Oznaczanie metali w surowicy krwi, włosach i paznokciach technikami plazmy sprzężonej indukcyjnie – ICP-OES i ICP-MS

Po procesie mineralizacji próbki zostały ochłodzone do temperatury pokojowej, a następnie odpędzano z naczyń nagromadzone tlenki azotu.

Uzyskane mineralizaty przenoszono ilościowo do kolbek miarowych o pojemności 25 ml i dopełniano do kreski wodą pochodzącą z procesu odwróconej osmozy. Próbki przechowywano w lodówce, w polietylenowych probówkach o pojemności 50 ml.

4.1.9.3. Oznaczanie metali w surowicy krwi, włosach i paznokciach technikami plazmy sprzężonej indukcyjnie – ICP-OES i ICP-MS

Ze względu na różne poziomy stężeń pierwiastków występujących w próbce, zastosowano dwie techniki oznaczania pierwiastków niezbędnych i toksycznych:

 Oznaczanie metali za pomocą spektrometru optycznego ze wzbudzeniem w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-OES)

Metodę tę wykorzystano do oznaczenia wapnia (Ca) i magnezu (Mg) przy długościach fali odpowiednio λCa, = 317,933 nm i λMg, = 285,213 nm.

Aparat automatycznie sprawdzał ustawienia plazmy dla stosowanych długości fal, do jej generacji użyto argonu o czystości 99,999%.

94

Tabela 4. Warunki analizy próbek biologicznych – ICP-OES

Parametry pracy spektrometru Charakterystyka

Rodzaj plazmy Argonowa

Typ nebulizera Meinharda

Komora mgielna Cyklonowa

Moc generatora plazmy

(ICP RF Power) ^{1300 W}

Sposób obserwacji plazmy Aksjalny

Przepływ gazu plazmowego (Plasma Gas Flow)

15 L min.^-1 Przepływ gazu rozpylającego

(Nebulizer Gas Flow)

0,8 L min.^-1 Przepływ gazu pomocniczego

(Auxiliary Gas Flow)

0,2 L min.^-1 Objętość dozowanej próbki

(Sample Uptake Rate) ^{0,5 mL}

Czas dozowania próbki

(Flush Delay) ^{8 s}

Ilość powtórzeń 3

Wykonanie krzywych kalibracyjnych:

- wykreślono w oparciu o roztwory kalibracyjne o stężeniach:  1 mg L^-1

 10 mg L^-1  20 mg L^-1.

Otrzymano je rozcieńczając odpowiednio standardowy roztwór ICP Multi-element Standard Solution VI, Merck o stężeniu 1000 mg mL^-1 za pomocą 1% kwasu azotowego(V).

Na Rycinach 21 i 22 przedstawiono przykładowe krzywe kalibracyjne dla magnezu i wapnia podawane przez program.

95

Rycina 22. Przykładowa krzywa kalibracyjna dla wapnia

Roztwór kontrolny o stężeniu 5 mg L-1, który otrzymano rozcieńczając roztwór standardowy Atomic Spectroscopy Standard, Multi-element ICP-MS Calibration Std 3, Perkin Elmer o stężeniu 10 mg mL-1

za pomocą 1% kwasu azotowego (V), służył do kontroli pracy aparatu.

W celu zapobiegnięcia procesowi kontaminacji próbek oraz wyeliminowania efektu pamięci, przez 30 sekund przemywano przewody dozujące próbkę po każdej analizie. Używano do tego 1% roztworu kwasu azotowego (V).

 Oznaczanie metali za pomocą spektrometrii mas ze wzbudzeniem w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-MS)

Analizę przeprowadzono dla pozostałych pierwiastków fizjologicznych oraz wybranych pierwiastków toksycznych. Wykonano pomiary dla następujących izotopów pierwiastków: manganu (⁵⁵Mn), żelaza (⁵⁷Fe), miedzi (⁶⁵Cu), cynku (⁶⁶Zn), chromu (⁵²Cr), kobaltu ( ⁵⁹Co), kadmu (¹¹¹Cd) i ołowiu (²⁰⁸Pb).

Plazma argonowa o temperaturze ok. 7000 K stanowiła źródło wzbudzenia w aparacie. Wytworzona została w generatorze typu „free running” 40 MHz z systemem PlasmaLok. Warunki analizy próbek przedstawione zostały w Tabeli 5.

96

Tabela 5. Warunki pomiarowe próbek biologicznych – ICP-MS

Parametry pracy spektrometru Charakterystyka

Rodzaj plazmy Argonowa

Moc generatora plazmy 1270 W

Analizator mas Kwadrupolowy

Przepływ gazu plazmowego (Plasma Gas Flow)

15 L min.^-1 Przepływ gazu rozpylającego

(Nebulizer Gas Flow)

0,99 L min.^-1 Przepływ gazu pomocniczego

(Auxiliary Gas Flow)

1,20 L min.^-1

Czas odczytu sygnału 20 s

Czas dozowania próbki

(Flush Delay) ^{10 s}

Ilość powtórzeń 3

Ilość odczytów 3

Tryb skanowania (Scan mode)

Dyskretne skanowanie dla wybranych mas (Peak hopping)

Liczba skanów 30

Detektor Dual (Pulsacyjny, analogowy)

Dynamiczna komora reakcyjna (DRC) została zastosowana jako dodatkowy moduł do

oznaczania chromu, w celu wyeliminowania jonów przeszkadzających.

W Tabeli 6 przedstawiono warunki pracy spektrometru.

Tabela 6. Warunki analizy próbek biologicznych – ICP DRC MS

Parametry pracy spektrometru Charakterystyka

Rodzaj plazmy Argonowa

Moc generatora plazmy 1310 W

Analizator mas Kwadrupolowy

Przepływ gazu plazmowego (Plasma Gas Flow)

15 L min.^-1 Przepływ gazu rozpylającego

(Nebulizer Gas Flow)

0,99 L min.^-1 Przepływ gazu pomocniczego

(Auxiliary Gas Flow)

1,20 L min.^-1

Czas odczytu sygnału 20 s

Czas dozowania próbki

(Flush Delay) ^{10 s}

Ilość powtórzeń 5

Ilość odczytów 3

Tryb skanowania (Scan mode)

Dyskretne skanowanie dla wybranych mas (Peak hopping)

Liczba skanów 20

Gaz reakcyjny Metan

Detektor Dual (Pulsacyjny, analogowy)

W celu sprawdzenia poprawności działania urządzenia i czułości metody, za każdym razem, przed rozpoczęciem pomiarów, przeprowadzono test aparatury. Posłużyła do tego analiza roztworu Smart Tune Solution Std ELAN & DRC-e, Niemcy, zawierającego w swoim składzie pierwiastki bar (Ba), beryl (Be), cer (Ce), kobalt (Co), ind (In), magnez (Mg), ołów (Pb), rod (Rh) i uran (U) o stężeniu 10 ppb każdy, w 1% kwasie azotowym (V).

97

Liczba zliczeń dla trzech pierwiastków: magnezu (Mg), indu (In) oraz uranu (U) oraz stosunek zliczeń dla podwójnie naładowanych jonów baru Ba2+

i tlenku ceru CeO stanowiły podstawę oceny czułości metody.

Normę stanowiły stosunki Ba2+/

Ba i CeO/Ce, które nie powinny przekraczać 3%. Prawidłowe wartości dla pierwiastków powinny wynosić: dla Mg>50000; In>250000, U>200000 zliczeń/10 ppb. Jeżeli wartości te nie zostały osiągnięte, przeprowadzano optymalizację układu. W pierwszej kolejności sprawdzano przepływ gazu pomocniczego i gazu w nebulizerze oraz moc generatora plazmy. Wyniki zapisywano za pomocą raportu dziennego z walidacji przyrządu pomiarowego (ang. Daily Performance Report).

W oparciu o roztwory kalibracyjne o stężeniach:  10 µg L^-1

 50 µg L^-1  100 µg L^-1  200 µg L-1

wykreślono krzywą kalibracyjną dla oznaczanych pierwiastków.

W tym celu dokonano rozcieńczenia roztworu standardowego Atomic Spectroscopy Standard, Multi-element ICP-MS Calibration Std 3, Perkin Elmer o stężeniu 10 mg mL^-1 za pomocą 1% kwasu azotowego (V).

Na Rycinie 23 przedstawiono przykładową krzywą kalibracyjną dla manganu podawaną przez program.

Rycina 23. Krzywa kalibracyjna – przykładowy wykres dla manganu

Wzorzec o stężeniu 50 µg L-1

otrzymany poprzez odpowiednie rozcieńczenie roztworu standardowego ICP Multielement Standard Solution VI, Merck o stężeniu 1000 mg mL^-1 za pomocą 1% kwasu azotowego (V), wykorzystano do kontroli pomiarów.

Krzywa kalibracyjna, wykonana w przypadku oznaczeń chromu (użycie komory reakcyjnej DRC), wykreślona została na podstawie roztworów kalibracyjnych o stężeniach:

 1 µg L^-1  10 µg L^-1

98

 20 µg L-1

.

Otrzymano je poprzez rozcieńczenie roztworu standardowego Atomic Spectroscopy Standard, Multi-Element ICP-MS Calibration Std 3, Perkin Elmer o stężeniu 10 mg mL^-1 za pomocą 1% kwasu azotowego (V).

Roztwór o stężeniu 10 µg L^-1, sporządzony poprzez odpowiednie rozcieńczenie roztworu standardowego ICP Multi-element Standard Solution VI, Merck o stężeniu 1000 mg mL-1 za pomocą 1% kwasu azotowego (V), został zastosowany jako roztwór kontrolny.

Przewody dozujące były przez kilkadziesiąt sekund przemywane za pomocą 1% roztworu kwasu azotowego (V) przed analizą każdej próbki.

W dokumencie Materiały alternatywne w ocenie zaburzeń poziomów metali niezbędnych i toksycznych u pacjentów z nowotworami głowy i szyi (Stron 93-98)