaczona w kalibracji, cis – stężenie standardu wewnętrznego [2].. 19.

(20) Na rysunku 7 przedstawiono eksperymentalnie wyznaczoną względną czułość pierwiastków od chloru do itru. 2,5. czułośd względna. 2 1,5 1. 0,5 0 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 liczba atomowa. Rys. 7. Eksperymentalna krzywa czułości względnej dla pierwiastków oznaczanych według linii K. Standard wewnętrzny – gal.. Na podstawie wyliczonych czułości względnych wyznacza się uogólniona krzywą kalibracji. Kalibrację dla pierwiastków obliczanych poprzez natężenia linii K i L wykonuje się osobno. W przypadku braku wszystkich pierwiastków kalibrowanych według linii L można poprzestać na punktach kalibracyjnych dla poszczególnych pierwiastków rezygnując z uogólnionej krzywej kalibracji.. 5.1. Przygotowanie próbek Metoda całkowitego odbicia promieniowania X jest dedykowana przede wszystkim do analizy próbek ciekłych. Stwarza to duże możliwości szybkiego i stosunkowo prostego analizowania próbek wody. Próbki wód naturalnych różnego pochodzenia mogą być analizowane bez wstępnego przygotowania, jedynie po dodaniu standardu wewnętrznego. W wypadku bardzo niskich zawartości pierwiastków śladowych zasadnicza analiza może być poprzedzona procesem wzbogacania takim jak ekstrakcja do fazy stałej połączona z wymywaniem czy też ekstrakcja do fazy organicznej, którą łatwo można odparować. W przypadku lotnych rozpuszczalników organicznych można znacząco zwiększyć wielkość 20.

(21) próbki – odczynniki organiczne zazwyczaj odparowują całkowicie nie pozostawiając żadnych pierwiastków mających wpływ na kształt widma fluorescencyjnego. Całkowita objętość próbki może wynosić nawet około 100 mikrolitrów. Próbka taka może być nakrapiana wielokrotnie lub jednorazowo suszona z użyciem specjalnego urządzenia zapobiegającego rozlewaniu się po powierzchni stosunkowo dużej objętości odczynnika [2]. Próbki stałe lub ciekłe, których nie można prawidłowo wysuszyć (np. płyny o konsystencji oleistej, takie jak tłuszcze, ropa naftowa itp.) należy poddać rozpuszczeniu, czyli tzw. mineralizacji. Mineralizacja polega na roztworzeniu próbki w utleniającym kwasie, w wysokiej temperaturze. W procesie mineralizacji organiczna matryca próbki (azot, węgiel, fosfor, siarka, chlor, brom) jest utleniana i w postaci mieszaniny lotnych tlenków zostaje usunięta z roztworu. Najprostszym sposobem jest mineralizacja prowadzona w systemie otwartym z zastosowaniem kwasu azotowego, siarkowego oraz nadchlorowego. Kwasy mogą być stosowane pojedynczo lub mogą być mieszane ze sobą w różnych proporcjach. Metoda ta jest jednak długotrwała, wymaga nieustannego nadzoru oraz niesie ze sobą ryzyko zanieczyszczenia próbki. Najskuteczniejsza jest mineralizacja w kwasach azotowym i nadchlorowym z ewentualnym dodatkiem nadtlenku wodoru – niestety, nie należy ona do metod bezpiecznych ze względu na ryzyko eksplozji związane z użyciem kwasu nadchlorowego. Obecnie najczęściej stosuje się głównie mineralizację w systemie zamkniętym w tzw. bombach mineralizacyjnych. Można stosować mineralizatory mikrofalowe, gdzie energia mikrofal dostarczana jest bezpośrednio do próbki, co znacząco skraca czas roztwarzania, lub bomby stalowe umieszczane w zwykłych piecach laboratoryjnych. Teflonowe naczynie ze szczelną pokrywą zamyka się w płaszczu stalowym – w przypadku mineralizacji z zastosowaniem pieca - lub ceramicznym w przypadku mineralizacji mikrofalowej. Próbka jest roztwarzana zazwyczaj w kwasie azotowym V, a w przypadku trudnych do rozłożenia substancji (np. tłuszcze) stosuje się niewielki dodatek perhydrolu (30% H2O2) lub kwasu solnego. Na rysunku 8 pokazano bomby mineralizacyjne produkowane przez amerykańska firmę Parr Instrument Company używane do przygotowania próbek opisywanych w niniejszej pracy.. 21.

(22) Rys.8. Bomby mineralizacyjne. Próbkę umieszczoną w naczyniu teflonowym umieszcza się w stalowym płaszczu. Maksymalna ilość próbki – 0,5g. Temperatura mineralizacji wynosi zazwyczaj ok. 180-200˚C, (maksymalnie 250˚C), a ciśnienie wytwarzane wewnątrz zależy od ilości organicznej matrycy próbki. Metoda ta pozwala na rozłożenie wiązań chemicznych w większości substancji poddawanych analizie [12,13]. Po prawidłowo przeprowadzonej mineralizacji próbka jest bezbarwna i przezroczysta. Usunięcie organicznej matrycy próbki przyczynia się do zmniejszenia tła pochodzącego od promieniowania rozproszonego i w konsekwencji do obniżenia granic wykrywalności. W mniej typowych przypadkach lub przy bardzo małych masach próbek można roztwarzać je bezpośrednio na reflektorze. W niektórych przypadkach, kiedy dostępne są mikroilości próbki stosuje się spalanie zimną plazmą (ang. Cool Plasma Ashing - CPA) [14]. Próbka jest mineralizowana bezpośrednio na reflektorze, a część pierwiastków jest usuwana w postaci lotnych tlenków (np. węgiel, siarka, azot, fosfor). W popiele pozostają tlenki nielotnych pierwiastków. Z literatury znane są też badania nad wydzielaniem metali z roztworu soli za pomocą elektrodepozycji. prowadzonej. bezpośrednio. na. reflektorze. pomiarowym.. Gładka. powierzchnia tworzona przez mieszaninę metali jest prawie idealną próbką dla TXRF z uwagi na redukcję promieniowania rozproszonego pochodzącego od matrycy. W takich wypadku materiałem reflektora był węgiel [15], lub niob [16]. 22.

(23) 5.2. Reflektory Ciekła próbka jest nakrapiana lub osadzana przez elektrodepozycję na bardzo gładką powierzchnię podkładki zwanej reflektorem. Reflektor ma kształt krążka o średnicy ok. 30mm. Najczęściej reflektory wykonane są czystego dwutlenku krzemu (sinsil) polerowanego proszkiem diamentowym. W ostatnich latach bardzo popularne stały się reflektory wycinane z wafli krzemowych. Są one dużo tańsze, łatwiejsze do mycia, ale ponieważ krzem nie jest obojętny chemicznie, wiec przy suszeniu mocno kwaśnych roztworów takich jak roztworzone w kwasach próbki po mineralizacji reflektor ulega stopniowemu zużyciu. Dostępne są też tanie, jednorazowe podkładki wykonane z pleksiglasu. W szczególnych przypadkach używa się podkładek wykonanych z węgla [14], niobu [15] lub azotku boru [17]. Do oznaczeń krzemu użyto zaś reflektorów wykonanych z szafiru [18]. Na rysunku 9 przedstawiono widmo promieniowania uzyskanego dla czystego reflektora krzemowego. Widoczne są linie promieniowania charakterystycznego materiału reflektora (linia Kα krzemu 1,7 keV) oraz argonu (2,9 keV) pochodzącego z powietrza, jak również linie charakterystyczne molibdenu.. 300. Si. Mo Ka. liczba zliczeń. 200. Ar Ka 100. 0 0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 E [keV]. Rys. 9. Widmo czystego reflektora krzemowego (Czas pomiaru 300s, 55kV/30mA, lampa molibdenowa).. 23.

(24) Reflektory wielokrotnego użytku czyszczone są przez gotowanie w 2% Extranie alkalicznym (Merck) przez około godzinę, następnie w Extranie o odczynie kwaśnym, wielokrotnie płukane w wodzie dejonizowanej i suszone w komorze czystej. Przed użyciem czystość każdego z nich musi zostać sprawdzona. Każda operacja musi być prowadzona bardzo ostrożnie – powierzchnia reflektora powinna być idealnie gładka, tak, aby promieniowanie rentgenowskie nie ulegało rozproszeniu na nierównościach powierzchni.. 24.

(25) 6.. STUDIA LITERATUROWE DOTYCZĄCE ZASTOSOWAN METODY TXRF. 6.1. Zastosowanie metody TXRF w przemyśle elektronicznym Jednym z rutynowych zastosowań metody TXRF jest badanie zanieczyszczeń wafli krzemowych stosowanych w przemyśle elektronicznym. Powierzchnia krzemu jest optycznie gładka i całkowicie odbija promieniowanie rentgenowskie. Badanie zanieczyszczeń powierzchni może być prowadzone bezpośrednio. Analiza ilościowa pozwala na oznaczenie metali przejściowych o stężeniach rzędu 1010 atomów/cm2. Dzięki skanowaniu powierzchni wafla pod różnymi kątami możliwe jest rozróżnienie pomiędzy różnymi typami zanieczyszczeń: typu cienkich warstw, domieszek całościowych oraz cząsteczkowych. Kształt profilu zależności intensywności natężenia promieniowania od kąta jest charakterystyczny dla każdego z wyżej wymienionych typów zanieczyszczeń. Dla dodatkowego polepszenia granic wykrywalności stosuje się technikę VPD (ang. vapor phase decomposition – rozkład za pomocą oparów kwasu). W zamkniętej komorze podgrzewa się kwas fluorowodorowy, który paruje, a następnie skrapla się na chłodzonej powierzchni wafla. W sposób naturalny powierzchnia pokryta jest bardzo cienką (o grubości nm) warstwą dwutlenku krzemu, który jest trawiony przez kwas fluorowodorowy. Ewentualne zanieczyszczenia powierzchni również przechodzą do fazy ciekłej. W końcowym etapie kropla jest zbierana, suszona, a następnie analizowana techniką TXRF. Zastosowanie metody VPD pozwala obniżyć granice wykrywalności do 108 atomów/cm2. Zmodyfikowana technika VPD znalazła zastosowanie w badaniu powierzchni wafli krzemowych implantowanych pierwiastkami przejściowymi. W wersji pierwotnej trawieniu kwasem ulega naturalna warstwa dwutlenku krzemu. Podobną warstwę można utworzyć przez utlenianie powierzchni krzemu woda utlenioną. Utlenianie na przemian z trawieniem może być powtarzane wielokrotnie. Pomiędzy kolejnymi krokami wafel jest ważony, a z różnicy mas można wyliczyć grubości wytrawionych warstw oraz rozkład implantowanego pierwiastka w cienkiej warstwie. Pojedyncze trawienie odpowiada warstwie poniżej 1 nm. Z uwagi na fakt, że tak niskich granic wykrywalności nie da się osiągnąć żadną inną metoda, TXRF znalazła rutynowe zastosowanie w przemyśle elektronicznym. W analizie składu pierwiastkowego jest stosowana do kontroli czystości odczynników chemicznych, do analizy składu próbek wodnych, oraz różnego rodzaju próbek środowiskowych i biologicznych. [19,20,21].. 25.

(26) 6.2. Zastosowanie metody TXRF do analizy jakościowej i ilościowej próbek biologicznych i środowiskowych Z uwagi na niewielkie próbki, niskie granice wykrywalności oraz możliwość równoczesnej analizy wielu pierwiastków w ostatnich latach metoda TXRF znalazła liczne zastosowania w analizie próbek biologicznych [22]. Badania prowadzono zarówno na potrzeby biologii środowiska, jak i medycyny. W 1997 Brown i wsp. zastosowali metodę TXRF do badania prionów (proteinaceous infectious particle - białek infekcyjnych) wykazując różnice w zawartości miedzi w próbkach tkanki mózgowej [23].Zhen i wsp. [24] zastosowali TXRF do badania stosunku stężeń Cu/Fe w oksydazach cytochromowych. Wittershagen badał skład pierwiastkowy tych enzymów [25,26,27,28]. Synchrotronowe TXRF w połączeniu z elektroforezą żelową wykorzystywano do określenia zawartości metali w różnego rodzaju białkach [29]. Od początków rozwoju metody czynione były próby zastosowania TXRF do badania płynów ustrojowych. Pierwsze prace na ten temat dotyczą analizy pełnej krwi [30,31]. Z uwagi na wysoką zawartość żelaza zastosowana preparatyka obejmowała usunięcie żelaza poprzez ekstrakcje z HCl i metyloizobutyloketonem. Badano również możliwość chemicznego wzbogacania pierwiastków grup przejściowych (niklu, miedzi, cynku) oraz ołowiu we krwi poprzez mineralizację, a następnie wytrącanie nierozpuszczalnych w wodzie związków kompleksowych. Osady były następnie oddzielane poprzez filtrację i remineralizowane [32]. Do badania poziomu metali u kobiet i niemowląt żyjących na terenie skażonym (Zabrze) metodę TXRF wykorzystali Viksna i wsp. [33]. Osocze ludzkie lub zwierzęce jest płynem łatwiejszym do analizy niż pełna krew przede wszystkim ze względu na niższą zawartość żelaza. Metodę TXRF wykorzystywano zarówno do analizy proporcji między poszczególnymi pierwiastkami [34] jak i do określenia stężeń najczęściej oznaczanych pierwiastków czyli żelaza, miedzi, cynku, selenu [35]. Analiza osocza była prowadzona bezpośrednio [36] - często po rozcieńczeniu niewielka ilością wody bądź w połączeniu z mineralizacja próbki. Mineralizacja podwyższa precyzję oznaczenia, czasem jednak jej przeprowadzenie nie jest możliwe ze względu na niewielką ilość dostępnego materiału. Podobnym problemem analitycznym jest analiza płynu mózgowo-rdzeniowego, z tym, że zawartości pierwiastków są niższe niż w osoczu [37]. W badaniach in vitro wykorzystuje się spektrometrię TXRF do badania hodowli tkankowych [38,39,40,41]. Pod koniec lat osiemdziesiątych przeprowadzono próby zastosowania TXRF do badania składu tkanek ciętych mikrotomem i nakładanych 26.

(27) bezpośrednio na reflektor w postaci cienkiej warstwy. W przypadku tego typu pomiarów stosowano detektory o szerokim kącie widzenia (100 mm2). Technika ta została wykorzystana do porównania dystrybucji pierwiastków w tkankach zdrowych i nowotworowych [42]. W pozostałych przypadkach zazwyczaj stosuje się mineralizację z zastosowaniem kwasu azotowego. TXRF wykorzystywano do badania kości [43], zębów [44], włosów [45], łożysk [46], tkanki mózgowej [47,48], płuc [49] oraz wątroby [50]. TXRF wykorzystywane jest również w biologii roślin, przede wszystkim do analizy roślin będących biomonitorami skażeń środowiska takich jak porosty [51], epifity (Tilldansia capillaries) [52], czy też hiperakumulatory [53]. SR–TXRF znalazło zastosowanie w analizie pierścieni przyrostów drzew [54,55] oraz tropikalnych roślin od lat stosowanych w tradycyjnej medycynie [56,57]. W badaniach ekosystemów wodnych stosowano TXRF do analizy nie tylko wody, ale i organizmów wodnych. W zależności od stopnia biodostępności pierwiastki toksyczne mogą osiągać wysokie stężenia w różnych organizmach. Przedmiotem badań były ryby oraz ich pasożyty [58,59] wodne insekty [60]. Analizie poddawano całe organizmy, lub ich wyselekcjonowane organy. Najczęściej oznaczano stężenia pierwiastków grup przejściowych oraz ołowiu. Hoefler i wsp. wykorzystali metodę TXRF do badania zawartości lekkich pierwiastków takich jak węgiel, siarka, fosfor czy tlen w próbkach biologicznych. Badania prowadzono w komorze próżniowej, z zastosowaniem lampy o chromowej anodzie, monochromatora wielowarstwowego, detektora krzemowego z okienkiem 30 mm2 i ultra cienkim okienkiem. Przedmiotem badań były biofilmy – agregaty komórek grzybów lub bakterii tworzących cienkie warstwy na rożnych powierzchniach. Jako że, w przyrodzie takie kolonie mogą wiązać różne śladowe pierwiastki mogą one być używane między innymi jako wskaźniki zanieczyszczenia środowiska. Biofilmy były hodowane bezpośrednio na reflektorach pomiarowych [61].. 27.

(28) 6.3. Zastosowanie metody TXRF w archeometrii Archeometria. jest. interdyscyplinarną. nauką. dotyczącą. badania. obiektów. historycznych. Badania dotyczą zarówno składu chemicznego, jak i technologii używanych w przeszłości. Z uwagi na wartość historyczną i materialną badanych obiektów stosowana technika analityczna powinna mieć charakter nieniszczący, lub oferować możliwość przeprowadzenia analizy z próbki o niewielkiej masie. Proces pobierania próbek przebiega zwykle pod nadzorem konserwatora sztuki. W ostatnich latach obok przenośnych spektrometrów. EDXRF. czy. też. rentgenowskiej. mikroanalizy. fluorescencyjnej. z. zastosowaniem kapilary, również TXRF zdobywa miejsce w tej dziedzinie. TXRF stosowano do analizy różnego rodzaju próbek obiektów historycznych. W Argentynie metodę tę zastosowano do badania składu pigmentów w prehistorycznych malowidłach naskalnych. Połączenie TXRF ze spektrometria masową i spektroskopią w podczerwieni pozwoliło scharakteryzować rodzaj pigmentów organicznych i nieorganicznych [62]. Ważną częścią badań archeometrycznych jest analiza składu pigmentów. Pigmenty nieorganiczne są zwykle solami metali ciężkich lub przejściowych i identyfikacja charakterystycznego metalu jest pomocna przy określeniu składu pigmentu. Ponieważ chronologia stosowania pigmentów jest znana, ich identyfikacja jest pomocna w datowaniu oraz określeniu autentyczności obiektu. W niektórych przypadkach udaje się ustalić wspólne źródło pochodzenia niektórych barwników. W. podobny. sposób. badano. pigmenty. w. modelach. łodziach. egipskich. przechowywanych w British Muzeum i w Muzeum Egipskim w Berlinie.[63]. Identyfikacja pigmentów posłużyła w tym wypadku również jako pomoc w datowaniu tych obiektów. Skorygowano niepoprawne datowanie kilku obiektów oraz stwierdzono współczesną konserwacje innym rodzajem farby. Przedmiotem badań były trzy grupy pigmentów: czerwone, białe oraz zielone i niebieskie. TXRF w połączeniu z aktywacją neutronową zastosowano do analizy składu hiszpańskiej ceramiki pochodzącej z wykopalisk. Drobno zmielona próbka była nanoszona na reflektor w postaci zawiesiny, a metoda TXRF posłużyła do półilościowej analizy pierwiastkowej (% składnika głównego – żelaza). Analiza klastrowa wyników oznaczeń umożliwiła klasyfikacje obiektów do kilku grup różniących się składem, co z kolei pozwoliło na wnioskowanie o różnym pochodzeniu materiału wyjściowego [64].. 28.

(29) Klockenkampfer, Van Bohlen i inni zastosowali metodę TXRF do badania pigmentów w starych obrazach olejnych oraz atramentów w iluminowanych manuskryptach średniowiecznych. Mikroilości pigmentów pobierane były za pomocą wacików i nanoszone na reflektor. Metoda jest wystarczająco czuła, aby praktycznie niewidoczna próbka o masie kilku mikrogramów była wystarczająca do przeprowadzenia analizy głównych składników badanego pigmentu [65]. W podobny sposób stosowano TXRF do badania pigmentów w albańskich ikonach [66]. Połączenie metody TXRF ze spektroskopią ramanowską pozwoliło na uzyskanie kompletnej informacji na temat składu badanych pigmentów [67]. Jak wynika z przytoczonej literatury w ciągu ostatnich lat dzięki prostemu przygotowaniu próbek, niskim granicom wykrywalności i możliwości wykonania wielopierwiastkowej analizy dla niewielkiej ilości materiału TXRF znalazło szerokie zastosowanie nie tylko w naukach medycznych i biologicznych, ale i takich jak badania dziedzictwa kulturowego, czy też konserwacja dzieł sztuki.. 29.

(30) 7.. WYNIKI BADAŃ PROWADZONYCH METODĄ TXRF W KATEDRZE FIZYKI MEDYCZNEJ I BIOFIZYKI Celem pracy jest prezentacja prac analitycznych z wykorzystaniem metody TXRF. prowadzonych od wczesnych lat dziewięćdziesiątych w Zakładzie Analiz Radiometrycznych, obecnie przekształconym w Katedrę Fizyki Medycznej i Biofizyki. W ówczesnym czasie metoda była jeszcze stosunkowo mało znana zarówno w Polsce jak i na świecie, i wprowadzenie jej do badań rutynowych wymagało szeregu szczegółowych badań nad optymalizacją sposobu przygotowania próbek, powtarzalnością pomiarów, warunków pomiarowych, doborem standardu wewnętrznego, etc. Praca pokazuje typowe zastosowania analityczne od analizy wody, poprzez analizę płynów ustrojowych po analizę roślin. Mniej typowym zastosowaniem jest analiza obiektów historycznych, której przykładem jest badanie składu srebrnych monet. Badania nad różnorodnymi materiałami prowadzono we współpracy z Collegium Medicum UJ, Instytutem Nauk o Środowisku UJ oraz Gabinetem Numizmatycznym Muzeum Narodowego. Tak zróżnicowane próbki wymagały w każdym przypadku opracowania specyficznej metodyki badawczej, określenia granic wykrywalności oraz precyzji pomiarów. Niniejsza praca prezentuje te badania.. 30.

(31) 7.1. Analiza wód naturalnych 7.1.1. Wprowadzenie Typowym i jednocześnie najmniej skomplikowanym zastosowaniem metody TXRF jest analiza wód naturalnych różnego pochodzenia. Próbki wody nie wymagają praktycznie żadnego wstępnego przygotowania poza dodatkiem standardu wewnętrznego. 7.1.2. Przedmiot badań W niniejszej rozprawie doktorskiej jako przykład przedstawiono wyniki analizy 2 próbek wód lodowcowych ze Spitsbergenu o różnych zawartościach składników mineralnych. Próbka 250 została pobrana z piezometru i reprezentuje prawdopodobnie mieszaninę wody infiltrującej z koryta rzeki i wody podziemnej spływającej kierunku rzeki z moreny dennej lodowca.. Próbka. 267. została. pobrana. z. rzeki. zbierającej. powierzchniowe. i. podpowierzchniowe (w dominującej części) odpływy z lodowca. Jej skład kształtuje się poprzez te same procesy co dla próbki 250, ale ze względu na krótszy czas jej kontaktu z substancjami mineralnymi stężenia pierwiastków są niższe. Przy pobieraniu próbki były filtrowane dla oddzielenia rozproszonej materii, a następnie zakwaszane kilkoma kroplami kwasu azotowego dla zapobieżenia absorpcji śladowych ilości pierwiastków na ściankach naczyń. Próbki były przechowywane i transportowane w naczyniach z polipropylenu. Badania były prowadzone we współpracy z Zespołem Fizyki Środowiska Katedry Zastosowań Fizyki Jądrowej. 7.1.3. Przygotowanie próbek i pomiary Do 1 cm3 wody dodano standard wewnętrzny (gal), tak aby jego stężenie końcowe wynosiło 1 mg/L. ( 10 µl roztworu o stężeniu 100 mg/l). Po wymieszaniu, na reflektor naniesiono 5 mikrolitrów i wysuszono. Czas pomiaru wynosił 2000s. Do wzbudzania promieniowania charakterystycznego zastosowano lampę molibdenową, warunki pomiarowe to 55kV i 30mA. Poniżej przedstawiono wyniki analizy dla obu próbek.. 31.

(32) Tabela 1. Wyniki analizy wód lodowcowych. Kod. Pierwiastek – stężenie [ mg/dm3 ]. próbki 250. K. Ca. Cr. Fe. Cu. Zn. Br. Sr. 9,3. 139,3. 0,069. 0,239. 0,048. 0,031. 0,040. 0,323. 8,7. 135,7. 0,065. 0,220. 0,040. 0,033. 0,034. 0,321. 7,2. 112,9. 0,062. 0, 211. 0,031. 0,030. 0,039. 0,295. Mediana. 8,7. 135,7. 0,065. 0,220. 0,040. 0,031. 0,039. 0,321. u*. 0,7. 8,8. 0,002. 0,009. 0,006. 0,001. 0,002. 0,009. u [%]. 8,0. 6,5. 3,5. 4,2. 15,0. 3,2. 5,1. 2,8. 267. 0,62. 10,7. 0,061. 0,142. 0,041. 0,018. 0,002. 0,032. 0,56. 11,0. 0,091. 0,151. 0,039. 0,022. 0,004. 0,031. 0,81. 9,9. 0,038. 0,110. 0,034. 0,014. 0,004. 0,025. Mediana. 0,620. 10,700. 0,061. 0,142. 0,039. 0,018. 0,004. 0,031. u. 0,063. 0,367. 0,018. 0,012. 0,002. 0,003. 0,001. 0,002. u [%]. 10,2. 3,4. 29,0. 8,7. 6,0. 14,8. 16,7. 7,5.  - u niepewność obliczona z rozstępu. Do obliczeń statystycznych zastosowano medianę Ważnym parametrem każdej metody analitycznej jest granica wykrywalności poszczególnych pierwiastków. Określa ona najmniejszą ilość pierwiastka, jaką można wykryć próbce. Zwykle równa jest ona trzem odchyleniom standardowym tła. W metodzie TXRF granicę wykrywalności wyrażoną w jednostkach stężenia określa się wzorem 7: (7) Gdzie B - oznacza liczbę tło piku linii charakterystycznej danego pierwiastka C - stężenie danego pierwiastka w próbce, A - pole powierzchni piku linii charakterystycznej (netto) danego pierwiastka. Z uwagi na wpływ matrycy na wysokość tła granice wykrywalności są różne dla różnego typu próbek i dla każdego są szacowane oddzielnie.. 32.

(33) Niezależnie jednak od rodzaju próbki najwyższe wartości obserwuje się dla pierwiastków lżejszych – potasu i wapnia. Stwierdzono, że zwiększona zawartość Ca wpływa na podwyższenie tła, co widoczne jest na rysunku 11, jednak pozostaje bez wpływu na granice wykrywalności. Na rysunku 10 przedstawiono porównanie granic wykrywalności dla obu badanych wód.. 0,200. stężenie [mg/dm3]. 0,160 wysokie stężenie Ca 0,120. niskie stężenie Ca. 0,080 0,040 0,000 K. Ca. Cr. Mn. Fe Ni pierwiastek. Cu. Zn. Br. Sr. Rys. 10. Granice wykrywalności dla wód o niskim i wysokim stężeniu wapnia. 100000. Ca 10000. Mo. liczba zliczeń. Ga 1000. Fe. Sr Br. 100 10 1 0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 energia [keV]. Rys. 11. Widma TXRF wód naturalnych o wysokim (linia niebieska) i niskim (linia różowa) stężeniu wapnia. 33.

(34) 7.1.4. Podsumowanie Wykonanie analizy wód naturalnych jest najprostszym przykładem zastosowania metody TXRF w analityce. Analiza próbek o niewielkich stężeniach większości obecnych – poza wapniem i potasem - pierwiastków (poniżej 1 mg/l) jest szybka, a przygotowanie próbek ogranicza się do dodania standardu wewnętrznego. Granice wykrywalności wynoszą znacznie poniżej 1 mg/dm3 co w większości przypadków jest wystarczające do oznaczenia interesujących nas pierwiastków. Niepewność względna wahała się zazwyczaj w granicach od 3 do 12%. Do analizy ilościowej użyto 1 ml próbki – choć można wykorzystać znacznie mniejszą objętość, - co ma istotne znaczenie w przypadku pobierania próbek w terenie i dalszego ich transportu. Sposób ten nadaje się bardzo dobrze do analizy różnego rodzaju wód naturalnych.. 7.2. Ocena przydatności metody TXRF do analizy płynów ustrojowych 7.2.1. Wprowadzenie Metoda całkowitego odbicia promieniowania X została zastosowana do analizy płynu mózgowo – rdzeniowego oraz osocza pochodzących od osób chorych na stwardnienie boczne zanikowe – (Amiotrophic Lateral Sclerosis – ALS). ALS jest jedną z chorób neurodegeneracyjnych o nieznanej etiologii. Choroba atakuje nerwy motoryczne centralnego układu nerwowego powodując ich stopniowy zanik, co w konsekwencji prowadzi do całkowitego paraliżu oraz nieuchronnej śmierci, zazwyczaj w ciągu około trzech lat od wystąpienia pierwszych objawów. Najczęściej choroba rozpoczyna się między 50 a 70 rokiem życia. W związku z tym, że schorzenie jest rozpoznawane najczęściej w momencie zaistnienia ewidentnych objawów neurologicznych związanych z daleko posuniętą degeneracją neuronów motorycznych takich jak: problemy z mową, utrudnione przełykanie, spastyczność lub drżenie, poszukuje się ewentualnych odstępstw od normy w badaniach laboratoryjnych (tj. markerów biochemicznych choroby), pomocnych w zdiagnozowaniu wczesnego stadium nawet przed wystąpieniem objawów klinicznych. Analiza składu pierwiastkowego jest badaniem pomocniczym mogącym wykazać odstępstwa od normy w płynach ustrojowych. Pierwiastki które mogą brać udział w procesie chorobowym, to przede wszystkim miedź i cynk. Są one składnikami enzymów odpowiedzialnych za wiele procesów metabolicznych, między innymi oksydaz biorących udział w procesach utleniania i redukcji w komórkach. Cynk i miedź występują w oksydazie 34.

(35) ponadtlenkowej (Cu/Zn SOD1) - enzymie odpowiedzialnym za neutralizację wolnych rodników tlenowych. Dezaktywacja enzymów unieszkodliwiających nadtlenki i wolne rodniki tlenowe może być przyczyną oksydacyjnych uszkodzeń składników komórek. Zaburzenia funkcjonowania tego enzymu obserwowano w genetycznej formie stwardnienia bocznego zanikowego. Dodatkowo metale te mogą mieć wpływ na procesy neurodegeneracyjne poprzez tworzenie nieprawidłowych form białkowych. Cynk jest również niezbędny w procesie syntezy kwasów nukleinowych, insuliny i różnego rodzaju białek. Z uwagi na fakt, że organizmy ludzi i zwierząt pozbawione są możliwości magazynowania cynku, objawy związane z niedoborem tego pierwiastka pojawiają się bardzo szybko. Płyn mózgowo-rdzeniowy jest bezbarwnym, przezroczystym płynem o składzie podobnym do składu osocza krwi. Wytwarzany jest w splotach naczyniówkowych i w wyściółce układu komorowego mózgu. Jego ilość wynosi około 140 ml, natomiast organizm produkuje ponad 500 ml płynu w ciągu doby, co oznacza jego czterokrotna wymianę w ciągu 24 godzin. Płyn krąży w mózgu i rdzeniu kręgowym i jest wchłaniany w układzie żylnym mózgowia. Jego podstawową funkcją jest transport związków chemicznych do mózgu oraz jego ochrona. Dzięki barierze krew-mózg stężenie pierwiastków w PMR jest stałe i powinno być niezależne od przyjmowanych leków, diety, jak również od stężenia pierwiastków w osoczu. Celem badań była przede wszystkim ocena przydatności metody TXRF do bezpośrednich pomiarów stężeń pierwiastków w płynach ustrojowych, co może być przydatne w procesie diagnostycznym. Praca była realizowana we współpracy z Kliniką Neurologii Collegium Medicum UJ (dr B. Tomik, dr D. Adamek). 7.2.2. Przedmiot badań Badane próbki płynu mózgowo rdzeniowego oraz osocza były pobierane podczas rutynowych badań neurologicznych (nakłucie lędźwiowe). Próbki pochodziły od osób ze zdiagnozowanym stwardnieniem bocznym zanikowym oraz od grupy kontrolnej. Osocze pobrano od 27 pacjentów chorych na ze zdiagnozowanym ALS i 17 z grupy kontrolnej. W grupie chorych było 14 kobiet i 13 mężczyzn, średni wiek wynosił 57± 8.9 lat a w grupie kontrolnej było 11 kobiet i 6 mężczyzn (średni wiek 54 ± 7.6 lat). Średni czas trwania choroby to 27 ± 3.2 miesięcy. Grupa kontrolna składała się z 9 pacjentów z negatywną diagnozą krwawienia podpajęczynówkowego, 5 guzem rdzenia kręgowego oraz 3 z polineuropatią. Płyn mózgowo-rdzeniowy pochodził od 25 osób ze zdiagnozowanym ALS i 35.

(36) 15 pacjentów z grupy kontrolnej. Z uwagi na fakt że pobieranie płynu mózgowordzeniowego nie należy do badań często wykonywanych, w tego typu badaniach za grupę kontrolną uważa się osoby chore na inne schorzenia neurologiczne. W grupie nie-ALS było 5 osób ze stwardnieniem rozsianym, 6 z dyskopatią, 3 z neuropatią i 1 z chorobą tkanki łącznej. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego od razu po pobraniu były zamrażane w naczyniach z polipropylenu. Rozmrażano je bezpośrednio przed przygotowaniem do pomiarów. Próbki nie były mineralizowane ze względu na potrzebę oznaczenia bromu i chloru, które zostałyby utlenione w czasie rozkładu do form lotnych, oraz z powodu niewielkich ilości dostępnych materiałów (poniżej 100 mikrolitrów), co wynikało z procedury pobierania płynu mózgowordzeniowego. Bezpośrednia analiza jest prostsza, szybsza i zapobiega ewentualnemu zanieczyszczeniu próbek w procesie preparatyki, aczkolwiek granice wykrywalności dla próbek mineralizowanych są niższe. Porównanie widm osocza zmineralizowanego i rozcieńczonego przedstawia rysunek 12.. 8000. rozcieńczenie mineralizacja liczba zliczeń. 6000. 4000. 2000. Cu Zn. Fe. 0 0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. energia [keV]. Rys.12 Porównanie widm osocza ludzkiego: próbki zmineralizowanej i rozcieńczanej wodą destylowaną. 36.

(37) 7.2.3. Pomiary i przygotowanie próbek Pomiary pierwiastków lekkich sodu i magnezu w płynie mózgowo- rdzeniowym i osoczu wykonano w Instytucie Atomowym w Wiedniu. Pierwiastki te były analizowane z zastosowaniem komory próżniowej, lampy rentgenowskiej z anoda chromową oraz detektora Si/Li z ultracienkim okienkiem. Warunki pomiarowe: 30kV/30mA, czas pomiaru wynosił 300s. Pomiary pozostałych pierwiastków wykonano na spektrometrze z lampa molibdenową w Krakowie. Warunki pomiarowe to 55kV, 40 mA. Czas pojedynczego pomiaru wynosił 1000 s. Ze względu na niewielkie ilości (poniżej 0,5 ml) obu płynów podjęto próbę analizy bezpośredniej z pominięciem procesu mineralizacji. Analiza bezpośrednia jest szybsza a w przypadku płynów o niskich stężeniach zapobiega ewentualnym zanieczyszczeniom lub stratom pierwiastków śladowych w trakcie przygotowania próbek, dodatkowo próbki nie ulegają rozcieńczeniu. Z drugiej strony obecność lekkich pierwiastków może wpływać niekorzystnie na kształt widma (podwyższone tło) ze względu na promieniowanie rozproszone.. Osocze Do 100 µl osocza dodawano 30µl wody dejonizowanej. Standardem wewnętrznym był gal w stężeniu końcowym 1mg/l. Płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR) Płyn mózgowo-rdzeniowy charakteryzuje się około dziesięciokrotnie niższymi zawartościami miedzi i cynku niż osocze, przy stosunkowo wysokim stężeniu chlorków. Z tego względu próbki nie były rozcieńczane, natomiast podjęto próbę uproszczonej mineralizacji dokonywanej bezpośrednio na szkiełku pomiarowym. Dodatek kropli (2 µl) kwasu azotowego klasy Suprapur rozcieńczonego wodą w stosunku 1:1 powodował eliminację dużej części chloru. Kwas azotowy jako silny utleniacz sprawiał, że większa część chloru obecnego w próbce ulegała utlenieniu do wolnego chloru i w tej postaci była usuwana w czasie suszenia. Preparatyka ta wpływała na poprawę kształtu widma i obniżenie granic wykrywalności. Standarem wewnętrznym był gal (1mg/dm3). Każdorazowe nakropienie było mierzone dwukrotnie – raz dla oznaczenia chloru, a następnie po jego usunięciu.. 37.

(38) Pierwiastki lekkie w płynie mózgowo- rdzeniowym i osoczu. Przed pomiarem próbki były jedynie rozcieńczane wodą podwójnie destylowaną (100 µl próbki + 40µl wody). Podobnie jak w przypadku PMR w czasie pomiarów w powietrzu z wysuszonej próbki usuwano chlor za pomocą kwasu azotowego. Standardem wewnętrznym był skand (40 mg/l). Dokładność analizy zweryfikowano za pomocą pomiaru materiału odniesienia – serum MIO 181 a wyniki pokazano w tabeli 2. Tabela 2. Wyniki analizy materiału odniesienia Serum Mio 181.. pierwiastek. Osocze SRM MIO 181. TXRF. certyfikowane stężenie i. Zmierzone stężenie , średnia. niepewność. i niepewność. [mg/l] K. 150; 146; 147;. 135 – 163. 140; 150; 145. 145,0 (2,4). Ca. 108; 103; 104;. 97 – 116. 112; 102; 124. 112,0 (5,0). Fe. 1.27; 1.25. 1.15 - 1.35. 1,35; 1,39; 1,28. Cu. 1.18; 1.22; 1.19. 1.09 - 1.29. 1,25; 1,18; 1,18. 1,203 (0,033). Zn. 1.33; 1.30;. 1.23 – 1.43. 1,31; 1,36; 1,31. 1,327 (0,013). 1,340 (0,045). W tabeli 3 przedstawiono granice wykrywalności dla płynu mózgowo- rdzeniowego mierzonego bezpośrednio oraz po zastosowaniu kwasu azotowego. Największy wpływ na polepszenie tego parametru zaobserwowano dla potasu (46%) i wapnia (45%) oraz około 30% dla miedzi i cynku. Poprawa granic wykrywalności ma miejsce przede wszystkim ze względu na redukcję tła spowodowaną niższą zawartością chloru. Na rysunku 13 przedstawiono widma płynu mózgowo-rdzeniowego mierzonego bezpośrednio oraz po zastosowaniu kwasu azotowego. Widoczne obniżenie tła spowodowane jest przede wszystkim niższym stężeniem chloru.. 38.

(39) Rys. 13. Porównanie widma osocza ludzkiego mierzonego bezpośrednio i po usunięciu chloru za pomocą kwasu azotowego.. Tabela 3. Granice wykrywalności oznaczanych pierwiastków w płynach ustrojowych – PMR i osoczu. Pierwiastek [mg/dm3]. Na. Mg. PMR bezpośrednio. K. Ca. Fe. Cu. Zn. 0,28. 0,20. 0.027. 0,023. 0,020. PMR/HNO3. 3,9*. 1,6*. 0,15. 0,11. 0,019. 0,016. 0,015. osocze/ TXRF. 21,7*. 5,5*. 1,7. 1,0. 0,21. 0,27. 0,23. * oznaczenie w próżni. 39.

(40) W tabelach 4 i 5 przedstawiono średnie wartości stężenia pierwiastków uzyskane dla osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego pobranych od osób chorych na ALS i grupy kontrolnej oraz wartości testu t. Tabela 4. Średnie stężenia pierwiastków w płynie mózgowo rdzeniowym u osób chorych na ALS i u grupy kontrolnej. Każdy wynik jest średnią z trzech pojedynczych oznaczeń.. pierwiastek. średnia ALS. Odch.. średnia. Odch.. Wartość. Wartość. standardowe. kontrola. standardowe. testu t. testu t. tablicowa. obliczona. .. Na [mg/ dm3]. 2100. 75. 2610. 126. 2,024. -3,683. 3. 12,8. 0,7. 15,1. 0,8. 2,024. -1,960. 3. 5360. 470. 6550. 940. 2,024. -1,272. K [mg/ dm ]. 3. 97. 6. 90. 7. 2,024. 0,825. Ca [mg/ dm3]. 41. 3. 46. 4. 2,024. -0,964. Fe [µg/ dm3]. 580. 30. 660. 40. 2,024. -1,408. Cu [µg/ dm3]. 58. 5. 78,5. 8. 2,024. -2,451. Zn [µg/ dm3]. 106. 6. 102. 10. 2,024. 0,338. Br [mg/ dm3]. 680. 50. 703. 80. 2,024. -0,188. Mg [mg/dm ] Cl [mg/ dm ]. 40.

(41) Tabela 5. Średnie stężenia pierwiastków w osoczu u osób chorych na ALS i u grupy kontrolnej. Każdy wynik jest średnią z trzech pojedynczych oznaczeń.. Pierwiastek. średnia. średnia. Odch.. ALS. standardowe. Odch.. kontrola standardowe. Wartość. Wartość. testu t. testu t. tablicowa. obliczona. Na [mg/l]. 1980. 100. 2020. 130. 2,018. -0,216. Mg [ppm]. 28. 1,5. 30. 2,4. 2,018. -0,751. Cl [ppm]. 4000. 100. 4500. 100. 2,018. -2,025. K [ppm]. 143. 6. 143. 5. 2,018. 0,002. Ca [ppm]. 90. 2,2. 87. 2. 2,018. 1,178. Cr [ppm]. 0,9. 0,03. 0,85. 0,07. 2,018. 0,735. Fe [ppm]. 4. 0,3. 4,9. 0,7. 2,018. -1,341. Cu [ppm]. 1,5. 0,07. 1,5. 0,08. 2,018. -0,570. Zn [ppm]. 1,1. 0,05. 1,3. 0,06. 2,018. -1,891. Br [ppm]. 2,6. 0,3. 2,4. 0,2. 2,018. 0,510. Żelazo w osoczu zostało prawidłowo oznaczone, o czym świadczą wyniki analizy materiału odniesienia. Jego podwyższona wartość w stosunku do normy wynika z zanieczyszczenia próbki osocza krwią.. 7.2.4. Podsumowanie Statystyczną istotność różnic w składzie pierwiastkowym PMR i osocza pomiędzy dwoma populacjami zbadano wykorzystując test t studenta. Uzyskane wyniki wykazały, że jedynie miedź jest pierwiastkiem, którego stężenie w PMR osób chorych na ALS jest istotnie różne niż w grupie kontrolnej. Prawdopodobnie jest to spowodowane niezbyt wielka ilością danych przebadanych pacjentów jednak zachorowania na ALS w Polsce są na tyle nieliczne, że trudno jest uzyskać materiał badawczy reprezentujący dużą populację chorych. Z drugiej strony badania te są czasochłonne i trudno by było przebadać wiele dziesiątków chorych. Przy interpretacji wyników należy również wziąć pod uwagę fakt ze osoby z grupy kontrolnej nie. 41.

(42) należą do osób zdrowych, a jedynie chorych na inne choroby neurologiczne niż stwardnienie boczne zanikowe. W grupie ALS stwierdzono, że stężenie miedzi w płynie mózgowo-rdzeniowym jest niższe niż stężenie u grupy kontrolnej, natomiast nie stwierdzono różnic pomiędzy grupami w zawartości miedzi, ani cynku w osoczu. Stwierdzono również nieco niższą zawartość sodu w grupie ALS. Reasumując, można wyciągnąć wnioski, że aczkolwiek metoda TXRF nadaje się do badań płynów ustrojowych, a szczególnie osocza, to w przypadku badań nad ALS trudno o wnioski dotyczące biochemii choroby. Prawdopodobnie, różnic należy szukać na poziomie zaburzeń komórkowym lub np. w zmianach stopni utlenienia poszczególnych pierwiastków, natomiast skład podstawowych płynów ustrojowych nie wnosi istotnych informacji. Różnic pomiędzy oboma populacjami nie znaleziono również po zastosowaniu analizy klastrowej. Opracowania sposobu przygotowaniu próbek zostało jednak wykorzystane do analizy płynów ustrojowych w innych zagadnieniach medycznych i biochemicznych.. 42.

(43) 7.3. Zastosowanie TXRF do badania składu pierwiastkowego roślin. Ocena wpływu mikoryzy na przyswajalność metali u roślin hałdowych. 7.3.1. Wprowadzenie. Wszystkie organizmy żywe posiadają zdolność do akumulacji jednych i odrzucania innych pierwiastków. Wiele pierwiastków (np. cynk, miedź, selen, chrom, mangan) w śladowych ilościach jest niezbędnych do prawidłowego metabolizmu, ale w wysokich stężeniach są one toksyczne Akumulacje metali musi więc być poddana ścisłej regulacji zarówno na poziomie komórek, jak i całego organizmu. Organizmy żywe muszą kontrolować pobór pierwiastków, ich dystrybucję oraz akumulację w różnych narządach. Dodatkowych mechanizmów kontrolnych wymaga fakt, że stężenia pierwiastków w różnych narządach mogą się znacząco od siebie różnić. Niedoskonałości systemu powodują, że organizmy akumulują również pierwiastki toksyczne, które nie pełnią żadnej fizjologicznej roli - przede wszystkim metale ciężkie takie jak ołów, rtęć czy kadm [68]. Metale ciężkie są powszechnie obecne w środowisku naturalnym, choć zazwyczaj ich mobilność i biodostępność są stosunkowo niskie. Zależą one przede wszystkim od pH gleby, zawartości wody oraz obecności substancji organicznych i mikroorganizmów. Postępujące w szybkim tempie zanieczyszczenie środowiska przyczynia się do wzrostu w glebie stężenia Cd, Pb, Hg, Tl, As, Zn i innych metali oraz zwiększenia ich mobilności i biodostępności. Dodatkowym problemem jest długotrwałe utrzymywanie się metalicznych zanieczyszczeń w środowisku. Wysokie stężenie ołowiu utrzymuje się przez około 150 lat po skażeniu, [69] biologiczny okres półtrwania kadmu wynosi około 18 lat [70], a w organizmie człowieka 10 lat [71]. Źródłem tych skażeń jest przemysł wydobywczy i metalurgiczny, odpady komunalne, środki stosowane w rolnictwie. Większość metali ciężkich jest toksyczna już w niskich stężeniach. Przyswajane przez rośliny stają się częścią łańcucha pokarmowego i dostają się do organizmów zwierząt i ludzi. Rośliny rosnące na glebach o wysokim stężeniu metali można podzielić na trzy grupy - tzw. rośliny wykluczające - stężenie metali w części korzeniowej jest wysokie, ale mechanizmy obronne zapobiegają przedostawaniu się nadmiaru metali do części nadziemnych - indykatory – rośliny akumulują metale w tkankach, a ich poziom odpowiada poziomowi stężeń metali w glebie. 43.

(44) - akumulatory i hiperakumulatory – przyswajają metale a poziom stężeń w roślinie może wielokrotnie przekraczać poziom metali w glebie. Za hiperakumulatory uważa się rośliny, u których poziom Ni, Co, Cu, Cr, Cd, As, Pb przekracza 0,1%, a Zn 1%w suchej masie. Zazwyczaj najwyższe stężenia toksycznych pierwiastków obserwuje się w korzeniach, liściach, następnie łodygach, a najniższe w nasionach [72]. Znaleziono około 400 roślin które posiadają tę zdolność. Uwaga wielu badaczy skupia się na nich ze względu na możliwość zastosowania ich w fitoremediacji terenów skażonych. Fitoremediacja terenów zdegradowanych biologicznie jest prowadzona w kierunku fitodegradacji, fitoekstrakcji bądź fitostabilizacji. W biodegradacji wykorzystuje się zdolność organizmów żywych do rozkładu substancji szkodliwych takich jak pestycydy czy węglowodory. aromatyczne. w. glebie.. Fitoekstrakcja. opiera. się. na. zdolności. hiperakumulatorów do gromadzenia niektórych metali. Fitostabilizacja umożliwia zaś zatrzymanie w glebie substancji toksycznych i zapobiega erozji i rozprzestrzenianiu pyłów o dużym stężeniu toksycznych pierwiastków [73]. Sukces każdej fitoremediacji zależy przede wszystkim od stopnia skażenia gleby, obecności w glebie składników odżywczych dla roślin (między innymi azotu i fosforu), obecności mikroorganizmów oraz grzybów mikoryzowych. Najłatwiejsze do oczyszczenia są gleby o homogenicznym i raczej powierzchniowym skażeniu i odpowiedniej jego biodostępności. Najbardziej korzystne pH gleby to 4-7. Pożądanym elementem jest również zdolność do retencji wody, co pozwala ograniczyć nawadnianie. Z kolei rośliny wybierane do zasiedlania takich terenów powinny mieć głęboko sięgający, rozgałęziony system korzeniowy, najlepiej z mikoryzą. W przypadku fitoekstrakcji współczynnik transportu z korzeni do pędów powinien być możliwie wysoki a roślina powinna mieć zdolność do akumulacji metali bez upośledzenia procesu wzrostu. We wszystkich jednak, wyżej wymienionych przypadkach rośliny są zmuszone do wegetacji w trudnych warunkach – brak wody, brak bakterii glebowych, wysokie stężenie toksycznych pierwiastków. Fitoekstrakcja jest często proponowana jako metoda oczyszczania terenów skażonych przy pomocy hiperakumulatorów. Poważnymi jednak mankamentami tego sposobu są: niska biomasa roślin i niewielka zdolność do akumulowania wielu pierwiastków równocześnie. Biorąc pod uwagę wszystkie wymienione czynniki można stwierdzić, że fitoekstrakcja jest trudna do wprowadzenia w życie gdyż nawet w najbardziej sprzyjających warunkach proces oczyszczania trwałby kilkaset lat. Dodatkowo należałoby rozwiązać problem składowania toksycznych roślin lub odzyskiwania z nich metali ciężkich poprzez rozkład lub spalanie w 44.

(45) sposób uniemożliwiający powtórne zanieczyszczenie środowiska [74,75]. Z drugiej strony rekultywacja. terenów. zielonych. prowadzona. jedynie. w. sposób. naturalny. jest. zjawiskiem długofalowym i mało efektywnym. Rośliny używane do zasiedlania terenów skażonych muszą być zdolne do adaptacji w warunkach stresowych. Z prowadzonych dotychczas badań wynika, że zdolność roślin do wegetacji w trudnych warunkach wspomagana jest zjawiskiem mikoryzy. Mikoryza polega na symbiozie miedzy żywymi komórkami korzeni, a wyspecjalizowanymi grzybami i występuje powszechnie w świecie roślin. Polski botanik Franciszek Kamieński (1851 –1912) odkrył mikoryzę w 1883 roku. Rozróżnia się dwa jej podstawowe rodzaje – ektomikoryzę oraz endomikoryzę. Ektomikoryza to mikoryza zewnętrzna, gdzie grzyby tworzą tzw. mufkę na powierzchni korzeni. Występuje ona zazwyczaj na korzeniach drzew strefy umiarkowanej. Z kolei endomikoryza polega na penetracji żywych komórek korzenia oraz przestrzeni międzykomórkowej korzeni przez szczepy grzybów. Do endomikoryzy zalicza się mikoryzę storczyków, mikoryzę roślin wrzosowatych (erykoidalną) i mikoryzę arbuskularną. Mikoryza arbuskularna występuje powszechnie u roślin zielnych od około 450 milionów lat. Grzybnia tworzy wewnątrz korzeni drzewkowate struktury tzw. arbuskule. Rysunek 14 przedstawia mikroskopowy obraz struktur arbuskularnych w strefie korzeniowej.. Rys. 14. Mikroskopowy obraz mikoryzy arbuskularnej. Widoczne drzewkowate struktury grzybni. 45.